侯鵬超 洪郁芝 葉迅

雷公藤內(nèi)酯醇和纈沙坦對(duì)高糖誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞活性的影響

侯鵬超 洪郁芝 葉迅

目的 觀察不同濃度高糖對(duì)小鼠足細(xì)胞活性的抑制作用，以及不同濃度雷公藤內(nèi)酯醇（TP）和纈沙坦（Val）對(duì)高糖抑制后小鼠足細(xì)胞活性的影響，探討高糖對(duì)足細(xì)胞的損傷作用，以及有效的藥物干預(yù)濃度范圍。方法 將培養(yǎng)成熟的小鼠足細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組（11.1mmol/L葡萄糖）和不同濃度高糖組（16.1、21.1、26.1、31.1、36.1mmol/L），以上述濃度培養(yǎng)48h后采用CCK-8檢測(cè)足細(xì)胞活性的變化。取活性變化最大的濃度為高糖誘導(dǎo)濃度，在此基礎(chǔ)上隨機(jī)分為不同濃度的TP組（4、8、16、32、64ng/ml）和Val組（2×10-8、2×10-7、2×10-6、2×10-5、2×10-4mol/L），以上述濃度干預(yù)48h后，采用CCK-8檢測(cè)足細(xì)胞活性的變化。結(jié)果 （1）與對(duì)照組相比，除16.1mmol/L高糖組外，其余各高糖組的足細(xì)胞活性顯著減少，其中以26.1mmol/L葡萄糖組減少最為明顯（P＜0.01）。（2）與26.1mmol/L葡萄糖組相比，TP組（除4ng/ml組外）和Val組（除2×10-8mol/L組外）足細(xì)胞活性部分恢復(fù)，其中以16ng/ml TP組和2×10-5mol/L Val組足細(xì)胞活性恢復(fù)最為明顯（P＜0.01）。結(jié)論 一定濃度范圍的TP和Val可部分恢復(fù)受高糖抑制的小鼠足細(xì)胞活性。

高糖 雷公藤內(nèi)酯醇 纈沙坦 足細(xì)胞 活性干預(yù) CCK-8

糖尿病腎病（DN）是糖尿病重要的微血管并發(fā)癥之一，蛋白尿是DN的主要臨床表現(xiàn)和獨(dú)立進(jìn)展因素，因此蛋白尿的發(fā)病機(jī)制一直是DN研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。近年來(lái)腎小球?yàn)V過(guò)膜最外層足細(xì)胞逐漸引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT）是指足細(xì)胞在高糖等有害刺激誘導(dǎo)下，可由上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[1-2]，從而改變形態(tài)、活性和功能。目前觀點(diǎn)認(rèn)為足細(xì)胞EMT是導(dǎo)致DN蛋白尿的一個(gè)重要原因，而雷公藤內(nèi)酯醇（TP）和纈沙坦（Val）可能具有抑制足細(xì)胞EMT，從而減輕蛋白尿的作用[3-4]。本研究探討TP和Val兩種藥物對(duì)高糖誘導(dǎo)下小鼠足細(xì)胞活性的影響，并試圖尋求藥物的最佳干預(yù)濃度，為后續(xù)進(jìn)行機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 小鼠足細(xì)胞由英國(guó)倫敦大學(xué)國(guó)王學(xué)院Guy’s醫(yī)院贈(zèng)送；Val原粉（2g/瓶）由瑞士諾華公司惠贈(zèng)，TP原粉購(gòu)自南京澤朗生物技術(shù)有限公司（10g/瓶，批號(hào)：ZL111012R）。RPMI 1640雙抗培養(yǎng)基，F(xiàn)BS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，使用時(shí)分別配置成含10%FBS的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，不含F(xiàn)BS的同步化培養(yǎng)基及含2.5%FBS的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基；葡萄糖購(gòu)自日本大冢制藥公司；CCK-8購(gòu)自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；Heracell 240i細(xì)胞培養(yǎng)箱，Denley Dragon酶標(biāo)儀為美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 足細(xì)胞培養(yǎng) 液氮罐中凍存的小鼠足細(xì)胞復(fù)蘇后，置于5%CO2培養(yǎng)箱中33℃進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶除加入10%FBS的生長(zhǎng)培養(yǎng)基5ml外，同時(shí)加入γ-干擾素500U。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%以上，加入胰蛋白酶室溫下消化1～2min，待細(xì)胞變圓、間隙增寬時(shí)，終止消化，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)基不變，但不含γ-干擾素）使之分化成熟。37℃培養(yǎng)14～20d后，足細(xì)胞胞體變大，產(chǎn)生較多粗厚交錯(cuò)的足突，成為分化成熟的“樹枝狀”足細(xì)胞。

