李雪蓮 楊翠翠 張 蘭* 石京山

(1.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點實驗室，貴州遵義 563000；2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室, 北京 100053; 3.北京腦重大疾病研究院, 北京 100053; 4.北京市神經(jīng)藥物工程研究中心, 北京 100053; 5.神經(jīng)變性病教育部重點實驗室, 北京 100053)

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· 神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)研究 ·

山茱萸環(huán)烯醚萜苷對蛋白磷酸酶2A催化亞基C磷酸化的調(diào)節(jié)機(jī)制

李雪蓮1, 2，3，4，5楊翠翠2，3，4，5張 蘭2，3，4，5*石京山1*

(1.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點實驗室，貴州遵義 563000；2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室, 北京 100053; 3.北京腦重大疾病研究院, 北京 100053; 4.北京市神經(jīng)藥物工程研究中心, 北京 100053; 5.神經(jīng)變性病教育部重點實驗室, 北京 100053)

目的 探討山茱萸環(huán)烯醚萜苷(Corneliridoidglycoside，CIG)上調(diào)蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)，PP2A活性抑制tau蛋白磷酸化的作用機(jī)制。方法 ①確定最佳轉(zhuǎn)染條件：將Src 質(zhì)粒DNA(0.2、0.4、0.6、0.8 μg)瞬時轉(zhuǎn)染入小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞(Neuro-2A cell，N2a 細(xì)胞)，觀察不同量Src對PP2A催化亞基C磷酸化和tau蛋白磷酸化的影響；②將0.6 μg Src 質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染入N2a細(xì)胞，24 h后加入CIG(50、100、200 μg/mL)共同孵育24 h，觀察CIG對Src、蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)、p-PP2Ac及tau蛋白磷酸化的作用。結(jié)果 ①轉(zhuǎn)染Src(0.2、0.4、0.6 μg)質(zhì)粒DNA到N2a細(xì)胞，Src蛋白表達(dá)明顯增加，p-PP2Ac水平上調(diào)，PP2Ac蛋白總量表達(dá)無變化，tau蛋白在Ser 199/202、Ser 396位點磷酸化顯著增加；轉(zhuǎn)染0.8 μg Src質(zhì)粒DNA到N2a細(xì)胞與轉(zhuǎn)染0.6 μg Src相比，p-PP2Ac表達(dá)下降，PP2Ac蛋白總量表達(dá)無變化，tau蛋白在Ser 199/202、Ser 396位點磷酸化降低。②轉(zhuǎn)染0.6 μg Src質(zhì)粒DNA到N2a細(xì)胞，Src蛋白表達(dá)增加，p-PP2Ac表達(dá)增加，tau蛋白在Ser 199/202、Thr 205、Thr 217以及Ser 396位點的磷酸化明顯增加；CIG對Src蛋白表達(dá)無影響，能夠抑制p-PP2Ac的表達(dá)，抑制tau蛋白在Ser 199/202、Thr 205、Thr 217以及Ser 396位點的磷酸化。此外，CIG能上調(diào)PTP1B蛋白表達(dá)。結(jié)論 CIG對Src蛋白無明顯調(diào)節(jié)作用，但能通過增加PTP1B的表達(dá)，降低PP2A催化亞基C磷酸化，從而升高PP2A活性，進(jìn)一步降低tau的過度磷酸化。CIG對tau蛋白過度磷酸化的抑制作用，將會給阿爾茨海默病的治療帶來廣闊的應(yīng)用前景。

