閆 斌, 哈斯魯, 買合木提·亞庫甫, 侯彥杰,徐 超, 伊力哈木·托合提

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊, 830063)

?

缺血預(yù)處理在肢體再灌注損傷中的保護(hù)作用及一氧化氮、內(nèi)皮素1的變化

閆 斌, 哈斯魯, 買合木提·亞庫甫, 侯彥杰,徐 超, 伊力哈木·托合提

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊, 830063)

目的 分析無創(chuàng)性肢體缺血預(yù)處理(IPC)對肢體缺血再灌注損傷的干預(yù)效果以及NO和ET-1的變化。方法 30只大鼠隨機(jī)均分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，對照組未經(jīng)過缺血預(yù)處理，直接止血2、3、4 h; 實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過缺血預(yù)處理后，于第2天分別止血2、3、4 h。依次于恢復(fù)肢體血流(再灌注)后1、3、7、14 d時(shí)抽取血液檢測ET-1、NO的水平。結(jié)果 大鼠體內(nèi)NO和ET-1在第1、3、7、14天內(nèi)呈先遞增后遞減的趨勢，實(shí)驗(yàn)組NO在第3天缺血4 h時(shí)達(dá)最大值，對照組NO在第7天缺血2 h時(shí)達(dá)高峰；實(shí)驗(yàn)組ET-1在第7天缺血3h時(shí)達(dá)最大值，對照組ET-1在第3天4 h時(shí)達(dá)最大值，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組NO在大鼠血液中第1、3、7天的含量在缺血2 h和3 h時(shí)均顯著低于對照組(P<0.01); 第14天時(shí)，僅缺血2 h時(shí)顯著低于對照組(P<0.01); 實(shí)驗(yàn)組ET-1在大鼠血液中第1、3、7天的含量在缺血各時(shí)間段時(shí)均顯著低于對照組(P<0.01); 第14天時(shí)，僅缺血3 h時(shí)顯著低于對照組(P<0.01)。結(jié)論 缺血預(yù)處理改變了缺血再灌注損傷后血清NO與ET-1的水平。

缺血預(yù)處理; 再灌注損傷; 肢體; 一氧化氮、內(nèi)皮素-1

缺血再灌注可引起全身器官及局部不良反應(yīng)，即肢體缺血再灌注(LIR)損傷，這種損傷包括缺血期原發(fā)性損傷和再灌注期繼發(fā)性損傷，自由基在再灌注損傷中起著重要作用。缺血預(yù)處理是短期缺血應(yīng)激使機(jī)體對隨后長時(shí)間的缺血再灌注損傷產(chǎn)生明顯保護(hù)作用的一種適應(yīng)性機(jī)制[1], 可以影響體內(nèi)的自由基代謝，增強(qiáng)組織對缺血的耐受性。內(nèi)皮素(ET)和一氧化氮(NO)是血管內(nèi)皮分泌的血管活性因子，ET是最強(qiáng)烈的縮血管因子，對人體各臟器都有明顯的縮血管作用[2]; NO為一種血管舒張因子，在調(diào)節(jié)血管張力、改善血液循環(huán)等方面有著獨(dú)特的作用[3]。研究[4]顯示，大鼠缺血再灌注后發(fā)生骨骼肌損傷與機(jī)體活性氧產(chǎn)生增多及清除酶活性下降有關(guān)，且以再灌注4 h左右為重，NO在再灌注后減輕了LIR損傷，對骨骼肌有保護(hù)作用，ET可能通過促進(jìn)氧自由基的生成和引起中性粒細(xì)胞的聚集參與了缺血再灌注后的骨骼肌損傷。本文觀察ET和NO在大鼠肢體不同缺血時(shí)間的變化以及缺血預(yù)處理后的變化，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Rat白細(xì)胞介素6 ELisa Kit試劑盒(貨號: 201411; 批號: E-30644), Rat 白細(xì)胞介素8 ELisa Kit試劑盒(貨號: 201411; 批號: E-30581)均購自abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

