查娟民+林倩+李華善++何偉奇

[摘要] 目的 建立和優(yōu)化大腸癌患者腫瘤類器官培養(yǎng)體系，為研究阻斷Wnt信號(hào)治療大腸癌提供新模型。 方法 選擇大腸癌患者18例，收集癌組織及癌旁組織配對(duì)標(biāo)本。采用定量PCR測(cè)定癌組織和癌旁組織Wnt3 mRNA和腸干細(xì)胞標(biāo)記分子Lgr5、Ascl2的表達(dá)水平。術(shù)中采集腫瘤組織，使用類器官培養(yǎng)基培養(yǎng)腫瘤類器官。使用Wnt信號(hào)抑制劑IWP-2處理腫瘤類器官，觀察IWP-2對(duì)腫瘤類器官形態(tài)、生長(zhǎng)等的影響。 結(jié)果 定量PCR表明，與癌旁組織相比，腫瘤組織中的Wnt3表達(dá)水平較高[分別為（1.00±0.08）和（2.99±0.27），P<0.01]。癌旁組織和腫瘤組織Lgr5 [分別為（1.00±0.05）和（5.63±1.80），P<0.01）]、Ascl2[分別為（1.00±0.39）和（4.03±0.33），P<0.05]的表達(dá)水平也較高。IWP-2處理可顯著抑制腫瘤類器官生長(zhǎng)[未處理和處理后類器官面積分別為（10.02±1.34）×104 m2和（2.97±0.62）×104 m2，P<0.01]。 結(jié)論 Wnt信號(hào)通路激活和大腸癌發(fā)生密切相關(guān)，抑制Wnt信號(hào)可有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，可能是治療大腸癌的一種有效方法。腫瘤類器官可以作為篩選大腸癌治療藥物的一種模型。

[關(guān)鍵詞] 大腸癌；類器官；Wnt信號(hào)；抑制劑

[中圖分類號(hào)] R735.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）27-0005-04

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控腸上皮干細(xì)胞（intestinal stem cell，ISC）增殖和分化的關(guān)鍵信號(hào)[1，2]。結(jié)直腸腫瘤是目前常見的惡性腫瘤之一。腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cell，IEC）轉(zhuǎn)變?yōu)槟c癌細(xì)胞和一系列促癌因子的激活和抑癌因子失活密切相關(guān)。腸癌發(fā)生的促發(fā)大多由Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白APC和β-catenin的突變引起，此信號(hào)通路突變后導(dǎo)致β-catenin的穩(wěn)定和隨后的β-catenin/Tcf復(fù)合物的持續(xù)轉(zhuǎn)錄激活，激發(fā)了干細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腺瘤的發(fā)生[1，3，4]。Wnt信號(hào)通路的激活刺激腸干細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)腸干細(xì)胞增殖和癌變，是大腸癌發(fā)生的關(guān)鍵原因，也可能是有效治療大腸癌的靶點(diǎn)[5，6]。然而目前對(duì)大腸癌的研究多采用體外細(xì)胞系培養(yǎng)或者小鼠模型，缺乏原代培養(yǎng)的大腸癌模型。本研究檢測(cè)了癌組織和癌旁組織Wnt3和腸干細(xì)胞標(biāo)記分子Lgr5、Ascl2的表達(dá)水平，證實(shí)了腸癌組織中Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子Wnt3表達(dá)上升，提示腸癌組織中Wnt信號(hào)活化。干細(xì)胞標(biāo)記分子Lgr5和Ascl2表達(dá)上升。Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)了腸上皮細(xì)胞的增殖和癌變。本研究建立了結(jié)腸腫瘤患者結(jié)腸類器官（organoids）培養(yǎng)體系，將對(duì)大腸癌患者的腫瘤組織進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)，并且與患者組織高度相似。使用Wnt信號(hào)抑制劑IWP-2處理結(jié)腸腫瘤類器官，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)IWP-2可抑制大腸癌類器官的生長(zhǎng)。Wnt信號(hào)抑制劑有治療大腸癌的潛能。本研究利用大腸癌類器官，探討了阻斷Wnt信號(hào)通路治療結(jié)直腸腫瘤的可行性，大腸癌類器官可以作為一個(gè)研究大腸癌發(fā)生機(jī)制、篩選治療大腸癌藥物的模型，為今后推動(dòng)臨床預(yù)防和治療大腸癌提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院2015年1月～2016年1月收治的大腸癌患者18例，年齡30～78歲（中位數(shù)50歲）。收集癌組織和癌旁組織各18份。

