朱慧果，嚴(yán) 利，王 佳

(湖南省人民醫(yī)院湖南省老年醫(yī)學(xué)研究所，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410016)

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NMDA干預(yù)下Rab30在PC12細(xì)胞中的表達(dá)及凋亡通路

朱慧果，嚴(yán) 利，王 佳*

(湖南省人民醫(yī)院湖南省老年醫(yī)學(xué)研究所，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410016)

探討興奮毒性氨基酸(NMDA)損傷干預(yù)下Rab30在PC12細(xì)胞中的表達(dá)及其凋亡通路，發(fā)現(xiàn)NMDA干預(yù)可能通過(guò)下調(diào)Rab30和GM130的表達(dá)，使高爾基體結(jié)構(gòu)破裂成片，并可能通過(guò)上調(diào)GAAP和Caspase-3的表達(dá)，誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的凋亡和死亡.

PC12細(xì)胞；Rab30；神經(jīng)退行性疾??；興奮毒性氨基酸；凋亡

高爾基體(Golgi apparatus，GA)在神經(jīng)退行性疾病病理?xiàng)l件下和各種損傷機(jī)制(興奮毒性氨基酸、鈣超載、炎癥因子、氧自由基等)下會(huì)出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，甚至發(fā)生碎裂[1-3].Rab30作為一種重要的調(diào)節(jié)型的運(yùn)輸?shù)鞍祝瑓⑴c維持非神經(jīng)細(xì)胞高爾基體結(jié)構(gòu)完整[4]，可能參與損傷機(jī)制下神經(jīng)細(xì)胞高爾基體碎裂的調(diào)控，從而導(dǎo)致神經(jīng)元喪失.本研究對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行興奮氨基酸毒性(NMDA)損傷干預(yù)，并借助細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、MTT法檢測(cè)PC12細(xì)胞存活率、Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡、Western-blot法檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從細(xì)胞及分子水平研究NMDA干預(yù)下Rab30在PC12細(xì)胞中的表達(dá)并探討其凋亡通路.本研究希望為神經(jīng)退行性疾病的病因及病理機(jī)制提供理論和實(shí)踐依據(jù)，進(jìn)而為神經(jīng)退行性疾病藥物治療提供新的靶點(diǎn).

1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

PC12細(xì)胞株(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所)；1640培養(yǎng)基(Hyclone)，胎牛血清和胰酶消化液(Gibco)，青-鏈霉素溶液(碧云天)，NMDA 和MTT(Sigma)，Rab30(ORIGENE)，GAAP和GM130(Proteintech)，Caspase-3(CST)，Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡(長(zhǎng)沙維爾生物有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(Wellbio)，HRP goat anti-mouse IgG(Proteintech)，HRP goat anti-rabbit IgG(Proteintech)，Super ECL Plus 超敏發(fā)光液(Thermo pierce)，顯影液和定影液(WellBiology).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞株用完全培養(yǎng)基(含胎牛血清10%和1640培養(yǎng)液90%及100 U/mL 青-鏈霉素混合液)，pH值調(diào)至7.2～7.4, 于37 ℃下，5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2天換液，待PC12細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)80%左右，用0.05%胰蛋白酶消化，一分為二傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究.

藥物濃度配制及實(shí)驗(yàn)分組：將25 mg NMDA溶于1 mL DMSO溶液中，儲(chǔ)液濃度為169.9 mmol/L.取2.9 μL加入到10 mL完全培養(yǎng)基中，終濃度為50 μmol/L.PC12細(xì)胞分別經(jīng)正常情況下培養(yǎng)5 h(正常組)、加入50 μmol/L NMDA培養(yǎng)5 h(NMDA組)后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn).

2.2 檢測(cè)細(xì)胞存活率

采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞存活率，待細(xì)胞長(zhǎng)至70～80%時(shí)，取出96孔板，吸去舊的培養(yǎng)基，分別加入上述已配制好的含藥培養(yǎng)基，設(shè)正常組和50 μmol/L NMDA組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔.處理5 h后，每孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，37 ℃下，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后取出，棄上清，每孔中加入150 μL二甲基亞砜，完全溶解后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm處測(cè)定其吸光度A，計(jì)算PC12細(xì)胞的存活率.

