孫會(huì)會(huì)，仲建軍,*，翟晚?xiàng)?/p>

(1.德州市公安局物證鑒定研究中心, 山東 德州 253000; 2.公安部物證鑒定中心，北京 100038)

LC-MS/MS測(cè)定血液中利眠寧成分

孫會(huì)會(huì)1，仲建軍1,*，翟晚?xiàng)?

(1.德州市公安局物證鑒定研究中心, 山東 德州 253000; 2.公安部物證鑒定中心，北京 100038)

目的 建立一種液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法對(duì)血液中利眠寧成分進(jìn)行定性定量分析。方法采用LC-MS/MS的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，通過(guò)利眠寧的保留時(shí)間和兩對(duì)母離子/子離子對(duì)進(jìn)行分析。前處理利用乙腈作為沉淀劑，沉淀血液中的蛋白，振蕩離心后，過(guò)有機(jī)微孔濾膜，上清液通過(guò)LC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 通過(guò)該方法測(cè)定，血液中利眠寧成分在0.5～200 ng/mL濃度范圍內(nèi)具有良好線性，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9987。該方法最低檢出限0.1 ng/mL，日內(nèi)精密度在3 %以下，日間精密度在4 %以下，重現(xiàn)性好，回收率高。結(jié)論 采用該方法檢測(cè)血液中的利眠寧成分，快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，能夠滿足公安機(jī)關(guān)偵破利用利眠寧殺人、搶劫、強(qiáng)奸等案件的檢驗(yàn)要求。

液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜；血液；利眠寧

利眠寧（Chlordiazepoxide），又稱為氯氮卓、甲氨二氮卓、7-氯-2-甲氨基-5-苯基-3H-1、4-苯并二氮雜卓-4-氧化物，屬于苯二氮卓類藥物（Benzodiazepines, BZD）。利眠寧在臨床醫(yī)學(xué)中常用于治療失眠、焦慮等，主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

近幾年，利用安眠鎮(zhèn)靜類藥物實(shí)施的案件數(shù)量不斷上升，比如利用該類藥物進(jìn)行搶劫、殺人、強(qiáng)奸等，引起了公安部門的高度重視。國(guó)內(nèi)目前報(bào)道的利眠寧檢測(cè)方法中，有的利用利眠寧中含有甲氨基，作為電子給予體與電子接受體在一定pH的緩沖鹽條件下反應(yīng)，生成一種穩(wěn)定的配合物，利用這種配合物在紫外-可見(jiàn)光范圍內(nèi)的吸收測(cè)定利眠寧的含量[1-2]；有的利用紅外光譜分析利眠寧的結(jié)構(gòu)，通過(guò)分析利眠寧在紅外光譜上的吸收，對(duì)其進(jìn)行定性[3]；有的利用利眠寧的化學(xué)修飾電極、極譜法來(lái)對(duì)利眠寧含量進(jìn)行分析[4-5]。在色譜質(zhì)譜方法方面，近年有研究利用快速溶劑萃取[6]、表面經(jīng)過(guò)修飾的磁性納米材料作為吸附劑[7]對(duì)生物檢材中的安眠鎮(zhèn)靜類藥物進(jìn)行萃取濃縮后，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析，但目前尚無(wú)采用液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道。相關(guān)文獻(xiàn)中僅有利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)篩選分析血液中苯二氮卓類、吩噻嗪類安眠鎮(zhèn)靜藥物[8]，以及同時(shí)分析血液中5種巴比妥類藥物[9]等研究。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法具有靈敏度高、分離效率高、前處理簡(jiǎn)便、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，適合用于進(jìn)行利眠寧的分析檢測(cè)。本研究采用島津LC-20AD高效液相色譜儀與AB Sciex QTrap 3200四級(jí)桿-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀聯(lián)用，采取多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式建立了對(duì)血液中利眠寧成分進(jìn)行定性、定量分析的方法。該方法分析時(shí)間短，重現(xiàn)性好，靈敏度和回收率高，適于血液中利眠寧的檢測(cè)，能夠滿足實(shí)際辦案需要。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB Sciex QTrap 3200串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司）；BSA-323S型電子天平（德國(guó)賽多利斯）；移液槍（上海華運(yùn)分析儀器有限公司）；TGL-16C離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；VORTEX-GENIE2渦輪振蕩器（美國(guó)Scientifi c Industries）；0.22μm有機(jī)微孔濾膜（上海富達(dá)醫(yī)用塑料有限公司）；容量瓶（北京博美玻璃有限公司）。高純水；乙腈、甲醇（色譜純，美國(guó) Fisher公司）；利眠寧標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自公安部物證鑒定中心，純度大于99.1 %。將利眠寧標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成1.0 μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，備用。

1.2 色譜條件

Phenomenex C18（50 mm×2 mm, 2.5 μm）液相色譜柱，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量1 μL，流速0.5 mL/min，流動(dòng)相采用梯度洗脫，所用溶液為高純水（A相）-乙腈（B相），見(jiàn)表1。

