臧兆萍 李志茹 劉忠錦 楊曉華 高巍巍 齊寶奎

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 齊齊哈爾 161041)

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基質(zhì)相互作用分子1在紅藻氨酸致癲大鼠的表達(dá)及依達(dá)拉奉的干預(yù)作用

臧兆萍 李志茹 劉忠錦 楊曉華 高巍巍 齊寶奎

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 齊齊哈爾 161041)

目的 觀察基質(zhì)相互作用分子(STIM)1在紅藻氨酸(KA)致癲大鼠的表達(dá)及依達(dá)拉奉的干預(yù)作用。方法 50只雄性Wistar大鼠被隨機(jī)分為5組，每組10只。正常組、磷酸鹽緩沖液(PBS)組、癲癇組，治療組1(地西泮治療組)，治療組2(地西泮+依達(dá)拉奉治療組)。癲癇組在大鼠右側(cè)海馬以每公斤體重注射 1.5 μg/μl KA，PBS組采取同樣的方法在相同部位注入等量PBS，治療組1在癲癇模型成立后給予10 mg/kg地西泮終止癲癇，治療組2在治療組1的基礎(chǔ)上1 h后再給予依達(dá)拉奉30 mg，12 h一次，正常組不注射任何藥物。結(jié)果 用激光共聚焦顯微鏡觀察，癲癇組STIM1的表達(dá)密度顯著高于PBS組及正常組(P<0.05)，治療組較正常組、PBS組及癲癇組表達(dá)增高(P<0.05)。治療組1較治療組2表達(dá)增高(P<0.05)。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酯胺凝膠(SDS-PAGE)分析顯示STIM1的相對(duì)分子質(zhì)量分別46 kD，并且發(fā)現(xiàn)其在癲癇組的表達(dá)較正常組及PBS組增加，治療組較癲癇組相比降低，所得結(jié)果與激光共聚焦的結(jié)果相一致(P<0.05)。結(jié)論 STIM1表達(dá)增加對(duì)大鼠癲癇后海馬的神經(jīng)元損傷具有細(xì)胞保護(hù)作用。

癲癇；基質(zhì)相互作用分子(STIM)1；紅藻氨酸

癲癇是一種神經(jīng)元發(fā)作性異常放電所引起的臨床癥候群，病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未闡明。研究發(fā)現(xiàn)癲癇患者 30%～70%存在認(rèn)知功能障礙〔1，2〕。癲癇在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中記載，曰：“諸暴強(qiáng)直，皆屬于風(fēng)……諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”，中醫(yī)對(duì)于癲癇的治療多以“從肝論治”為出發(fā)點(diǎn)，但因受中藥成分復(fù)雜的影響，所以中藥治療極少。依達(dá)拉奉可清除自由基、抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的釋放。鈣釋放激活的鈣(CRAC)通道是鈣通道中的一種位于細(xì)胞質(zhì)膜上的慢鈣通道，基質(zhì)相互作用分子(STIM)1是CRAC通道關(guān)鍵蛋白中的一個(gè)，介導(dǎo)CRAC通道的組成和激活。本實(shí)驗(yàn)研究STIM1在紅藻氨酸(KA)大鼠海馬中的表達(dá)變化及依達(dá)拉奉治療后的表達(dá)變化，旨在探討其在顳葉癲癇發(fā)生及治療中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 材料 健康成年雄性清潔級(jí)Wistar大鼠50只(體重200～250 g)，環(huán)境溫度適宜，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵守中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的規(guī)定。