山茱萸環(huán)稀醚萜苷；蛋白酪氨酸激酶Src；蛋白磷酸酶2A；蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B；tau蛋白；阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，是老年人中常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理表現(xiàn)為神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)和老年斑。過度磷酸化的tau蛋白是NFT的主要成分[1]，蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)是調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化的主要酯酶，AD患者腦內(nèi)PP2A活性顯著下降[2]；降低PP2A活性，會引起tau蛋白過度磷酸化和記憶損傷[3-4]。PP2A是一個異源三聚化合物，由結(jié)構(gòu)亞基A、調(diào)節(jié)亞基B以及催化亞基C構(gòu)成PP2A全酶[5]。PP2A的活性，主要受其催化亞基C酪氨酸307位點的磷酸化調(diào)節(jié)。酪氨酸蛋白激酶Src和蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)能調(diào)節(jié)PP2A催化亞基C的磷酸化。激活Src途徑，增加PP2A催化亞基C磷酸化，抑制PP2A活性，進(jìn)而導(dǎo)致tau蛋白過度磷酸化[6-7]；PP2A的活化因子PTP1B表達(dá)上調(diào)，可使PP2Ac發(fā)生去磷酸化，進(jìn)而激活PP2A[8]。

山茱萸(CornusofficinalisSieb.etZucc)為傳統(tǒng)的常用補(bǔ)益肝腎效果良好的藥物。山茱萸環(huán)烯醚萜苷(cornel iridoid glycoside，CIG)是山茱萸的主要有效成分之一，主要成分包括馬錢苷和莫諾苷[9]。本室前期實驗研究[10-11]顯示，CIG能增加PP2A活性，進(jìn)而抑制tau蛋白過度磷酸化。本文將主要探討CIG是否通過調(diào)節(jié)PP2A催化亞基C磷酸化修飾，進(jìn)而提高PP2A活性，降低tau蛋白的過度磷酸化。

1 材料和方法

1.1 藥品及試劑

山茱萸環(huán)稀醚萜苷，本實驗室從山茱萸提取，純度為71%(主要成分為馬錢苷和莫諾苷)；實驗中采用干粉劑量，溶解于氯化鈉溶液后使用。MEM/EBSS培養(yǎng)基(賽默飛十二生物化學(xué)制品有限公司，美國)，胎牛血清(Gibco BRL公司，美國)，胰蛋白酶[含0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))EDTA，Gibco BRL公司，美國]，青霉素/鏈霉素原液(Pen Strep Life公司，美國)。轉(zhuǎn)染試劑盒(jetPRIME，Poly plus公司，法國)，RC-DC protein assay(500-0122-MSDS，Bio-Rad公司，美國)。本實驗主要抗體詳見表1。

表1 本實驗所用主要抗體

Tab.1 The main antibody used in this experiment

1.2 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(Tc2323 型，美國SHELL/JB 公司)，超凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)，倒置相差顯微鏡(Nikon eclipse TE300，日本Nikon公司)，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JY92-Ⅱ型，寧波新芝科器研究所)，全波長酶標(biāo)儀(Multiskan Spectrum，法國巴德斯公司)，電子天平(BS210S，北京賽多利斯天平有限公司)，低溫高速臺式離心機(jī)(Beckman 22R，美國Beckman公司)，醫(yī)用低速離心機(jī)(B320A，安新縣白洋離心機(jī)廠)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)，電轉(zhuǎn)儀(美國Bio-Rad公司), 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國ProteinSimple公司)

1.3 方法

1.3.1 N2a細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞(Neuro-2A cell，N2a 細(xì)胞)在37 ℃、5% (體積分?jǐn)?shù))CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d更換一次新鮮完全培養(yǎng)基[89%(體積分?jǐn)?shù)) MEM EBSS, 10%(體積分?jǐn)?shù)) FBS，1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))青霉素/鏈霉素原液]，F(xiàn)BS用0.22 μm濾器過濾除菌。轉(zhuǎn)染的詳細(xì)操作步驟參見Polyplus轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，大致步驟如下：①當(dāng)細(xì)胞生長至80%豐度時，用胰酶消化后，以105個/mL接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每組2個復(fù)孔), 每孔1 mL完全培養(yǎng)基；②24 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，用Polyplus轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，Src質(zhì)粒DNA∶轉(zhuǎn)染試劑=1 μg∶2 μL，放入二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；③24 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，并加入50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的CIG共同孵育；④繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，使用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)超聲，裂解細(xì)胞提取蛋白。