1.2.2 足細(xì)胞CCK-8檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的確定 將分化成熟且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的“樹枝狀”足細(xì)胞，按照以下數(shù)量接種于96孔板，1×103、2×103、4×103、8×103、10×103、20×103、40×103、80×103、100×103個(gè)/孔，各濃度均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔培養(yǎng)12h待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，吸走培養(yǎng)基，每孔加入含10%的CCK-8培養(yǎng)基100μl，分別孵育1、2、3、4h測(cè)OD450值。以每孔細(xì)胞數(shù)為橫坐標(biāo)，以去背景OD450值為縱坐標(biāo)，獲得細(xì)胞增殖標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定CCK-8檢測(cè)的最佳細(xì)胞數(shù)和時(shí)間。

1.2.3 高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞的活性測(cè)定 按照1.2.2結(jié)果，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的足細(xì)胞以10×103個(gè)/孔數(shù)量接種于96孔板，培養(yǎng)12h待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，用同步化培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12h，再換用含有以下濃度葡萄糖的培養(yǎng)基，即11.1（對(duì)照組）、16.1、21.1、26.1、31.1、36.1mmol/L誘導(dǎo)48h，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。吸走培養(yǎng)基后，每孔加入含10%CCK-8的培養(yǎng)基100μl，按照1.2.2結(jié)果孵育3h后測(cè)定OD450值，來(lái)明確高糖對(duì)足細(xì)胞活性的抑制作用，并獲得高糖的最佳誘導(dǎo)濃度。

1.2.4 TP或Val對(duì)高濃度葡萄糖環(huán)境下足細(xì)胞活性的影響 Val原粉以二甲基亞砜和無(wú)菌注射用水稀釋后配置成4ng/μl溶液，再稀釋成各實(shí)驗(yàn)濃度；TP原粉以二甲基亞砜和無(wú)菌注射用水稀釋后配置成4×10-2mol/L溶液，再稀釋成各實(shí)驗(yàn)濃度。足細(xì)胞接種培養(yǎng)同1.2.2，依據(jù)1.2.3的結(jié)果選用26.1mmol/L的高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)，并添加不同濃度TP或Val作為實(shí)驗(yàn)組。TP組設(shè)置T1、T2、T3、T4、T5組，TP濃度分別為4、8、16、32、64ng/ml；Val組設(shè)置V1、V2、V3、V4、V5組，Val濃度為2×10-8、2×10-7、2× 10-6、2×10-5、2×10-4mol/L。每個(gè)濃度均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，干預(yù)48h后，按照1.2.2結(jié)果孵育3h，測(cè)定OD450值。同時(shí)按照1.2.3結(jié)果設(shè)置高糖模型對(duì)照組（MC組，葡萄糖濃度為26.1mmol/L）和正常對(duì)照組（NC組，葡萄糖濃度為11.1mmol/L），獲得藥物最佳干預(yù)濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示；多組間比較采用單因素F檢驗(yàn)；組間兩兩比較，方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)。兩變量間相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 足細(xì)胞CCK-8檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的確定 以每孔細(xì)胞數(shù)為橫坐標(biāo)，去背景OD450值為縱坐標(biāo)，獲得小鼠足細(xì)胞增殖標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果提示孵育3h，細(xì)胞數(shù)量10×102個(gè)～10×103個(gè)時(shí)，每孔細(xì)胞數(shù)目和去背景OD450值相關(guān)性最強(qiáng)（r=0.9995，P＜0.01），考慮后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要干預(yù)48h，細(xì)胞需要維持一定數(shù)量，故以10×103個(gè)/孔接種最為合適，見(jiàn)圖1。