1.2 癲癇動(dòng)物模型的建立 將Wistar大鼠用10%水合氯醛1 ml(0.3～0.4 ml/kg體重)麻醉后固定，備皮，切開，剝離，按大鼠腦立體定向圖譜，以前囟為靶點(diǎn)定位CA3〔坐標(biāo)：X=2.5 mm(右)，Y=3.0 mm，Z=3.5 mm〕鉆孔，在動(dòng)物清醒和無(wú)菌的條件下，用1 μl微量注射器注入以磷酸鹽緩沖液(PBS)配制的濃度為1.5 μg/μl KA 1 μl，注藥持續(xù)10～15 min，留針5 min。根據(jù)KA誘發(fā)鼠的行為學(xué)改變判定癲癇鼠模型的建立。PBS組于相同部位等時(shí)注入等量的PBS。以Racine等〔3〕行為學(xué)標(biāo)準(zhǔn)判定癲癇模型，治療組1在癲癇模型成立后給予10 mg地西泮終止癲癇，治療組2在治療組1的基礎(chǔ)上1 h后再給予依達(dá)拉奉30 mg,12 h一次，在正常組不注射任何藥物。

1.3 標(biāo)本的制備 標(biāo)本固定、包埋、切片、脫蠟、抗原修復(fù)、封閉，兔抗鼠STIM1抗體單克隆抗體(1∶100)4℃孵育過(guò)夜，第2天切片室溫復(fù)溫1 h，PBS漂洗，滴加山羊抗兔異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記熒光二抗(濃度1∶50)，2.5 μg/ml碘化丙啶(PI)染色20 min后漂洗水化封片。從加熒光二抗開始的雙重標(biāo)記實(shí)驗(yàn)過(guò)程均需避光操作。雙標(biāo)法參照Bernardini等〔4〕，并根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的樣品要求進(jìn)行了改進(jìn)。

1.4 共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析 所用儀器為奧林巴斯LSM 510 META共聚焦激光掃描生物顯微鏡，能同時(shí)激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm和514 nm可見光激光光源，發(fā)射波長(zhǎng)分別為516 nm與617 nm，兩者無(wú)交叉重疊區(qū)域，這種區(qū)分是進(jìn)行雙重標(biāo)記和觀察的前提。每張切片隨機(jī)取10個(gè)視野，連續(xù)掃描10個(gè)層面。將數(shù)字化圖像存儲(chǔ)進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)分析。

1.5 蛋白質(zhì)印跡分析及樣品處理 提取細(xì)胞總蛋白，酶標(biāo)儀測(cè)總蛋白含量，按照樣品與5×上樣緩沖液為4∶1的比例加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min使蛋白變性。步驟為：制備12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，取60 μg總蛋白上樣，電泳45 min；室溫、恒壓220 V條件下，濕轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜40 min〔聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，Hybond，America〕。磷酸鹽緩沖液(PBS)配制的5%脫脂奶粉溶液用作封閉液，37℃封閉2 h；STIM1，抗體(1∶50)4℃孵育過(guò)夜；吐溫-20的Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)漂洗3次，10 min/次；加入辣根過(guò)氧化物酶-抗兔IgG(1∶8 000)室溫?fù)u床中孵育2 h，TBST 洗3次，每次5～10 min；電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)30 min后，暗室中X線片曝光；室溫顯影、定影。用GIS凝膠成像系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行薄層密度掃描，記錄相應(yīng)條帶的透射光積分光密度(IOD)值反映蛋白含量。β-actin 為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

正常組(1～3)，PBS組(4～6)，癲癇組(7～9)，治療組1(10～12)，治療組2(13～15)圖1 免疫熒光雙染法測(cè)STIM1在各組海馬的表達(dá)(×200)

2.1 癲癇大鼠海馬CA3區(qū)蛋白的表達(dá) 當(dāng)檢測(cè)通道為488 nm時(shí)，僅顯示被染成綠色熒光的光斑(見圖1中1、4、7、10、13)，而當(dāng)檢測(cè)通道為514 nm時(shí)，僅顯示被染成紅色的核酸(見圖1中2、5、8、11、14)，這樣更加清楚地顯示了細(xì)胞核的輪廓，當(dāng)細(xì)胞核PI標(biāo)記的核酸紅色而與細(xì)胞外FITC標(biāo)記的熒光二抗綠色疊加時(shí)，更能突顯細(xì)胞質(zhì)中所觀測(cè)蛋白的表達(dá)(見圖1中3、6、9、12、15)。在CA3區(qū)，STIM1癲癇組表達(dá)密度(5.08±0.10)高于正常組(1.01±0.06)及PBS組(1.07±0.01)，治療組低于癲癇組，治療組1(3.11±0.18)顯著低于治療組2(3.70±0.28)(P<0.05)。