健康SD大鼠30只，體質(zhì)量150～200 g, 雌雄不限；隨機(jī)分為缺血實(shí)驗(yàn)組(實(shí)驗(yàn)組)和對照組各15只，每組再分為缺血2、3、4 h小組，每小組5只。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)組缺血預(yù)處理：左后腿脫毛，在大腿根部應(yīng)用特制的氣囊止血帶(長12 cm, 寬2 cm), 充氣壓力為40 kPa, 妥善固定10 min, 造成肢體缺血。充氣止血帶放氣10 min, 形成肢體缺血再灌注預(yù)處理過程后，反復(fù)3次，于次日再分別持續(xù)缺血2、3、4 h; 對照組分別直接持續(xù)缺血2、3、4 h。1.3.2 雙下肢缺血再灌注模型的制作: 25 mg/kg的戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉，大鼠仰臥，腹部硫化鋇脫毛，消毒鋪巾，進(jìn)行無菌手術(shù)操作。取下腹正中切口，長約2～3 cm, 切開皮膚、皮下，自中線切開腹部肌肉和腹膜，鹽水紗布將腸推向兩側(cè)，縱行剪開后腹膜，暴露出腹主動脈和后腔靜脈。在腹主動脈分出雙側(cè)髂總動脈處以近約1 cm范圍內(nèi)，10倍手術(shù)顯微鏡下仔細(xì)分離開腹主動脈和下腔靜脈[5]。用顯微血管夾阻斷腹主動脈血流，可用手指捫及其遠(yuǎn)端撥動情況予以證實(shí)，關(guān)腹。4 h后開腹取出血管夾，恢復(fù)血流2或24 h。1.3.3 血清NO和ET-1的檢測：缺血后放松止血帶恢復(fù)肢體血流，依次于恢復(fù)肢體血流(再灌注)后1、3、7、14 d時(shí)抽取血液，取血清標(biāo)本進(jìn)行血清NO和ET-1檢測，標(biāo)本置于4℃下, 4 000 r/min離心10 min, 分離血清并置于-80℃冰箱中保存。應(yīng)用酶聯(lián)免疫原理檢測標(biāo)本檢測NO和ET-1, 嚴(yán)格按照說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 不同時(shí)間段2組不同處理時(shí)間NO和ET-1的變化

無論止血時(shí)間長短，大鼠體內(nèi)NO和ET-1在第1、3、7、14天內(nèi)呈先遞增、后遞減的趨勢，實(shí)驗(yàn)組NO在第3天缺血4 h時(shí)達(dá)最大值，對照組NO在第7天缺血2 h時(shí)達(dá)高峰；實(shí)驗(yàn)組ET-1在第7天缺血3 h時(shí)達(dá)最大值，對照組ET-1在第3天4 h時(shí)達(dá)最大值，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2。

2.2 2組NO水平和ET-1水平的比較

實(shí)驗(yàn)組大鼠血液中NO在第1、3、7天缺血2 h和3 h時(shí)的含量均顯著低于對照組(P<0.01); 第14天時(shí)，僅缺血2 h時(shí)顯著低于對照組(P<0.01); 其他時(shí)點(diǎn)缺血時(shí)間各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。實(shí)驗(yàn)組大鼠血液中ET-1在第1、3、7天缺血各時(shí)間的含量段時(shí)均顯著低于對照組(P<0.01); 第14天時(shí)，僅缺血3 h時(shí)顯著低于對照組(P<0.01); 缺血2 h和4 h時(shí)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表1 實(shí)驗(yàn)組不同處理時(shí)間大鼠炎性因子的變化情況