1.2 患者組織中基因表達(dá)檢測(cè)

收集大腸癌患者癌組織和癌旁正常組織，使用TRIzol（Invitrogen）提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（iScriptTM cDNA Synthesis Kit，Bio-Rad，體系為5×iScript Reaction Mix，4 μl；iScript Reverse Transcriptase，1 μL； RNA template，1 μL；H2O，14 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：2×SYBR Green PCR Master Mix， 12.5 μL；引物，2.0 μL；cDNA template，1.0 μL；滅菌水，9.5 μL；共25 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)（Thermo Fisher，4309155）。采用GAPDH作為內(nèi)參和Comparative Delta-delta Ct法對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量。所用實(shí)時(shí)定量PCR儀為CFX96（Bio-rad），所用試劑SYBR Green Realtime PCR Master Mix購(gòu)自Toyobo。GAPDH，forward primer：5-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3，reverse primer：5-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3。Wnt3，forward primer： 5-CTC GCT GGC TAC CCA ATT TG-3，reverse primer：5-AGG CTG TCA TCT ATG GTG GTG-3。Lgr5，forward primer：5-CTC CCA GGT CTG GTG TGT TG-3，reverse primer：5- GAG GTC TAG GTA GGA GGT GAA G-3。Ascl2，forward primer：5-CCC TCC AGC AGC TCA AGT TA-3，reverse primer：5-GGC ACC AAC ACT TGG AGA TT-3。

1.3 大腸癌腫瘤組織的分離

對(duì)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院大腸癌患者，術(shù)中開腹后取1～2 cm腸段，投入含有青霉素和鏈霉素的PBS（不含Ca2+、Mg2+）緩沖液中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作?？v向切開腸管，經(jīng)過反復(fù)漂洗后，再橫向切成約1.0 cm×1.0 cm的小塊。組織黏膜層朝上，用大頭針固定在有機(jī)硅樹脂包被的培養(yǎng)皿上。加上4°C預(yù)冷Ca2+、Mg2+螯合溶液（含有2 mM EDTA的PBS），將整個(gè)培養(yǎng)皿置于冰上，搖動(dòng)30 min。將螯合溶液換成PBS之后，在體視鏡下，用手術(shù)鑷將黏膜層從黏膜下層和連接組織輕輕刮離。小心將分離出來的黏膜層移到50 mL離心管，150 g，4°C 離心5 min，棄上清后用5 mL PBS重懸，輕輕吹打幾次。取20 μL溶液到載玻片上，在顯微鏡下觀察計(jì)算個(gè)數(shù)。

1.4 大腸癌腫瘤類器官立體培養(yǎng)

將含有大腸癌組織的溶液150 g，4°C 離心10 min，棄上清，再用基質(zhì)膠（Matrigel，Basement Membrane Matrix）重懸[（200～500）個(gè)小組織塊/50 μL Matrigel）]。將含有腫瘤組織的Matrigel滴于未加培養(yǎng)基的空白24孔板正中間，每孔50 μL。將24孔板放入37°C培養(yǎng)箱中。30 min后等Matrigel聚合成固態(tài)（Matrigel 4℃時(shí)為液態(tài)，室溫下發(fā)生聚合而轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)），取出，加入含有多種生長(zhǎng)因子的人類器官培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成：Advanced DMEM/F12，加入2 mM glutamine，10 mM HEPES，100 U/mL penicillin，100 g/mL streptomycin，2.5 μg/mL Fungizone，1×N2 supplement，1×B27 supplement。使用前添加：100 ng/mL Wnt3a，250 ng/mL R-spondin 1，100 ng/mL Noggin，50 ng/mL EGF，500 nM A-83-01，10 μM SB202190，10 nM[Leu]15-Gastrin 1， 1 mM N-Acetylcysteine 和10 mM Nicotinamide）。Matrigel購(gòu)自BD Biosciences，培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen，生長(zhǎng)因子購(gòu)自PeproTech和R & D。

每2～3 d換液，大約1周后進(jìn)行傳代。傳代時(shí)將培養(yǎng)板置于生物安全柜中冰盒上，吸去培養(yǎng)基。加入1 mL含預(yù)冷的PBS，反復(fù)吹打直至肉眼看不見塊狀膠體。轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，150G 離心5 min，棄上清。將細(xì)胞團(tuán)用Matrigel重懸后，加到新的24孔培養(yǎng)板中。待Matrigel固化后，加入類器官培養(yǎng)基。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，對(duì)定量PCR數(shù)值進(jìn)行t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大腸癌腫瘤組織中Wnt3和腸干細(xì)胞因子Lgr5、Ascl2的表達(dá)