1.3 質(zhì)譜條件

AB Sciex QTrap 3200三重四級(jí)桿離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀，采用電噴霧離子化模式（electrospray ionization, ESI），選擇正離子掃描，采用MRM作為檢測(cè)方法，離子噴射電壓IS為+5500 V，碰撞氣氮?dú)馀鲎不罨怆x模式設(shè)定為Medium；氣簾氣為20 psi，離子源氣Gas1為15 psi，離子源氣Gas2為15 psi，離子源溫度為500 ℃。

對(duì)利眠寧通過(guò)Q1 MS得到一級(jí)質(zhì)譜，該物質(zhì)的母離子300.1；Production（MS2）得到二級(jí)質(zhì)譜，子離子227.2和282.1；在MRM模式下，兩對(duì)離子對(duì)的去簇電壓（declustering potential, DP）為36 V，300.1/227.2離子對(duì)的碰撞能量（collision energy, CE）為29 V，300.1/282.1離子對(duì)CE為27 V。

1.4 樣品前處理

取1mL待測(cè)血液于試管中，加入3 mL乙腈作為沉淀劑，振蕩離心20 min，取出上清液，過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，備檢。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

選擇型號(hào)為Synergi 2.5u Fusion-RP 100A的色譜柱A和型號(hào)為Synergi 4u Fusion-RP 80A的色譜柱B進(jìn)行比較研究，其中色譜柱A和B的粒徑分別為2.5 μ m和4.0 μ m。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1和表2所示，采用相同流動(dòng)相和梯度程序、相同質(zhì)譜條件分析同一樣品，色譜柱A出峰快、響應(yīng)強(qiáng)，與色譜柱B的峰展寬無(wú)明顯差異，更適合于利眠寧的分析檢驗(yàn)。

圖1 相同條件下色譜柱A和色譜柱B分別分析利眠寧的MRM色譜疊加圖Fig.1 The overlaid MRM chromatogram of chlordiazepoxide by columns of A and B under the same experimental conditions

表2 相同條件下色譜柱A和色譜柱B分別分析利眠寧的峰參數(shù)Table 2 Peak parameters of chlordiazepoxide by columns of A and B under the same experimental conditions

2.2 定性與定量離子對(duì)的選擇

選取準(zhǔn)分子離子峰m/z 300.1作為母離子，選擇質(zhì)荷比較大、強(qiáng)度較穩(wěn)定的m/z 282.1、m/z 227.2兩個(gè)碎片作為子離子組成定性離子對(duì)300.1/227.2和300.1/282.1，將兩對(duì)離子對(duì)的去簇電壓DP和碰撞能量CE進(jìn)行優(yōu)化以得到最佳的相應(yīng)強(qiáng)度，參數(shù)優(yōu)化后的子離子掃描圖見(jiàn)圖2。由于300.1/282.1的響應(yīng)強(qiáng)度更高，選擇該對(duì)離子對(duì)作為利眠寧的定量離子對(duì)。

圖2 利眠寧的子離子掃描圖Fig.2 The image of scanning the product ion of chlordiazepoxide

2.3 流動(dòng)相及其流速的選擇

相比較甲醇-高純水而言，選擇乙腈-高純水作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在較短的分析時(shí)間內(nèi)能達(dá)到較好的分離效果，而且實(shí)驗(yàn)中選擇了乙腈作為沉淀劑，所以綜合以上，實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-高純水作為流動(dòng)相。

實(shí)驗(yàn)中采用單因素實(shí)驗(yàn)的方式對(duì)有機(jī)相初始濃度和梯度陡度即梯度洗脫斜率進(jìn)行考察，比較了有機(jī)相濃度分別為20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %的等度洗脫程序和以20 %為有機(jī)相初始濃度并保持1 min后，分別以10 %、20 %、30 %的梯度陡度進(jìn)行洗脫的梯度洗脫程序，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示?？梢钥闯?，有機(jī)相濃度升高或梯度陡度增加時(shí)，保留時(shí)間縮短，質(zhì)譜響應(yīng)增加，峰寬減少；采用梯度洗脫時(shí)目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)明顯高于采用相同初始濃度的等度洗脫?？紤]到保留時(shí)間過(guò)短不利于目標(biāo)物與體內(nèi)檢材中復(fù)雜組分的分離，選擇以20 %為初始濃度、20 %/min為梯度陡度的洗脫程序。另外綜合考慮高效液相色譜柱所能承受的最大壓力以及分析時(shí)間，將流動(dòng)相的流速設(shè)置為0.5 mL/min。

表3 不同的洗脫程序及與之對(duì)應(yīng)的峰參數(shù)Table 3 Results of different gradient procedures and corresponding peak parameters

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和方法檢出限

以300.1/282.1作為利眠寧定量分析的離子對(duì)。在空白血中依次添加不同濃度的利眠寧標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行定量分析，作利眠寧在一定濃度范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實(shí)驗(yàn)條件下利眠寧在0.5～200 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性，線性方程：y=1873.5x+213.1（其中x表示利眠寧的進(jìn)樣濃度，y表示峰面積），相關(guān)系數(shù)r=0.9987（見(jiàn)圖3）。根據(jù)S/N≥3測(cè)定這種方法的最低檢出限（limit of detection, LOD），測(cè)得利眠寧的LOD是0.1 ng/mL。

