蔡周山，李建新，李岳燦，許國軍，黨武吉，梅麗娜

(涼州區(qū)畜牧獸醫(yī)局，甘肅 涼州 733000)

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以西雜母牛為受體采取胚胎移植技術(shù)繁育良種奶牛的應(yīng)用研究

蔡周山，李建新，李岳燦，許國軍，黨武吉，梅麗娜

(涼州區(qū)畜牧獸醫(yī)局，甘肅 涼州 733000)

【目的】為尋求高產(chǎn)奶牛的繁殖模式，促進胚胎移植技術(shù)在奶業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用?！痉椒ā课覀冊谌珔^(qū)27個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，在農(nóng)戶條件下應(yīng)用性控胚胎以西雜母牛為受體，共移植高產(chǎn)奶牛冷凍胚胎1796頭?！窘Y(jié)果】妊娠971頭，平均妊娠率54.06%，繁活犢牛952頭，生母率96.42%。春、秋季的受胎率較高，最高達到55.09%，高于夏季7、8月份最低的52.69%，但差異不顯著(\%P>\%0.05)。西雜牛不同黃體級別的A、B級的移植結(jié)果A級受胎率為0.558%；B級受胎率為52%。A級黃體與B級移植的受胎率差異不顯著(\%P>\%0.05)。【結(jié)論】說明采取這一模式進行兩種奶牛繁殖是切實可行的，具有推廣應(yīng)用價值。

西雜母牛；胚胎移植；懷期受胎率；體重；初配月齡

涼州區(qū)位于河西走廊東端，祁連山北鹿沖積洪積平原，農(nóng)戶素有養(yǎng)殖母牛的習(xí)慣，以西門塔爾牛為主的黃牛改良工作在本區(qū)已開展了30多年，西雜母牛群體規(guī)模已達到14.6萬頭。目前，涼州區(qū)的西雜母牛具有體質(zhì)結(jié)實，體態(tài)勻稱，耐粗飼，飼養(yǎng)成本低，繁殖性能高、難產(chǎn)率低的優(yōu)點，以西雜母牛為受體采用胚胎移植技術(shù)快速擴繁高產(chǎn)奶牛具有天然優(yōu)勢。為此，我們與美加農(nóng)生物科技有限公司合作，在全區(qū)二十七個鄉(xiāng)鎮(zhèn)以自然發(fā)情的西雜繁殖母牛為受體，利用冷凍高產(chǎn)奶牛性控胚胎開展胚胎移植，旨在通過實踐，探討創(chuàng)新高產(chǎn)奶牛的繁殖模式，促進胚胎移植技術(shù)在奶業(yè)生產(chǎn)上的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

1 移植材料與方法

1.1 移植材料

1.1.1 受體牛選擇年齡2～5歲、體重350 kg以上、健康無病、符合受體牛條件的經(jīng)產(chǎn)西門塔爾雜種母牛。

1.1.2 冷凍性控胚胎由美加農(nóng)生物科技術(shù)有限公司引進提供。選用遺傳潛力近10000kg的母牛采集卵子，卵子體外培養(yǎng)成熟，應(yīng)用性別控制精液，精子獲能與卵子體外受精發(fā)育而成的7日齡冷凍胚胎。胚胎解凍后復(fù)蘇率在98%以上，母犢率在96%～98%。

1.1.3 移植材料和器械:2%利多卡因，12%靜松靈，孕激素(黃體酮)，高錳酸鉀，純凈水，75%酒精棉球，碘酊棉球，5 ml一次性注射器，移植槍，一次性塑料長臂手套，塑料硬外套，近無菌軟外套，剪毛刀，衛(wèi)生紙，保定架。

1.2 移植方法

1.2.1 受體牛的選定 選擇的受體牛采取直腸檢查的方法復(fù)選，對子宮有炎癥、形態(tài)異常、卵巢囊腫、持久黃體和有流產(chǎn)史的予以淘汰，最后選定移植戶和受體牛。對受體牛養(yǎng)殖戶進行養(yǎng)殖培訓(xùn)，要求受體牛養(yǎng)殖農(nóng)戶按照《受體牛養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范》進行飼喂，同時與農(nóng)戶簽定胚胎牛移植協(xié)議。根據(jù)基礎(chǔ)母牛各自的不同情況，由分片配種員到農(nóng)戶家中進行防疫、驅(qū)蟲，飼養(yǎng)指導(dǎo)，農(nóng)戶觀察到牛有發(fā)情征兆，及時電話通知配種員，配種員通知胚胎供應(yīng)站。確定發(fā)情后第18天進行直腸檢查，對不符合移植條件的再次進行淘汰，最后確定使用冷凍胚胎移植的受體牛，并對受體牛進行耳標標記，登記備案。