定量PCR結(jié)果表明，與癌旁組織相比，腫瘤組織Wnt3表達(dá)水平較高[分別為（1.00±0.08）和（2.99±0.27），P<0.01；圖1A]，腸干細(xì)胞因子Lgr5[分別為（1.00±0.05）和（5.63±1.80），P<0.01；圖1B] 和Ascl2[分別為（1.00±0.39）和（4.03±0.33），P<0.05；圖1C]的表達(dá)水平也較高。

2.2 大腸癌腫瘤類器官的培養(yǎng)

大腸癌組織經(jīng)分離后在Matrigel中立體培養(yǎng)，第2天可見球形細(xì)胞團(tuán)。3～4 d后迅速長(zhǎng)大。Matrigel給予培養(yǎng)類器官空間支撐，使其能夠立體生長(zhǎng)（圖2A）。

2.3 Wnt信號(hào)抑制劑IWP-2處理抑制結(jié)腸腫瘤類器官生長(zhǎng)

Wnt信號(hào)通路抑制劑IWP-2處理可顯著抑制腫瘤類器官生長(zhǎng)[未處理的類器官面積：（10.02±1.34）× 104 m2；處理后的類器官面積：（2.97±0.62）×104 m2，P< 0.01）]。見圖2B。

3 討論

腸道的內(nèi)壁是一層連續(xù)的腸上皮細(xì)胞。腸干細(xì)胞表達(dá)Wnt富含亮氨酸拉鏈的G蛋白偶聯(lián)受體5（leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5，Lgr5），分布在隱窩底部，與潘氏細(xì)胞交錯(cuò)排列，處于快速增殖狀態(tài)，產(chǎn)生的子細(xì)胞可分化為各種特異的上皮細(xì)胞[7-9]。分化后的腸上皮細(xì)胞沿著隱窩-絨毛軸向上遷移。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控腸上皮干細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵信號(hào)[1，4]。

在正常腸上皮細(xì)胞中，分泌性的frizzled相關(guān)蛋白（ssecreted frizzled-related proteins，SFRP）與Wnt競(jìng)爭(zhēng)性地同Wnt受體Frizzled結(jié)合，從而拮抗Wnt信號(hào)[9]。當(dāng)Wnt信號(hào)失活，腺瘤息肉病基因（adenomatous polyposis coli，APC）復(fù)合物磷酸化β-catenin，導(dǎo)致β-catenin降解，阻止了β-catenin的核內(nèi)聚集，從而不能激活轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor 4，Tcf4）[1]。

Fearon和Vogelstein于1990年提出腸癌發(fā)生的經(jīng)典分子模型。大部分腸癌來自于原先存在的腺瘤的惡變[10]。腸癌發(fā)生的促發(fā)大多由Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白APC和β-catenin的突變引起，此信號(hào)通路突變后導(dǎo)致β-catenin的穩(wěn)定和隨后的β-catenin/Tcf復(fù)合物的持續(xù)轉(zhuǎn)錄激活，激發(fā)了干細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腺瘤的發(fā)生[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)和正常腸上皮組織相比，大腸癌腫瘤組織中Wnt信號(hào)相關(guān)分子Wnt3表達(dá)上升，提示腸癌組織中Wnt信號(hào)活化。干細(xì)胞標(biāo)記分子Lgr5和Ascl2表達(dá)上升，證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)了腸上皮細(xì)胞的增殖和去分化，可能和腸上皮的癌變相關(guān)。因此，抑制Wnt信號(hào)具有治療大腸癌的潛能。

作為一種成體干細(xì)胞，腸干細(xì)胞具有自我更新與分化潛能，因此可以將其分離出體內(nèi)并進(jìn)行體外立體培養(yǎng)，模擬發(fā)育和疾病過程，并用于進(jìn)一步的科學(xué)研究。近年來新建立起一種腸上皮細(xì)胞體外立體培養(yǎng)方法[12-14]，采用這種培養(yǎng)方式，分離出來的腸上皮干細(xì)胞，可在體外生長(zhǎng)形成類似于絨毛-隱窩單元的類器官（organoids）。組成Organoid培養(yǎng)體系的關(guān)鍵因素包括：（1）富含層粘連蛋白的Matrigel。（2）培養(yǎng)基中的信號(hào)分子組合。包括與表皮細(xì)胞增殖密切相關(guān)的表皮生長(zhǎng)因子（EGF）；Wnt信號(hào)激動(dòng)劑R-spondin；BMP信號(hào)抑制子Noggin。這三種信號(hào)分子共同營(yíng)造的環(huán)境與體內(nèi)腸隱窩中的情況十分相似[12]。