2.3 檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

按照Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒(KGA108)說(shuō)明書檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡率.正常組和NMDA組各處理5 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶進(jìn)行消化，以冰冷PBS洗滌2次，離心(2 000 r/min，5 min)后收集約(1～5)×105細(xì)胞.除去上清液，滴入500 μL Binding buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC及5 μL PI使用液使其混勻，置于室溫下避光5～15 min后，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度.采用專業(yè)軟件Cell Quest對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行收集、儲(chǔ)存和分析.

2.4 Western blot蛋白印跡法檢測(cè)各目的蛋白在PC12細(xì)胞中的表達(dá)

將孵育好的PC12細(xì)胞分正常組、NMDA組，用預(yù)冷的PBS洗滌，離心(3 000 r/min，2 min)，吸除上清液.加入50 μL RIPA裂解液混勻；冰上蛋白裂解約30 min后用離心機(jī)離心(4 ℃,12 000 r/min，15 min)，取離心后的上清液進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè).按照BCA蛋白定量試劑盒(Wellbio)說(shuō)明書進(jìn)行操作，將蛋白經(jīng)過(guò)電泳，將Rab30(23 k),GM130(130 k),GAAP(30 k),Caspase-3(32 k),β-actin(42 k)切片轉(zhuǎn)膜，浸入封閉液中1 h.用1*TBST將一抗按照一定比例稀釋(具體比例見(jiàn)表1)，將膜與一抗一起孵育，4 ℃過(guò)夜.用1*TBST稀釋HRP標(biāo)記的二抗(Proteintech)，稀釋比例為1∶3 000，將膜與稀釋后的二抗一同孵育40～60 min.用ECL顯色曝光，將曝光后的底片掃描，并用Quantity one專業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析.

預(yù)制裝配式混凝土結(jié)構(gòu)有多種形式，如剪力墻結(jié)構(gòu)，框架結(jié)構(gòu)，框架剪力墻結(jié)構(gòu)和部分框架剪力墻結(jié)構(gòu)。由于預(yù)制裝配式結(jié)構(gòu)的預(yù)制構(gòu)件全部通過(guò)連接節(jié)點(diǎn)連接，所以混凝土結(jié)構(gòu)在大范圍內(nèi)尚未廣泛使用。與傳統(tǒng)建筑方法相比，預(yù)制建筑物具有更多的連接界面和接縫，而裝配式混凝土結(jié)構(gòu)中的節(jié)點(diǎn)是裝配式建筑的薄弱環(huán)節(jié)，在連接節(jié)點(diǎn)的處理問(wèn)題上，國(guó)內(nèi)的技術(shù)手段目前并不是很成熟。但裝配式建筑結(jié)構(gòu)在環(huán)保、節(jié)能和施工上與現(xiàn)澆相比優(yōu)點(diǎn)比較突出。

表1 各種抗體的貨源、貨號(hào)及稀釋比例表

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 MTT比色法檢測(cè)PC12細(xì)胞存活率比較

由表2可知，經(jīng)損傷干預(yù)后各組的吸光度明顯低于正常組(P<0.05).NMDA組吸光度A為0.149 7±0.035 7，與正常組0.257 2±0.009 3相比明顯減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

表2 MTT法檢測(cè)PC12細(xì)胞存活率各損傷干預(yù)組與正常組的比較

注：a與正常組比較，均P<0.05.