1.3.2 蛋白免疫印跡法

①樣品制備：將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸出，加入DPBS沖洗2～3次，加RIPA裂解液(含PMSF)裂解細(xì)胞，輕輕吹打使細(xì)胞懸浮，吸出細(xì)胞懸浮液到1.5 mL EP管中；置于冰上20 min，超聲7 s(3次)，加入5×loading buffer，混勻，95 ℃金屬浴，5 min；置于低溫高速離心機(jī)中， 離心30 min(4 ℃，12 000 r/min)；吸取上清。②蛋白定量：具體操作嚴(yán)格按照RC-DC protein assay蛋白定量方法進(jìn)行。③SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：蛋白上樣量10 μg，經(jīng)10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS-PAGE膠電泳分離蛋白；用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜電轉(zhuǎn)：90 V，100 min；封閉：5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉稀釋于TBST溶液中，封閉2 h；加入一抗[用含5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉的TBST溶液稀釋]，4 ℃孵育過夜；次日，置于搖床用TBST清洗3次，10 min/次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠或抗兔IgG 抗體(1∶2 000)，置于搖床上搖動，室溫孵育2 h；曝光：暗室中，將化學(xué)發(fā)光底物A 液和B 液按1∶1比例混合,加到PVDF膜上，約200 μL/膜，曝光時間根據(jù)蛋白的表達(dá)量多少以及抗體的效價確定，保存圖片為Tiff File格式。免疫條帶灰度值采用AlphaView SA軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS17.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù)，各組實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，組間樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Src質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染條件的確定

實驗采用不同量Src質(zhì)粒DNA(0.2、0.4、0.6、0.8 μg)瞬時轉(zhuǎn)染入小鼠N2a細(xì)胞，24 h后提取蛋白，蛋白定量后采用Western blotting 方法檢測Src、p-PP2Ac及tau 蛋白在Ser 199/202、Ser 396位點的磷酸化。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染0.2～0.6 μg Src質(zhì)粒DNA，隨Src質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染量的增多，細(xì)胞內(nèi)Src蛋白總量表達(dá)增加，p-PP2Ac表達(dá)增多，PP2Ac總蛋白量無明顯變化，同時觀察到tau蛋白在Ser 199/202、Ser 396位點磷酸化顯著增加；但當(dāng)Src質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染量達(dá)到0.8 μg時，與對照組相比，p-PP2Ac表達(dá)增多，PP2Ac總蛋白量無明顯變化，tau蛋白在Ser 199/202、Ser 396位點磷酸化增加，但與轉(zhuǎn)染0.6 μg Src質(zhì)粒DNA相比，p-PP2Ac表達(dá)下降，同時tau蛋白在Ser 199/202、Ser 396位點磷酸化表達(dá)減少。本實驗采用0.6 μg Src質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染(圖1)。

2.2 CIG對Src轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞內(nèi)PP2Ac酪氨酸磷酸化修飾的影響

轉(zhuǎn)染Src質(zhì)粒DNA到N2a細(xì)胞24 h后，棄原有培養(yǎng)基，加入不同濃度CIG(50、100、200 μg/mL)與細(xì)胞共同孵育24 h，用Western blotting方法檢測Src總蛋白、p-PP2Ac及PP2Ac總蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示：模型組與對照組相比，Src蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，PP2Ac在Y307位點磷酸化表達(dá)明顯增加，PP2Ac總蛋白無明顯變化。CIG對Src蛋白無明顯調(diào)節(jié)作用，但給予CIG 100、200 μg/mL，能顯著降低p-PP2Ac (P<0.001)，對PP2Ac總蛋白沒有明顯影響(圖2)。

2.3 CIG對Src轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞內(nèi)tau蛋白多個位點磷酸化的影響

轉(zhuǎn)染Src質(zhì)粒DNA到N2a細(xì)胞24 h后，棄原有培養(yǎng)基，加入不同濃度CIG(50、100、200 μg/mL)與細(xì)胞共同孵育24 h，檢測 tau蛋白在Ser 199/202、Thr 205、Thr 217以及Ser 396位點的磷酸化水平。結(jié)果顯示模型組與空白組相比，tau蛋白在Ser 199/202、Thr 205、Thr 217以及Ser 396位點的磷酸化明顯增加(P<0.001)，總tau蛋白表達(dá)沒有變化。CIG能夠顯著降低tau蛋白Ser 199/202、Thr 205、Thr 217以及Ser 396位點的磷酸化；CIG大劑量200 μg/mL對N2a細(xì)胞無明顯影響(圖3)。