大腸癌嚴(yán)重威脅著人類健康，其發(fā)生主要是因?yàn)槟c道上皮細(xì)胞的功能異常。與細(xì)胞系相比，大腸癌類器官體外立體培養(yǎng)更接近人體內(nèi)的真實(shí)情況。另外，體外培養(yǎng)體系相對(duì)簡(jiǎn)單可控，周期短，可大大加速相關(guān)研究的進(jìn)展。本研究成功建立了大腸癌類器官培養(yǎng)體系。這一培養(yǎng)體系的建立對(duì)腸道干細(xì)胞和大腸癌研究的推動(dòng)作用不言而喻。

使用Wnt信號(hào)抑制劑IWP-2[15，16]，處理結(jié)腸腫瘤類器官，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)IWP-2可抑制大腸癌類器官的生長(zhǎng)。由于抑制Wnt信號(hào)通路具有治療結(jié)腸癌的潛能。本研究還嘗試用Wnt信號(hào)抑制劑IWP-2處理結(jié)腸腫瘤類器官，本研究發(fā)現(xiàn)IWP-2可抑制大腸癌類器官的生長(zhǎng)。本研究還設(shè)想通過大腸癌類器官培養(yǎng)體系為基礎(chǔ)，高效篩選鑒別Wnt信號(hào)通路的小分子抑制劑，為研究大腸癌的發(fā)生機(jī)制、推動(dòng)臨床預(yù)防和治療大腸癌提供證據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Clevers H，Loh KM，Nusse R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration：Wnt signaling and stem cell control[J]. Science，2014，346（6205）：1248012.

[2] Miyoshi H，Stappenbeck TS. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture[J]. Nat Protoc，2013，8（12）：2471-2482.

[3] Harada N，Tamai Y，Ishikawa T，et al. Intestinal polyposis in mice with a dominant stable mutation of the beta-catenin gene[J]. EMBO J，1999，18（21）：5931-5942.

[4] Schuijers J，Mokry M，Hatzis P，et al. Wnt-induced transcriptional activation is exclusively mediated by TCF/LEF[J]. EMBO J，2014，33（2）：146-156.

[5] Peters U，Jiao S，Schumacher FR，et al. Identification of genetic susceptibility loci for colorectal tumors in a genome-wide meta-analysis[J]. Gastroenterology，2013， 144（4）：799-807.

[6] Zeki SS，Graham TA，Wright NA. Stem cells and their implications for colorectal cancer[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2011，8（2）：90-100.

[7] de Lau W， Peng WC， Gros P， et al. The R-spondin/Lgr5/Rnf43 module：Regulator of Wnt signal strength[J]. Genes Dev，2014，28（4）：305-316.

[8] Koo BK，Clevers H. Stem cells marked by the R-spondin receptor LGR5[J]. Gastroenterology，2014，147（2）：289-302.

[9] Novellasdemunt L，Antas P，Li VS. Targeting Wnt signaling in colorectal cancer. A review in the theme：Cell signaling：Proteins，pathways and mechanisms[J]. Am J Physiol Cell Physiol，2015，309（8）：C511-521.

[10] Fearon ER，Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis[J]. Cell，1990， 61（5）：759-767.

[11] Schwitalla S，F(xiàn)ingerle AA，Cammareri P，et al. Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties[J]. Cell，2013，152（1-2）：25-38.

[12] Sato T，Vries RG，Snippert HJ，et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche[J]. Nature，2009，459（7244）：262-265.

[13] Sato T，Stange DE，F(xiàn)errante M，et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon，adenoma，adenocarcinoma，and Barretts epithelium[J]. Gastroenterology，2011，141（5）：1762-1772.

[14] Clevers H. Modeling development and disease with organoids[J]. Cell，2016，165（7）：1586-1597.

[15] Chen B，Dodge ME，Tang W，et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer[J]. Nat Chem Biol，2009，5（2）：100-107.

[16] Yin X，F(xiàn)arin HF，van Es JH，et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny[J]. Nat Methods，2014，11（1）：106-112.

（收稿日期：2016-04-26）