1.2.2 子宮、卵巢的檢查及黃體等級的判定 用直腸檢查法依次檢查子宮頸、左右兩側(cè)子宮角、卵巢的發(fā)育情況，對符合條件的受體牛同時要檢查卵巢的黃體，根據(jù)黃體大小、發(fā)育成度、質(zhì)地軟硬、卵巢基礎(chǔ)和有無排卵點分為A、B、C三級。A級為正常，卵巢基礎(chǔ)好黃體直徑在1.5 cm以上，質(zhì)地軟硬適中，觸摸感覺如豬肝，與卵巢銜接好，有排卵點；B級為黃體直徑在1～1.5 cm之間，質(zhì)地稍軟或稍硬，與卵巢連接痕跡隱性黃體與排卵點不明顯，卵巢基礎(chǔ)薄弱；C級為黃體過小，與卵巢連接痕跡明顯，有小卵泡或卵巢基礎(chǔ)過差。C級不能作為黃體移植，視為廢棄，A、B級分別進行胚胎移植。

1.2.3 胚胎移植

1.2.3.1 確定移植的準確時間 以發(fā)情盛期當(dāng)天為0 d，第7 d實施胚胎移植，如受體牛出現(xiàn)流血情況，則流血發(fā)生的當(dāng)天為0 d，再加5 d實施移植。移植前先作好受體牛消毒和保定工作，在1～2尾椎間硬膜外注射2%利多卡因5 mL/頭和0.4～0.6 mL/頭靜松靈，使受體母牛尾根麻痹，失去對直腸把握造成的不適反應(yīng),以便移植操作。

1.2.3.2 胚胎解凍 解凍過程按照胚胎使用說明書要求在移植點無菌操作室內(nèi)進行。室內(nèi)氣溫恒定26℃進行胚胎解凍。從液氮罐中取出顆粒凍胚后直接投入解凍液，時間在35 s內(nèi)，然后將胚胎取出放入基礎(chǔ)液中3～5 min，再將胚胎取出放入漂洗液3～5 min；最后將胚胎放入移植液，0～2 h內(nèi)完成裝槍移植。

1.2.3.3 胚胎檢查 發(fā)育正常的胚胎其透明帶基本呈圓形，卵裂球均勻而緊湊，無滲出細胞；卵裂球分散或變性后一般不能用于移植。經(jīng)檢查采用A、B級合格胚胎用于移植。

1.2.3.4 移植 移植時用純凈水和0.1%K2MnO4溶液沖洗受體母牛外陰部，再用75%酒精棉消毒外陰部，用衛(wèi)生紙擦凈，雙手裂開外陰唇，再將解凍后的胚胎取出擦干，用75%酒精棉擦拭細管，然后輕輕向棉塞段甩幾下使冷凍液與保存液混合，剪去細管封口端，裝入移植槍(FHK，日本)，外裝專用硬外套及無菌軟外套，最后將移植槍插入陰道，用非手術(shù)法通過直腸把握法將胚胎植入有黃體一側(cè)的子宮角的小彎處(上1/3～1/2處)，在5～8 min內(nèi)移植完畢。移植時要做到輕、穩(wěn)、快，防止用力不當(dāng)損傷子宮造成感染。

1.2.4 妊娠檢查及妊娠母牛的飼養(yǎng)管理 認真做好胚胎移植記錄，在70天用直檢法進行妊檢，經(jīng)直檢確診妊娠的受體母牛，告知養(yǎng)殖戶加強飼養(yǎng)管理，供給充足的飼料以保證滿足胎兒和母牛的營養(yǎng)需要。防止頂撞、滑到等預(yù)防流產(chǎn)，保持舍內(nèi)和牛體的清潔衛(wèi)生。

2 移植結(jié)果統(tǒng)計

2.1 受胎率

移植時間在2011年3月1日至2012年11月30日參與移植的所有受體牛，之后跟蹤測定受胎率(表1)。9個月期間共移植1 796頭，妊娠965頭，意外流產(chǎn)1頭,平均移植受胎率53.72%，產(chǎn)活952頭。若按月計，其中受胎率最高時移植數(shù)量216頭，妊娠數(shù)量119頭，受胎率為55.09%。最低時移植186頭，妊娠數(shù)98頭，受胎率為52.69%。