2.4 CIG對Src轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞內(nèi)PTP1B蛋白表達(dá)的影響

PTP1B通過使PP2Ac酪氨酸307去磷酸化而激活PP2A。為了進(jìn)一步發(fā)掘CIG降低p-PP2Ac的作用機(jī)制，本實驗在Src轉(zhuǎn)染的N2a細(xì)胞內(nèi)，采用Western blotting方法檢測了PTP1B總蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示模型組與對照組相比，PTP1B蛋白表達(dá)無明顯變化，給予CIG后，PTP1B蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05，P<0.001)。CIG對正常細(xì)胞的PTP1B表達(dá)無影響(圖4)。

圖1 Src質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染條件的確定

Fig.1 To determine transfection conditions for Src plasmid

A and B: the expression level of Src，p-PP2Ac, PP2Ac, pS199/202, pS396 and tau5 in using Western blotting method； C, D and E: statistical results of Src，p-PP2Ac, PP2Ac, pS199/202, pS396.β-actin as internal control, and the control group was 100%. Results were shown as mean±SE,n=4,*P<0.05，**P<0.01 ，***P<0.001vscontrol; PP2Ac:protein phosphatase 2Ac；Con:control,untransfected group (blank control group); EV: empty vector, transfected empty vector GV386; WtSrc: wild type Src. Transfecting different quantity Src (0.2,0.4,0.6,0.8 μg)plasmid into N2a cells(Src plasmid and transfection reagent according to 1∶2 ratio).

圖2 CIG對Src轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞內(nèi)Src總蛋白、PP2Ac磷酸化的影響

Fig.2 Effects of CIG on Src total protein and PP2A phosphorylation in N2a cells transfected with Src

A：The cells overexpressed Src were incubated with different concentrations of CIG (50, 100, 200 μg/mL) for 24 h, then detected the expression of total Src protein，total PP2Ac and phosphorylation of PP2Ac. B and C: β-actin as internal control, and the control group was 100%. Statistical results of Src，p-PP2Ac and PP2Ac are shown as mean±SE.n=4;###P<0.001vscontrol,***P<0.001vsWtSrc;WtSrc: wild type Src; PP2Ac:protein phosphatase 2Ac; CIG:cornel iridoid glycoside.

圖3 CIG對Src轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞tau蛋白多個位點磷酸化的影響

Fig.3 Effects of CIG on multiple sites of tau phosphorylation in N2a cells transfected with Src

A：The cells overexpressed Src were incubated with different concentrations of CIG (50, 100, 200 μg/mL) for 24 h, then detected the expression of tau phosphorylation at the sites of Ser 199/202, Thr 205, Thr 217 and Ser 396;B:β-actin as internal control, and the control group was 100%. Statistical results of Ser 199/202、Thr 205、Thr 217 and Ser 396 were shown as mean±SE.n=4;###P<0.001vscontrol,***P<0.001vsWtSrc; WtSrc: wild type Src; CIG:cornel iridoid glycoside.