表2 對照組不同處理時(shí)間大鼠炎性因子的變化情況

表3 相同時(shí)間段預(yù)處理組和對照組NO水平的比較

與對照組比較, **P<0.01。

表4 相同時(shí)間段預(yù)處理組和對照組ET-1水平比較

與對照組比較, **P<0.01。

3 討 論

及時(shí)恢復(fù)充足的血液供應(yīng)是肢體缺血組織成活的關(guān)鍵，但是缺血組織再灌注又可導(dǎo)致缺血組織的進(jìn)一步損傷，這即是缺血再灌注損傷(IR損傷)。大量研究[6]表明，氧自由基產(chǎn)生的增加及其誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是引起骨骼肌缺血再灌注損傷的重要原因。研究表明，機(jī)體多種細(xì)胞在多種應(yīng)激因素作用下既可以上調(diào)對誘導(dǎo)型NOS的表達(dá)，使NO產(chǎn)生增多，又可以上調(diào)對誘導(dǎo)型HO的表達(dá)，并產(chǎn)生大量NO, NO是中藥氣體信使分子，又是很強(qiáng)的自由基。研究[7]表明它既具有抑制炎性和氧化應(yīng)激性損傷的作用，又具有介導(dǎo)此類損傷的作用。目前，對NO在骨骼肌缺血再灌注中的作用仍有爭論。有研究認(rèn)為作為一種自由基, NO具有氧化還原特性, NO可加重骨骼肌缺血再灌注損傷；也有研究[8]顯示，左旋精氨酸源性NO可減輕骨骼肌、腎、肝、心、腦缺血再灌注損傷。孫永新等[9]研究缺血預(yù)處理(IPC)對大鼠骨骼肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及一氧化氮(NO)是否參與此保護(hù)作用，采用Wistar雌性大鼠，在左后肢跟部止血，同時(shí)使用血流監(jiān)測儀測股四頭肌的血流量，調(diào)整止血帶的松緊程度，使血流量控制在上止血帶前的30%，缺血再灌注組出現(xiàn)明顯肌纖維破裂溶解，許多白細(xì)胞浸潤，電鏡下線粒體中含有大量空泡變性、肌纖維斷裂、溶解和“Z線”排列整齊膜脂質(zhì)過氧化物的增加。與缺血再灌注組相比，缺血預(yù)處理組顯示了輕微的損害，正常的纖維和血管變形少，股四頭肌各型肌纖維橫截面積降低，細(xì)胞膜Ca2+-ATPase數(shù)量增加。實(shí)驗(yàn)認(rèn)為缺血預(yù)處理對大鼠骨骼肌缺血再灌注損傷有明顯保護(hù)作用，NO參與這一保護(hù)作用。

內(nèi)皮內(nèi)素(ET)作為調(diào)節(jié)心血管功能的重要因子，在局部通過特異性受體參與調(diào)節(jié)機(jī)體的許多生理活動及炎癥反應(yīng)，對維持基礎(chǔ)血管張力與心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)有重要作用。其中內(nèi)皮素-1(ET-1)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)[10], 其引起的血管收縮、代謝紊亂和細(xì)胞增殖是與血管損傷有關(guān)疾病的共同致病因素。臨床及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)ET-1可能參與心肌缺血再灌注損傷，心肌缺血再灌注時(shí)，可引起心肌細(xì)胞膜上ET-1結(jié)合點(diǎn)密度增加。ET-1促進(jìn)心臟缺血再灌注損傷的機(jī)制與心肌膜上 ET-1 受體上調(diào)、促進(jìn)胞內(nèi)鈣超載、PMN 聚集、黏附、氧自由基釋放及內(nèi)皮細(xì)胞自穩(wěn)態(tài)失衡有關(guān)。高洪波等[11]觀察肢體缺血預(yù)適應(yīng)對大鼠肢體缺血再灌注后血漿和肺組織NO/ET-1比值的影響，結(jié)果顯示LIR組血漿及肺組織的NO/ET-1比值明顯減小；與LIP組比較，IPC組血漿及肺組織的NO/ET-1比值明顯增大。說明缺血預(yù)適應(yīng)可以調(diào)節(jié)肢體缺血再灌注后NO/ET-1比值失平衡而使組織損傷減輕。梁瑛琦等[12]實(shí)驗(yàn)觀察一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(ET)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)在家兔肝缺血/再灌注損傷過程中的變化，認(rèn)為缺血/再灌注導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂，即NO水平下降和ET水平升高，其在肝缺血/再灌注發(fā)生發(fā)展中起介導(dǎo)作用。

缺血預(yù)處理可以使肢體再缺血前經(jīng)歷短暫預(yù)適應(yīng)過程能明顯減輕長時(shí)間缺血后的再灌注損傷，這種保護(hù)作用不僅局限于肢體，對遠(yuǎn)程內(nèi)臟器官再灌注損傷亦有很大作用[13]。本研究顯示，經(jīng)過缺血預(yù)處理后，大鼠血液中ET-1和NO均顯著降低，基本隨著缺血時(shí)間的時(shí)間增加而增加，在第1、3、7天的含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而14 d時(shí)，差異較小。實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，通過缺血預(yù)處理的方式可調(diào)節(jié)血液中的ET-1及NO含量，進(jìn)而減輕缺血再灌注損傷，但預(yù)處理的最佳間隔時(shí)間和處理適應(yīng)次數(shù)尚有待于進(jìn)一步研究。

[1] 谷海, 馬駿. NO對器官缺血再灌注損傷保護(hù)作用研究進(jìn)展[J]. 安徽衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào), 2012, 11(5): 85-86.

[2] Schneider R, Meusel M, Betz B. Nitric oxide-induced regulation of renal organic cation transport afterrenal ischemia-reperfusion injury[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2011, 301(5): F997-F1004.

[3] Hougaard KD, Hjort N, Zeidler D, et al. Remote isehemic pereonditioning as an adjunct therapy to thrombolysis in pa-tients with acute ischemic stroke: a randomized trial[J]. Stroke, 2014, 45(1): 159-167.