2.2 免疫印跡法癲癇大鼠海馬CA3區(qū)蛋白的表達(dá) STIM1的相對(duì)分子質(zhì)量分別46 kD，并且發(fā)現(xiàn)STIM1表達(dá)的變化與癲癇組高于正常組相一致。見圖2。

圖2 STIM1在癲癇大鼠海馬CA3區(qū)的表達(dá)

3 討 論

KA致癲模型已經(jīng)在國(guó)內(nèi)外得到廣泛認(rèn)可，KA是人工提取的一種谷氨酸類似物，具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性作用，它可與腦內(nèi)神經(jīng)元突觸后膜上的非N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體結(jié)合，目前認(rèn)為興奮性氨基酸的堆積和海馬神經(jīng)元興奮性氨基酸受體的上調(diào)是KA誘導(dǎo)癇性發(fā)作的主要分子機(jī)制〔5〕。海馬 CA3 區(qū)神經(jīng)元死亡、膠質(zhì)細(xì)胞增生和苔狀纖維發(fā)芽是紅藻氨酸致顳葉癲癇模型一個(gè)顯著的病理特點(diǎn)，這樣的病理改變同人類顳葉癲癇的病理改變與海馬硬化相一致〔6〕。

研究表明鈣通道參與癲癇形成〔7～9〕，鈣通道異常引起Ca2+過(guò)度內(nèi)流，大量神經(jīng)元同步過(guò)度放電，致其發(fā)作。在癲癇患者中，鈣通道異常，致Ca2+過(guò)度內(nèi)流，神經(jīng)元異常放電，本實(shí)驗(yàn)采用地西泮及依達(dá)拉奉的聯(lián)合治療，致STIM1的表達(dá)改變，從而干預(yù)CRAC通道的激活，從而對(duì)異常放電的神經(jīng)元起到保護(hù)作用。通過(guò)其表達(dá)增加從而對(duì)癲癇后神經(jīng)元的過(guò)度放電的損傷具有保護(hù)作用。地西泮組聯(lián)合依達(dá)拉奉治療STIM1表達(dá)增加更顯著，從而腦保護(hù)作用更顯著，其可能的作用機(jī)制是依達(dá)拉奉可降低谷氨酸的興奮性，而二者的聯(lián)合使用是序貫使用，不是混合應(yīng)用，故不考慮二者混合應(yīng)用會(huì)對(duì)大鼠造成不良反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)也證實(shí)二者的聯(lián)合應(yīng)用不受此影。依達(dá)拉奉通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化起到保護(hù)作用。依達(dá)拉奉的分子量較小，約60%可以透過(guò)血腦屏障，能夠在腦內(nèi)到達(dá)有效治療濃度。靜脈給藥能夠?qū)⒋竽X中的羥自由基(具有高度細(xì)胞毒性)有效清除〔10，11〕。依達(dá)拉奉注射液作為一種新型的自由基清除劑，已在神經(jīng)科廣泛使用〔12〕。依達(dá)拉奉注射液可通過(guò)清除自由基、抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的釋放、 激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2、上調(diào)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和Bcl-2 蛋白表達(dá)、下調(diào)海馬膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和白細(xì)胞介素(IL)-1β表達(dá)、下調(diào) C-Jun N 端激酶(JNK)表達(dá)從而減少神經(jīng)元凋亡，減輕腦損害〔13～17〕。 Kamida 等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉可通過(guò)降低誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)而減少癲癇持續(xù)狀態(tài)后大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)依達(dá)拉奉對(duì)癲癇大鼠的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，但其具體保護(hù)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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〔2015-03-19修回〕

(編輯 苑云杰)

黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.H201498)

齊寶奎(1969-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病與癲癇研究。

臧兆萍(1979-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事癲癇的發(fā)病機(jī)制及治療研究。

R742.2

A

1005-9202(2016)23-5789-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.008