3 討論

微管相關(guān)蛋白tau與微管的組裝以及解聚密切相關(guān)，在AD的病理改變中，tau蛋白的過度磷酸化發(fā)揮了重要作用[12]。 蛋白酯酶活性上升，降低tau蛋白磷酸化，其中PP2A是使tau蛋白去磷酸化的主要蛋白酯酶[13]，活性比率高達(dá)近70%[14]。PP2A的活性受到催化亞基C酪氨酸307位點磷酸化修飾的調(diào)節(jié)，PP2Ac磷酸化，抑制PP2A活性，進(jìn)而tau發(fā)生過度磷酸化，導(dǎo)致神經(jīng)元纖維纏結(jié)的形成[15-17]。

Src是調(diào)節(jié)PP2Ac磷酸化的主要激酶，實驗中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染一定量Src，可使p-PP2Ac及p-tau 表達(dá)水平上升，這與文獻(xiàn)[7]報道的Src可使PP2A催化亞基C和tau蛋白磷酸化增加一致。但同時又發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Src轉(zhuǎn)染量繼續(xù)增加時，p-PP2Ac及p-tau的表達(dá)不再增加，反而有所降低，原因可能是當(dāng)Src蛋白表達(dá)到一定量后，對PP2Ac仍然發(fā)揮磷酸化作用，PP2Ac磷酸化短時間內(nèi)上調(diào)到一定程度，但由于PP2A在細(xì)胞內(nèi)作用廣泛，當(dāng)PP2Ac磷酸化修飾達(dá)到一定程度時，細(xì)胞立即啟動多種信號通路減弱其磷酸化[18]，使PP2A的活性得到部分恢復(fù)，進(jìn)而PP2A對tau蛋白的去磷酸化作用增強(qiáng)，tau蛋白過度磷酸化降低。此現(xiàn)象目前未見更多的相關(guān)報道，具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究探討。

本室前期研究[19]顯示，CIG能顯著降低PP2Ac磷酸化提高PP2A活性，Src在調(diào)節(jié)PP2Ac酪氨酸307位點的磷酸化中發(fā)揮重要作用[20-21]，為了明確CIG是否通過對Src的調(diào)節(jié)，上調(diào)PP2A活性，進(jìn)而抑制tau蛋白磷酸化。本實驗采取Src質(zhì)粒DNA瞬時轉(zhuǎn)染神經(jīng)細(xì)胞N2a的方法，Src蛋白表達(dá)增加，PP2Ac酪氨酸307位點磷酸化增加，且tau蛋白在Ser 199/202、Thr 205、Thr 217以及Ser 396位點的磷酸化明顯增加，以此模擬AD腦內(nèi)部分蛋白變化。結(jié)果顯示，CIG對Src蛋白無明顯調(diào)節(jié)作用，但能使p-PP2Ac下調(diào)，并且明顯降低tau蛋白在多個位點的磷酸化。由此推測，CIG可能通過作用于其他酶，抑制p-PP2Ac，提高PP2A活性。

圖4 CIG對Src轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞PTP1B蛋白表達(dá)的影響

Fig.4 Effects of CIG on the expression of PTP1B protein in N2a cells transfected with Src

A：The cells overexpressed Src were incubated with different concentrations of CIG (50, 100, 200 μg/mL) for 24 h, then detected the expression level of PTP1B total protein; B:β-actin as internal control, and the control group was 100%. Statistical results of PTP1B were shown as mean±SE,n=4,**P<0.01,***P<0.001vsWtSrc.CIG:cornel iridoid glycoside; PTP1B:protein tyrosine phosphatase 1B;WtSrc: wild type Src.

蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)主要存在于肝臟、腦等組織的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，是第一個從人體細(xì)胞中被分離出來的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶，能專一的水解蛋白質(zhì)中磷酸化的酪氨酸上的磷酸化基團(tuán)[22]。有研究[23]證實，上調(diào)PTP1B的mRNA和蛋白水平能降低PP2Ac 催化亞基C 307位點酪氨酸磷酸化。為了進(jìn)一步探究CIG降低PP2Ac催化亞基C磷酸化的具體作用機(jī)制，本實驗檢測了PTP1B的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CIG能顯著增加PTP1B的蛋白水平，證實了PTP1B對PP2Ac Y307位點磷酸化修飾的下調(diào)作用。

綜上，CIG抑制tau蛋白過度磷酸化的機(jī)制可能是通過上調(diào)PIP1B的蛋白表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)p-PP2Ac，提高PP2A活性，從而降低tau蛋白多個位點的磷酸化水平。本文將為研究CIG對AD治療的具體作用機(jī)制提供有意義的實驗依據(jù)。