圖1 足細(xì)胞增殖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同濃度葡萄糖對(duì)足細(xì)胞活性的抑制作用 與NC組（11.1mmol/L葡萄糖組）相比，16.1mmol/L葡萄糖組足細(xì)胞活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其余各組足細(xì)胞活性均顯著下降（P＜0.05或0.01），其中以26.1、31.1mmol/L葡萄糖組下降最明顯（均 P＜0.01）；而26.1、31.1mmol/L葡萄糖組間比較，26.1mmol/L組下降更明顯（P＜0.05）；36.1mmol/L組足細(xì)胞活性出現(xiàn)明顯的反跳現(xiàn)象，與31.1mmol/L組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），見(jiàn)表1。由此得出后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的最佳葡萄糖糖誘導(dǎo)濃度為26.1mmol/L。

表1 不同濃度葡萄糖對(duì)足細(xì)胞活性的抑制作用

2.3 TP或Val對(duì)高濃度葡萄糖環(huán)境下足細(xì)胞活性的影響 與MC組比較，T1組足細(xì)胞活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其余各組足細(xì)胞活性均有不同程度增加，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或0.01），其中以T3、T4組增加最顯著（均P＜0.01）；而T3、T4組間比較，T3組增加更明顯（P＜0.05）。但與NC組比較，TP各濃度組足細(xì)胞活性尚未完全恢復(fù)（P＜0.05或0.01），見(jiàn)表2。

表2 TP或Val對(duì)高濃度葡萄糖環(huán)境下足細(xì)胞活性的影響

與MC組相比，V1組足細(xì)胞活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其余各組均有不同程度增加，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或0.01）；與V3組比較，V4組升高更明顯（P＜0.01），V5組則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與NC組比較，Val各濃度組足細(xì)胞活性尚未完全恢復(fù)（P＜0.05或0.01），見(jiàn)表2。由此得出最佳TP干預(yù)濃度為16ng/ ml，最佳的Val干預(yù)濃度為2×10-5mol/L。

3 討論

足細(xì)胞EMT已經(jīng)成為DN蛋白尿研究中的熱點(diǎn)，若能研究清楚并有效阻斷該過(guò)程，將為DN蛋白尿的防治開(kāi)辟嶄新的前景。近來(lái)的研究顯示，高濃度葡萄糖可以激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）并通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)通路介導(dǎo)足細(xì)胞EMT的發(fā)生，并負(fù)反饋抑制Smad7的表達(dá)；同時(shí)檢測(cè)到足細(xì)胞EMT發(fā)生的證據(jù)，即上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白如足細(xì)胞裂孔膜蛋白（nephrin和podocin）、腎病樣蛋白1抗體（NEPH1）、緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1等的表達(dá)減少，以及間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白desmin、纖維連接蛋白（FN）、整合素連接激酶（ILK）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）等表達(dá)增加[1，5]。發(fā)生EMT的足細(xì)胞，首先表現(xiàn)為足突減少、融合增加，其次細(xì)胞活性下降，導(dǎo)致與腎小球基底膜（GBM）的黏附作用下降而損傷濾過(guò)膜，形成早期蛋白尿；而長(zhǎng)期的高濃度葡萄糖刺激除了加重足細(xì)胞EMT，還可直接導(dǎo)致足細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡[6]。目前認(rèn)為足細(xì)胞EMT是早期和可逆的過(guò)程，因此阻斷該信號(hào)通路，將會(huì)有效緩解或逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞EMT，從而可以減輕濾過(guò)膜損傷，防止蛋白尿的發(fā)生[7]。一些證據(jù)顯示TP和Val可能與足細(xì)胞EMT和TGF-β/ Smad信號(hào)通路關(guān)系密切。