3.2 Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果

注：*與正常組早期凋亡率比較，P<0.05；▲與正常組總凋亡率比較，P<0.05 圖1 Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)各損傷干預(yù)組與正常組PC12細(xì)胞凋亡率比較 Fig.1 The apoptosis rate comparison of PC12 cell between the intervention group and the control group with Annexin V-FITC/PI method

由表3、圖1和圖2可知，正?；畹腜C12細(xì)胞(雙陰性細(xì)胞)主要分布在流式細(xì)胞分析圖中的左下象限，Annexin V-FITC及 PI均低染(Annexin V-PI-)；早期凋亡的細(xì)胞或死亡的細(xì)胞分布在流式分析圖的右下象限，Annexin V-FITC高染而 PI低染(Annexin V+PI-)；晚期死亡或凋亡的細(xì)胞分布在圖的右上象限，Annexin V-FITC及PI均高染(Annexin V+PI+)[5].結(jié)果顯示未經(jīng)損傷干預(yù)的正常組PC12細(xì)胞絕大部分均為雙陰性細(xì)胞(圖2A，左下象限)，約占99.15%；正常組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,無(wú)明顯細(xì)胞凋亡或死亡；而經(jīng)損傷干預(yù)后兩組細(xì)胞的凋亡率明顯增加，NMDA組的早期凋亡率及總凋亡率與正常組比較顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

表3 Annexin V/PI雙染法檢測(cè)PC12細(xì)胞的凋亡率比較

注：a與正常組的早期凋亡率比較，P<0.05；b與正常組的總凋亡率比較，P<0.05.

A：正常組 B：NMDA組圖2 Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)PC12細(xì)胞的凋亡率Fig.2 The apoptosis rate of PC12 cells detected by Annexin V-FITC/PI method

3.3 Western blot法檢測(cè)目的蛋白在PC12細(xì)胞中的表達(dá)情況

由圖3和圖4可知，經(jīng)損傷處理后NMPA組中的GAAP和Caspase-3在PC12細(xì)胞中表達(dá)較正常組的顯著增加，Rab30和GM130較正常組的表達(dá)下降.Rab30在NMDA組中的蛋白表達(dá)(0.127 6±0.002 4)與正常組(0.227 2±0.002 0)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； GM130在NMDA組中的蛋白表達(dá)(0.181 1±0.004 1)與正常組(0.270 4±0.005 3)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GAAP在NMDA組中的蛋白表達(dá)(0.562 5±0.016 4)與正常組(0.284 2±0.004 2)比較，均P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Caspase-3在NMDA組中的蛋白表達(dá)(0.573 2±0.001 9)與正常組(0.323 2±0.000 6)比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

注：*，#，★，◆，與正常組比較，P<0.05.圖3 損傷干預(yù)組與正常組各目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較Fig.3 The comparison of the relative expression level of target protein between the intervention group and the normal group

A：正常組；B：NMDA組圖4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)Rab30， GM130， GAAP和Caspase-3的表達(dá)情況Fig.4 The expression of GAAP, GM130, Caspase-3 and Rab30 by Western blot

4 討論

神經(jīng)退行性疾病是腦細(xì)胞和脊髓細(xì)胞中的神經(jīng)元喪失的一種疾病狀態(tài)，興奮性氨基酸在神經(jīng)退行性疾病中起著非常重要的作用.當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受到興奮性氨基酸毒性作用后，可引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[6-7].本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PC12細(xì)胞株經(jīng)NMDA處理后，PC12細(xì)胞的存活率減少，凋亡率增加，GAAP和Caspase-3蛋白量表達(dá)增加.NMDA很可能是通過(guò)增加胞內(nèi) Ca2+濃度，使鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而導(dǎo)致PC12細(xì)胞死亡.