表1 胚胎移植受胎率

2.2 生母率

2012年產(chǎn)活犢952頭，其中母犢918頭，公犢34頭，生母率為96.42%。

2.3 移植季節(jié)對受胎率的影響

以自然發(fā)情的西雜牛為受體移植高產(chǎn)奶牛胚胎，我區(qū)主要在每年3～11月進行。 由表1可以看出，4、5、6、9、10月份春秋季的受胎率最高，在54%到56%之間，高于7、8月份，但差異不顯著(\%P\%>0.05)這符合我區(qū)的氣候特點，涼州區(qū)夏季7、8月白天氣溫較高，但溫差較大，夜晚相對較涼爽，對牛的繁殖影響不大，由此可以看出，在我區(qū)正常條件下春、夏、秋三季均適宜移植。

2.4 黃體不同發(fā)育程度對受胎率的影響

采用直腸觸摸法判斷黃體發(fā)育情況，把黃體發(fā)育分為3級(即A、B、C三級)，為保證最大限度發(fā)揮移植的經(jīng)濟效益，達到B級以上方能輸胚。通過配種記錄對共同體發(fā)育程度對移植受胎率的影響情況進行統(tǒng)計(表2)。移植的1 347頭牛中，判斷黃體發(fā)育程度為A級的812頭，占60.3%，移植受胎453頭，受胎率為0.558%；B級黃體為535頭，移植受胎278頭，受胎率為52%。經(jīng)統(tǒng)計分析表明，A級黃體與B級移植的受胎率差異不顯著(\%P\%>0.05)。

表2 黃體不同發(fā)育程度對受胎率的影響

3 分析與討論

3.1 受胎率

從(表1)的移植結(jié)果可以看出，移植由美加農(nóng)有限責(zé)任公司提供的美國高產(chǎn)奶牛冷凍胚胎，大面積群體移植的受胎率達到了54.3%，本項目研究的移植技術(shù)及在農(nóng)戶中的推廣經(jīng)驗值得借鑒和推廣。

3.2 營養(yǎng)因素對黃體合格率的影響

對奶牛而言，能量負平衡與產(chǎn)后第一次排卵的時間存在著相關(guān),是否供給全價飼料和單一飼料，對其黃體的形成差異很明顯[1];在農(nóng)戶條件下利用西雜母牛做受體牛，其黃體形成的差異則表現(xiàn)不明顯。同時在農(nóng)戶條件下很難做到千篇一律飼喂全價飼料，但是做到飼料的多樣化，為受體牛養(yǎng)殖戶提供切實可行的配方，由于胚胎牛的合同價格均高于本地西雜犢牛的收購平均價，因此胚胎牛繁殖戶對受體牛的養(yǎng)殖相對舍得投入，可以按照飼養(yǎng)規(guī)程進行飼養(yǎng)。受體牛的膘情可以達到移植需要的要求，黃體合格率較高。

3.3 受體牛黃體等級對胚胎移植受胎率的影響

有人認為黃體體積大一些、質(zhì)地柔軟、有彈性且卵巢表面無濾泡的受胎率高；也有人認為黃體體積大一些、質(zhì)地硬一些、卵巢表面有濾泡的也可以移植；還有資料報導(dǎo)，以黃牛為受體A、B級黃體受胎率分別為71.7%、63.9%，二者之間差異不顯著(\%P\%>0.05)[2]。在大面積開展胚胎移植的實際操作中，受胎率很難達到70%以上。對黃體的判定，我們認為有以下幾方面的問題：一是黃體大小相對而言，不同品種、個體之間會有差異，內(nèi)含、外露的黃體很難掌握其大小;二是黃體大小因個人手感不同有差異，軟硬、質(zhì)地、形狀也因人而異，A、B級黃體沒有明顯的界限;三是技術(shù)人員的經(jīng)驗及技術(shù)水平、對受體牛卵巢上黃體質(zhì)量的判定是提高授胎率的主要因素。

3.4 關(guān)于受胎率的其他影響因素

除了上述原因，胚胎早期死亡是影響胚胎移植受胎率的一個因素：在胚胎因素中，包括母體遺傳因素異常，胚胎自身的生殖激素和識別信號空白的失調(diào)，由于親緣關(guān)系受到母體免疫排斥，母體免疫識別失敗使異源胚胎死亡[3]。冷凍胚胎解凍后停留時間對胚胎培養(yǎng)效果影響顯著;冷凍胚胎解凍后胚胎等級對胚胎培養(yǎng)效果影響顯著,解凍后A級胚胎存活率、囊胚孵化率顯著高于B級胚胎存活率和囊胚孵化率;解凍水浴溫度(20℃、30℃)對培養(yǎng)效果有極顯著影響[4]。另外，母體營養(yǎng)不良和激素失調(diào)，尤其是VitA、E的缺乏，醫(yī)療上用藥不當(dāng)或過量、移植前后注射疫苗及熱應(yīng)激導(dǎo)致的胚胎營養(yǎng)不足，都是影響胚胎移植受胎率的因素[5]。