TP具有強(qiáng)烈的抗炎和免疫抑制作用，研究認(rèn)為DN蛋白尿的進(jìn)展是一種炎癥反應(yīng)，而且可被TP抑制，既往研究中已經(jīng)獲得了較多的證實(shí)，目前認(rèn)為其具體機(jī)制可能與抑制足細(xì)胞EMT有關(guān)。已有小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TP治療后足細(xì)胞原本稀少的足突再次變得粗厚茂密，而與足細(xì)胞EMT相關(guān)的足細(xì)胞裂孔膜蛋白（nephrin和podocin）的表達(dá)和分布都出現(xiàn)了不同程度增加，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白desmin則明顯減少[4]。在另一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了TP通過(guò)降低腎臟組織中巨噬細(xì)胞的堆積和滲透從而減輕足細(xì)胞的損傷和凋亡，并能減少骨橋蛋白和TGF-β1的表達(dá)[8]。以上研究結(jié)果均顯示了TP參與了抑制足細(xì)胞EMT的過(guò)程，但仍缺乏體外實(shí)驗(yàn)相關(guān)證據(jù)，其作用機(jī)制是否與TGF-β/Smad信號(hào)通路有關(guān)尚未完全明了。

作為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，Val一直被認(rèn)為是通過(guò)血壓控制降低腎小球內(nèi)壓和濾過(guò)率下降速度，從而起到減輕DN蛋白尿和保護(hù)腎臟的作用，但目前認(rèn)為其可能存在降壓效果以外的降低蛋白尿的機(jī)制[9]。在高血壓合并DN的大鼠實(shí)驗(yàn)中，觀察不同劑量的Val對(duì)大鼠血壓和蛋白尿的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Val超過(guò)120 mg/（kg·d）時(shí)，大鼠血壓不再進(jìn)一步下降，而蛋白尿卻持續(xù)減低[10]。同時(shí)在Val治療具有進(jìn)行性蛋白尿表現(xiàn)的單腎切除DN小鼠時(shí)，不但顯示蛋白尿減少，還出現(xiàn)了腎臟纖維化相關(guān)因子血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）、FN、Ⅳ型膠原、TGF-β1等的表達(dá)減低，而足細(xì)胞EMT相關(guān)的足細(xì)胞裂孔膜蛋白（nephrin和podocin）表達(dá)明顯增加[9]。但Val的作用機(jī)制是否與抑制足細(xì)胞EMT和參與TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)仍缺乏相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究從細(xì)胞活性角度顯示TP和Val可逆轉(zhuǎn)發(fā)生了EMT的足細(xì)胞活性。實(shí)驗(yàn)采用CCK-8檢測(cè)方法，根據(jù)試劑生成甲臜物數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，獲取去背景OD450值反映足細(xì)胞活性，并通過(guò)組間比較明確藥物干預(yù)作用，并取得最佳干預(yù)濃度。本法試劑單一，方便快速，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，靈敏度和重復(fù)性高于MTT法。

高濃度葡萄糖誘導(dǎo)研究發(fā)現(xiàn)，高濃度葡萄糖可促使足細(xì)胞活性下降，但隨著葡萄糖濃度的增高，足細(xì)胞活性產(chǎn)生波動(dòng)。與NC組相比，26.1、31.1mmol/L組足細(xì)胞活性明顯下降，且兩者中以26.1mmol/L組下降更明顯。與NC組比較，36.1mmol/L組足細(xì)胞活性仍呈下降趨勢(shì)，但與31.1mmol/L組比較，足細(xì)胞活性反而出現(xiàn)了明顯回升，可能與足細(xì)胞對(duì)高濃度葡萄糖發(fā)生耐受有關(guān)。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇26.1mmol/L作為高濃度葡萄糖的干預(yù)濃度最具有意義。