[4] Fraser PA. The role of free radical generation in increasing cerebrovascular permeability[J]. Free Radic Biol Med, 2011, 51(5): 967-977.

[5] Takhtfooladi H, Takhtfooladi M, Moayer F, et al. Melatonin attenuates lung injury in a hind limb ischemia-reperfusion rat model[J]. Rev Port Pneumol, 2015, 21(1): 30-5.

[6] 趙林靜, 趙俊強(qiáng), 楊保勝, 等. 肢體缺血預(yù)處理大鼠肝損傷保護(hù)效應(yīng)中內(nèi)皮素1的變化和意義[J]. 中國組織工程研究, 2012, 16(31): 5843-5847.

[7] 海廣范, 崔泰震, 牛秉軒, 等. nmhaFGF對大鼠腎臟缺血-再灌注ET-1和NO的影響[J]. 江蘇醫(yī)藥, 2010, 35(6): 676-678.

[8] Eltzschig HK, Eckle T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation[J]. Nat Med, 2011, 17(11): 1391-1401.

[9] 孫永新, 徐愛華, 楊楊, 等. NO參與缺血預(yù)處理對大鼠骨骼肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J]. 解剖科學(xué)進(jìn)展, 2014, 19(3): 225-228.

[10] Jesmin S, Yamaguchi N, Zaedi S, et al. Time-dependent expres-sion of endothelin-1 in lungs and the effects of TNF-αblockingpeptide on acute lung injury in an endotoxemic rat model[J]. Bi-omed Res, 2011, 32(1): 9-17.

[11] 高洪波, 郭文斌, 張連元, 等. 預(yù)適應(yīng)對肢體缺血再灌注后血漿和肺組織NO/ET-1的影響[J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥, 2014, 33(15): 113-114.

[12] 梁瑛琦, 鄭艷容, 王萬鐵, 等. 人參多糖對家兔肝缺血/再灌注一氧化氮和內(nèi)皮素的影響[J]. 肝膽胰外科雜志, 2009, 21(1): 24-26.

[13] 王良榮, 鄭瀏璞, 蔣柳明, 等. 無創(chuàng)性缺血預(yù)處理對肢體缺血再灌注性肺換氣功能損傷及一氧化氮/內(nèi)皮素-1失衡的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 25(2): 322-326.

Protective effect of ischemic preconditioning on reperfusion injury of limbs and changes of nitric oxide and endothelin 1

YAN Bin, Hasilu, Maihemuti·Yakufu, HOU Yanjie, XU Chao, Yilihamu·Tuoheti

(SecondAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi,Xinjiang, 830063)

Objective To analyze the interventional effect of non-invasive limb ischemic preconditioning (IPC) on ischemia reperfusion injury and the changes of endothelin-1 and NO. Methods A total of 30 rats were randomly divided into control group and experimental group. The control group was not treated with ischemic preconditioning but with direct hemostasis at 2, 3 and 4 h. The experimental group was treated with ischemic preconditioning and hemostasis at 2, 3 and 4 h on the second day. ET-1, NO levels at 1, 3, 7, 14 days after restore the blood flow (reperfusion) were detected. Results NO in vivo in rats and ET-1 in the first 1, 3, 7, 14 days increased and then decreased. NO in the experimental group at 4 h after ischemia on the third day reached a maximum value, and NO in the control group 2 h after ischemia on 7thday reached a peak value. In the experimental group, ET-1 3 h after ischemic on the 7thday reached the maximum value, and in the control group ET-1 reached the maximum 4 h after ischemic on the third day (P<0.05). NO in the blood of rats in the experimental group 2 h and 3 h after ischemic on the first, third and seventh days were significantly lower than those in the control group (P<0.01). On 14thday, NO 2 h after ischemia was significantly lower than the control group (P<0.01). In the experimental group, ET-1 in the blood on 1st, 3rd, 7thdays in each ischemia time were significantly lower than those in the control group (P<0.01), and on the 14thday, ET-1 3 h after ischemic was significantly lower than the control group (P<0.01). Conclusion Ischemic preconditioning can change serum NO and ET-1 levels after ischemia-reperfusion injury.

ischemic preconditioning; reperfusion injury; limb; nitric oxide; endothelin-1

2016-10-10

新疆醫(yī)科大學(xué)2013年科研創(chuàng)新基金項(xiàng)目(XJC201368)

伊力哈木·托合提

R 541

A

1672-2353(2016)24-032-04

10.7619/jcmp.201624009