4 小結(jié)

4.1 在農(nóng)戶條件下，農(nóng)戶為了保證收益，對受體牛的飼養(yǎng)管理水平相對較為精細，多數(shù)能按照移植要求飼養(yǎng)殖受體牛，因此在受體牛受胎后，發(fā)生意外少，產(chǎn)犢后對犢牛愛護有加，犢牛的成活率高，采用這種方式快速繁育高產(chǎn)奶牛，比在荷斯坦奶牛中選擇受體牛具有很大發(fā)展優(yōu)勢和潛力。

4.2 通過胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用，可以顯著提高奶牛純繁速度，擴大良種奶牛種群，促進奶業(yè)發(fā)展，同時可以減少種牛引進數(shù)量，充分發(fā)揮本地西雜母牛繁殖能力，大大降低高產(chǎn)奶牛的繁殖成本，提高西雜母牛的養(yǎng)殖效益。

4.3 2010年我國存欄奶牛1 260萬頭，奶牛的平均單產(chǎn)只有3 570 kg[6]，無論是數(shù)量還是質(zhì)量方面與世界水平相比均存在較大差距，嚴重制約著我國奶業(yè)的發(fā)展。在農(nóng)戶條件下利用西雜母牛，通過奶牛胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用，可以大大加快高產(chǎn)奶牛的數(shù)量擴張，迅速提高奶牛的產(chǎn)乳量，對于優(yōu)化農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)，促進農(nóng)業(yè)增效和農(nóng)民增收，提高國民身體素質(zhì)具有十分重要意義。

[1] 馬志遠,張靈芝.受體牛重復(fù)使用對同期發(fā)情效果和胚胎移植受胎率的影響[J].黑龍江動物繁殖,2006，14(1)：20-22.

[2] 周順成，馬志遠，尹世東.受體牛營養(yǎng)對黃體的影響及黃體等級對凍胚移植受胎率影響的試驗研究[J]. 2006，36(4)：5-7.

[3] 佟桂芝，王洪寶，董正德,等.胚胎因素對奶牛體外受精胚胎解凍孵化影響的試驗研究[J].中國奶牛，2007，25(6)：25-27.

[4] 明道緒等，生物統(tǒng)計附實驗設(shè)計[M].北京，中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[5] 郭志勤，家畜胚胎工程[M].中國科學(xué)技術(shù)出版社,1998.12.

[6] 《2011年中國奶業(yè)統(tǒng)計資料摘要》(內(nèi)部資料).

Key cwords:Simmental cross bred cow; sex-controlled embryo transplantation; embryo transfer season; progesterone level; gestation rate.

The Application Study of Breeding Excellent Dairy Applying Embryo Transplantation Technology with the Donator of the Simmental Crossbred Cow.

CAI Zhou-shan, LI Jian-xin, LI Yue-can ,XU Guo-jun, DANG Wu-ji，MEI Li-na

(LiangzhouDistrictAnimalHusbandryandVeterinarianBureau,Liangzhou,Gansu, 733000)

【Objective】In order to explore the breeding mode of high yield cows and to promote the industrialization application of the embryo transplantation technology on the milk industry production. 【Method】The experimentation has been implemented in 27 towns of all regions and with Simmental cross bred cow as donator under the conditions of village farmers. There were 1796 frozen embryos of high yield cows were transplanted in total. 【Result】 A total of 971 cows have been pregnancy and the average gestation rate was 54.06% , and produced 952 survival calves with the rate of producing female was 96.42%. The results showed that the gestations with the rate of 55.9% in spring and autumn was higher than summer in July and August, which with the lowest pregnant rate of 52.69%. But the difference was not significant (\%P\%>0.05). The transplantation results of the Simmental cross bred cow with the different progesterone level of A grade and B grade showed that the gestation rate of A grade is 0.558%, the gestation rate of B is 52%. After statistical analysis, the difference of gestation rate of A grade and B grade was not significant (\%P\%>0.05). 【Conclusion】Our study showed that it is feasible and scalable to breed excellent cow by applying this mode

2015-07-20修改日期:2015-07-25

蔡周山(1965-)，男，甘肅省武威市人，大學(xué)本科學(xué)歷，高級畜牧師，從事畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣工作。

S823.2

A

1001-9111(2016)01-0010-04