藥物干預(yù)研究發(fā)現(xiàn)，TP和Val都可不同程度逆轉(zhuǎn)高濃度葡萄糖抑制的足細(xì)胞活性。與MC組相比，T3、T4、V3、V4、V5各組足細(xì)胞活性都有明顯恢復(fù)；而T3、T4兩組間比較，T3恢復(fù)更好；V3、V4、V5各組間比較，V4組恢復(fù)更好。與T4組相比，T5組出現(xiàn)了恢復(fù)減低；與T3組比較，T4組比恢復(fù)減低，這提示了TP逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞活性的作用存在閾值，T3附近即是轉(zhuǎn)折點(diǎn)，超過(guò)轉(zhuǎn)折點(diǎn)濃度后足細(xì)胞活性反而降低，間接說(shuō)明了雷公藤類藥物可能具有濃度依賴的不良反應(yīng)。同樣V3組和V5組無(wú)差異，與V4組相比足細(xì)胞活性恢復(fù)減低，提示V4附近存在轉(zhuǎn)折點(diǎn)。與NC組相比，各藥物組細(xì)胞活性尚未完全恢復(fù)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，筆者認(rèn)為TP濃度在8～64ng/ml和Val濃度在2×10-7～2×10-4mol/L為有效干預(yù)濃度范圍，其中以TP 16ng/ml和Val 2×10-5mol/L為最適干預(yù)濃度，但是TP和Val均可能存在濃度依賴的不良反應(yīng)，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究從足細(xì)胞活性角度表明，一定濃度范圍的TP和Val可部分逆轉(zhuǎn)高濃度葡萄糖抑制的小鼠足細(xì)胞活性，提示其對(duì)足細(xì)胞具有靶向保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究足細(xì)胞EMT和TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)因子提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Impact of triptolide and valsartan on inhibition of mouse podocyte activity induced by high glucose

HOU Pengchao,HONG Yuzhi, YE Xun.Department of Endocrinology,Guangxing Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medicine University (Hangzhou Traditional Chinese Medical Hospital),Hangzhou 310007,China

Objective To investigate the impact of triptolide (TP)and valsartan (Val)on the inhibition of mouse podocyte activity induced by high glucose. Methods Matured mouse podocytes were cultured and randomly divided into control group (11.1mmol/Lglucose)and different high glucose groups(16.1,21.1,26.1,31.1 and 36.1mmol/Lglucose,respectively).Changes of podocyte activity were detected by CCK-8 after 48h incubated with different concentrations of glucose,and the appropriate concentration of glucose was screened.Then matured podocyte were randomly divided into different TP groups(4,8,16,32 and 64ng/ml TP,respectively)and Val groups(2×10-8,2×10-7,2×10-6,2×10-5and 2×10-4mol/L Val,respectively).The changes of podocyte activity were detected by CCK-8 after 48hrs incubation. Results Compared with controlgroup,the podocyte activity in different high glucose groups were significantly inhibited to varying degrees except that in 16.1mmol/L glucose group.The activity of podocyte was most significantly inhibited in 26.1mmol/L glucose group(P＜0.01).Compared with the 26.1mmol/L high glucose group,the podocyte activity of different TP and Val groups were significantly up-regulated to varying degrees except those of 4ng/mlTP group and 2×10-8mol/L Val group.The activity of podocyte was most significantly up-regulated by the 16ng/ml TP and the 2×10-5mol/L Val,respectively(P＜0.01). Conclusion Both triptolide and valsartan can partially rehabilitate the inhibition of mouse podocyte activity induced by high glucose.

High glucose Triptolide Valsartan Podocyte Activity impactCCK-8

2014-10-21）

（本文編輯：胥昀）

浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金計(jì)劃A類（2012ZA097）；杭州市科委醫(yī)療衛(wèi)生及重點(diǎn)?？茖２】蒲泄リP(guān)專項(xiàng)（20130733Q 16）

310007 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)V興醫(yī)院、杭州市中醫(yī)院內(nèi)分泌科

葉迅，E-m ai l：yexunonl i ne@163.com