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編輯 孫超淵

Regulatory mechanism ofCorneliridoidglycoside on protein phosphatase 2A catalytic subunit C phosphorylation

Li Xuelian1, 2，3，4，5，Yang Cuicui2，3，4，5，Zhang Lan2，3，4，5*，Shi Jingshan1*

(1.KeyLaboratoryforBasicPharmacologyofMinistryofEducation，ZunyiMedicalCollege，Zunyi563000，GuizhouProvince，China；2.DepartmentofPharmacology，XuanwuHospital，CapitalMedicalUniversity,Beijing100053，China; 3.BeijingInstituteforBrainDisorders,Beijing100053，China；4.BeijingEngineeringResearchCenterforNervousSystemDrugs,Beijing100053，China; 5.KeyLaboratoryforNeurodegenerativeDiseasesofMinistryofEducation，Beijing100053，China)

Objective To investigate the mechanism ofCorneliridoidglycoside (CIG) inhibiting tau phosphorylation by up-regulating protein phosphatase 2A (PP2A) activity. Methods ① To determine optimal transfection conditions: transfecting Src plasmid DNA (0.2, 0.4, 0.6, 0.8 μg) into mouse neuro-2A cell (N2a cells) was performed to observe the effects of different quantity Src on phosphorylation of PP2A catalytic subunit C and tau phosphorylation. ②After transfecting 0.6 μg Src plasmid DNA into N2a cells 24 hours，the cells were incubated with CIG (50, 100, 200 μg/mL) 24h，then the effects of CIG on Src, PTP1B, p-PP2Ac and tau phosphorylation were observed. Results ① Expression of Src protein was significantly increased, the expression of p-PP2Ac was up-regulated and the expression of PP2A did not change when Src (0.2, 0.4, 0.6 μg) plasmid transfected into N2a cells, and the tau phosphorylation at the sites of Ser 199 / 202, Ser 396 increased significantly; In the N2a cells transfected with 0.8 μg Src, the expression of p-PP2Ac was increased apparently, the expression of PP2A was not changed, and the phosphorylation of tau at Ser 199 / 202 and Ser 396 sites was decreased. ② In the N2a cells transfected with 0.6 μg Src, the expression of Src was significantly increased, the expression of p-PP2Ac was significantly increased, and the tau phosphorylation at the sites of Ser 199 / 202, Thr 205, Thr 217 and Ser 396 sites increased significantly; CIG could inhibit the expression of p-PP2Ac, the expression of tau phosphorylation at the sites of Ser 199 / 202, Thr 205, Thr 217, and Ser 396. In addition, CIG can up-regulate PTP1B protein expression. Conclusion CIG had no obvious regulation effect on Src, but it could decrease the phosphorylation of PP2A catalytic subunit C by increasing the expression of PTP1B, and then increases the activity of PP2A, and further reduces the level of tau hyperphosphorylation. The inhibition of CIG on tau hyperphosphorylation, will bring broad application prospects on the treatment of AD.

Corneliridoidglycoside；protein tyrosine kinase Src; protein phosphatase 2A；protein tyrosine phosphatase 1B; tau protein； Alzheimer’s disease

國家自然科學(xué)基金(81473373)，北京市自然科學(xué)基金(7132110)，“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2015ZX09101016001)，北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才(2014-2-014)，北京市新世紀(jì)百千萬人才工程(008-0014)，北京市教委新醫(yī)藥學(xué)科群(XK100270569)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81473373)，Natural Science Foundation of Beijing(7132110)，Major Project for Essential Drug Research and Development(2015ZX09101016001)，Beijing Health and Technical High-level Personal Plan(2014-2-014)，Beijing New Century Talented Person Project(008-0014)，New Medical Disciplines Project of Beijing Education Committee(XK100270569).

時間：2016-12-14 20∶10

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20161214.2010.014.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.06.012]

R 96

2016-10-14)

*Corresponding authors， E-mail：lanizhg@hotmail.com；shijs@zmc.edu.cn