神經(jīng)退行性疾病的本質(zhì)是神經(jīng)元的喪失，高爾基體的形態(tài)改變或破裂是神經(jīng)退行性疾病共同出現(xiàn)的特征.一旦高爾基體的結(jié)構(gòu)及功能遭受破壞，將會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運(yùn)的異常，神經(jīng)元細(xì)胞功能紊亂，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生[8-9].Rab蛋白是一類小分子調(diào)節(jié)型GTP結(jié)合蛋白(small GTP-binding proteins)，最近的研究表明Rab30主要定位于高爾基體中，并且在非神經(jīng)細(xì)胞中維持高爾基體結(jié)構(gòu)完整，Rab30的沉默表達(dá)可導(dǎo)致正常高爾基體弓形結(jié)構(gòu)破裂成片[2].在筆者研究中發(fā)現(xiàn)，Rab30經(jīng)NMDA損傷干預(yù)后在PC12細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，因此，筆者推斷Rab30很可能參與損傷干預(yù)下神經(jīng)細(xì)胞中高爾基體破裂的調(diào)控作用，但具體如何調(diào)控還需進(jìn)一步研究.

高爾基體基質(zhì)蛋白130(Golgi matrix protein 130，GM130) 是高爾基體順面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中一個(gè)重要的基質(zhì)蛋白，可作為高爾基體結(jié)構(gòu)定位的標(biāo)記物，GM130表達(dá)量下降可作為高爾基體破壞比較敏感的分子標(biāo)志[10-11].本研究中經(jīng)藥物處理后的PC12細(xì)胞存活率減少，凋亡率增加，GM130相對(duì)表達(dá)量較正常組明顯下降.因此，筆者推斷NMDA損傷干預(yù)很可能通過(guò)下調(diào)GM130的表達(dá)來(lái)影響高爾基體的形態(tài)及結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)PC12細(xì)胞死亡.

有研究證明高爾基體抗凋亡蛋白(Golgi anti-apoptotic protein，GAAP)主要定位在高爾基體上[12-13].本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)損傷處理后GAAP蛋白表達(dá)量較正常組明顯增加，因此筆者推斷GAAP的高表達(dá)很可能是因PC12細(xì)胞經(jīng)損傷干預(yù)后，在應(yīng)激狀態(tài)下做出應(yīng)答，通過(guò)高表達(dá)可延緩高爾基體結(jié)構(gòu)的破裂，但抗凋亡蛋白仍不足以抵抗各種損傷，最終出現(xiàn)了PC12細(xì)胞的凋亡或死亡.目前對(duì)GAAP這種最新發(fā)現(xiàn)的蛋白研究不多，GAAP蛋白的高表達(dá)與PC12細(xì)胞凋亡具體機(jī)制及相互關(guān)系還需進(jìn)一步探討.

天冬氨酸特異性酶半胱氨酸蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate-specific protease, Caspase-3)是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶及執(zhí)行者[14-15].在本研究中，經(jīng)損傷干預(yù)后PC12的凋亡率明顯增加，Caspase-3蛋白表達(dá)量亦明顯增加.Caspase-3是神經(jīng)元凋亡的易感因子，興奮氨基酸毒性可導(dǎo)致Caspase-3被激活，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷.因此，NMDA損傷干預(yù)很可能是通過(guò)調(diào)控凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)，誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的死亡，故研究Caspase-3的抑制劑或抑制其活性，可在一定程度上減緩或阻止神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)程.

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(編輯 WJ)

The Expression and Apoptosis Pathway of Rab30 in PC12 Cells Under NMDA Interventions

ZHUHui-guo,YANLi,WANGJia*

(Hunan Institute of Gerontology, Hunan Provincial People’s Hospital, Changsha 410016, China)

In this work, we report a study of the expression and apoptosis pathway of Rab30 in PC12 cells under injury interventions of NMDA. Our results show that NMDA interventions are likely to break the structure of golgi into pieces through downgrading the expression of Rab30 and GM130, leading to the induction of the apoptosis of PC12 cells through adjusting the expression of GAAP and Caspase-3.

PC12 cells; Rab30; neurode-generative diseases; NMDA; apoptosis

10.7612/j.issn.1000-2537.2016.06.006

2016-09-01

湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(14JJ2143)；湖南省衛(wèi)計(jì)委計(jì)劃資助項(xiàng)目(B2012-121)

Q189

A

1000-2537(2016)06-0032-05

*通訊作者,E-mail：13875888342@163.com