圖3 利眠寧的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.3 The standard working curve of chlordiazepoxide

2.5 精密度與回收率

在空白血液中分別加入利眠寧的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度分別為0.5、10.0、50.0 ng/mL的樣品溶液，對(duì)每種濃度的樣品平行進(jìn)樣6次，連續(xù)分析6日，計(jì)算利眠寧的日內(nèi)精密度和日間精密度。

在空白血液中分別加入利眠寧標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度分別為0.5、10.0、50.0 ng/mL的樣品溶液，對(duì)每種濃度平行分析3次，測(cè)定回收率。結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)方法具有良好的重現(xiàn)性和較高的回收率（表4）。

表4 血液中利眠寧精密度和回收率測(cè)定Table 4 RSDs and average recoveries of chlordiazepoxide in blood sample

2.6 案例應(yīng)用

2015年1月，本市某縣公安局送檢一起搶劫?gòu)?qiáng)奸案件中被害人的血液，要求進(jìn)行毒物成分定性定量分析，利用本實(shí)驗(yàn)建立的測(cè)定血液中利眠寧的方法對(duì)檢材血進(jìn)行分析，檢驗(yàn)結(jié)果顯示，檢材血中檢出利眠寧成分，含量為37 ng/mL，譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 利眠寧的MRM色譜圖Fig.4 The MRM chromatogram of chlordiazepoxide

3 結(jié)語(yǔ)

紫外-分光光度法測(cè)定利眠寧成分，檢材多是制劑，該方法前處理對(duì)于絡(luò)合劑、緩沖液的濃度、反應(yīng)時(shí)間和溫度都有要求，檢測(cè)的線性范圍窄，檢材中的某些雜質(zhì)在紫外-可見(jiàn)中會(huì)有吸收，干擾檢測(cè)；紅外光譜屬于振動(dòng)光譜，通過(guò)譜圖的解析可以獲得分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但是紅外光譜靈敏度低，對(duì)樣品的純度要求高，雜質(zhì)會(huì)使紅外光譜圖復(fù)雜化而干擾鑒定；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)生物檢材中的鎮(zhèn)靜安眠類藥物，前處理繁瑣，對(duì)于某些難以氣化的目標(biāo)物需要衍生化。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了液相色譜儀有效分離高沸點(diǎn)化合物、熱不穩(wěn)定性化合物能力與質(zhì)譜儀高鑒別能力，是分析復(fù)雜有機(jī)混合物的有效手段。本文采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)血液中利眠寧成分進(jìn)行分析，提高了檢測(cè)的專一性和靈敏度，降低了雜質(zhì)干擾，定性、定量準(zhǔn)確，方法前處理簡(jiǎn)單，使用有機(jī)溶劑少，無(wú)需進(jìn)行衍生化處理，方法檢出限低，重現(xiàn)性好，回收率高，為公安部門偵破利用利眠寧作案的案件提供了重要的技術(shù)支持。

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Determination of Chlordiazepoxide in Blood Sample by LC-MS/MS

SUN Huihui1, ZHONG Jianjun1,*, ZHAI Wanfeng2
(1. Center of Material Evidence Authentication and Research, Dezhou Public Security Bureau, Shandong, Dezhou 253000, China;
2. Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China)

Objective To develop and validate a sensitive, specifi c and rapid method for determining the chlordiazepoxide in blood sample by liquid chromatography-quadrupole ion trap mass spectrometry (LC-MS/MS). Methods Chlordiazepoxide was qualitatively analyzed by its retention time and two ion pairs of precursor/product in multiple reaction monitoring (MRM) mode. The blood sample was precipitated with acetonitrile, and then oscillated and centrifugalized. After fi ltration with organic membrane, the supernatant was analyzed by LC-MS/MS. Results With the optimized method, the correlation coeffi cient of chlordiazepoxide was 0.9987 within the linear range of 0.5～200ng/mL. The limit of detection (LOD) for chlordiazepoxide in blood was 0.1ng/mL. The intra- and inter-day relative standard deviations (RSDs) were below 3% and 4%, respectively. The results of recovery met the acceptance criteria. Conclusion This method was simple, rapid, reliable and highly accurate for analysis of chlordiazepoxide in blood, suitable for chlordiazepoxide-invloved cases of murder, robbery and rape.

LC-MS/MS; blood; chlordiazepoxide

DF795.1

A

1008-3650(2016)05-0376-04

2015-12-30

格式：孫會(huì)會(huì)，仲建軍，翟晚?xiàng)? LC-MS/MS測(cè)定血液中利眠寧成分[J]. 刑事技術(shù)，2016,41(5):376-379.

10.16467/j.1008-3650.2016.05.0 07

孫會(huì)會(huì)（1987—），女，山東臨沂人，碩士，助理工程師，研究方向?yàn)槎疚铩⒍酒窓z驗(yàn)。E-mail: shqcome@163.com

* 通訊作者：仲建軍（1975—），男，山東德州人，學(xué)士，主檢法醫(yī)師，研究方向?yàn)榉ㄡt(yī)毒理學(xué)。E-mail: dezhoudna@126.com