張 雙， 駱超超， 武彩霞， 高學(xué)軍*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.河北北方學(xué)院 生命科學(xué)研究中心，河北 張家口 075000)

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抗菌肽天蠶素B基因在納豆芽胞桿菌中的表達

張 雙1， 駱超超1， 武彩霞2， 高學(xué)軍1*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.河北北方學(xué)院 生命科學(xué)研究中心，河北 張家口 075000)

抗菌肽是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有生物活性的小分子多肽。天蠶素B(Cecropin B)是最早從天蠶體內(nèi)分離得到的一種熱穩(wěn)定的可溶性多肽，在已分離的眾多抗菌肽中抗性較強。納豆芽胞桿菌具有優(yōu)良的益生特性，本研究選擇枯草芽胞桿菌的一種表達載體pHT43，將抗菌肽天蠶素B基因?qū)爰{豆芽胞桿菌中，驗證其在目的菌中是否能夠表達和穩(wěn)定傳代以及進行抗菌活性分析。結(jié)果表明，天蠶素B基因在納豆芽胞桿菌中表達，并能穩(wěn)定傳代，能夠提高納豆芽胞桿菌的抑菌活性，抗金黃色葡萄球菌的活性優(yōu)于干酪乳桿菌和枯草芽胞桿菌。本研究為該重組菌作為飼料添加劑的應(yīng)用提供了技術(shù)基礎(chǔ)。本文首次報道天蠶素B在納豆枯草芽胞桿菌中表達。

天蠶素B；納豆芽胞桿菌；表達；傳代；抑菌

益生菌又稱微生態(tài)制劑，是由一種或多種有益微生物及代謝產(chǎn)物組成，可供人類或動物直接食用和喂食的活菌制劑[1]。納豆芽胞桿菌屬于益生菌的一種，是枯草芽胞桿菌的一個亞種，在我國已被列入農(nóng)業(yè)部公布允許使用的飼料級微生物添加劑[2]。其作為飼料添加劑有著提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進仔豬生長、提高畜禽免疫能力和抗應(yīng)激能力等諸多功能[3]。抗菌肽具有抗菌譜廣、效果穩(wěn)定、無殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，屬一類環(huán)保型飼料添加劑，因而抗菌肽作為一種新型飼料添加劑是目前飼料工業(yè)上的一個新的研發(fā)方向[4]。研究發(fā)現(xiàn)，天蠶素B抗菌肽在抗菌肽中活性較強[5-6]，近年來國內(nèi)外先后報道了有關(guān)抗菌肽基因以及與其他相關(guān)基因融合的克隆和表達，如Florack等[6]用天蠶素抗菌肽B基因轉(zhuǎn)化到煙草中，發(fā)現(xiàn)其mRNA表達量提高；杜淑環(huán)等[7]將天蠶素抗菌肽B及其串聯(lián)體引入到了紫花苜蓿中；王秀青等[8]將抗菌肽天蠶素B基因及其串聯(lián)體導(dǎo)入畢赤酵母中表達。但尚未見將抗菌肽基因?qū)爰{豆芽胞桿菌的報道。本研究將外源的天蠶素B基因轉(zhuǎn)入納豆芽胞桿菌中，以驗證納豆芽胞桿菌能否表達抗菌活性以增強其作為飼料添加劑的應(yīng)用價值，為該重組菌作為飼料添加劑的應(yīng)用提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 儀器與試劑 凝膠成像系統(tǒng)、微波爐、電泳槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、PCR儀、電子天平、離心機、超凈工作臺、電熱恒溫培養(yǎng)箱、光學(xué)顯微鏡、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、高速冷凍離心機、pH計等。PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、T4 DNA連接酶、AatII、XbaI、蛋白質(zhì)Marker、DNA Marker購自大連寶生物科技有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司；溶菌酶、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside, IPTG)、氨芐青霉素、氯霉素購自上海生工生物工程公司；引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純，培養(yǎng)基使用LB培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 天蠶素B基因PCR擴增 根據(jù)相關(guān)文獻和NCBI報道的天蠶素B(Cecropin B,CB)的基因序列(基因登錄號：NM_001043995.1)，設(shè)計擴增該基因序列的引物，其中在上下游引物的5′端分別插入XbaI和AatII酶切位點(下劃線標示)。上游引物：5′-GCTCTAGAAGGTGGAAGATCTTCAAGAAAAT-3′，下游引物：5′-CGGACGTCTATGGCTTTAGCTGAACCGAG-3′。以本實驗室保存的重組質(zhì)粒pMD-18T-CB為模板，進行天蠶素B基因的PCR擴增。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性30 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，30個循環(huán)；72 ℃總延伸10 min；4 ℃保溫。擴增完畢后，取其中5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠驗證。

1.2.2 納豆芽胞桿菌中重組表達質(zhì)粒pHT43/CB構(gòu)建以及轉(zhuǎn)化 按照Axygen凝膠回收試劑盒的說明操作，對PCR擴增產(chǎn)物回收純化。并對純化后的產(chǎn)物及pHT43載體分別進行雙酶切反應(yīng)，之后用T4 DNA連接酶連接兩產(chǎn)物，構(gòu)建出重組載體pHT43/CB，按照枯草芽胞桿菌感受態(tài)制備方法處理納豆芽胞桿菌，即通過化學(xué)轉(zhuǎn)化方法將重組載體轉(zhuǎn)化至納豆芽胞桿菌中[9-10]，于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，氯霉素抗性平板篩選。

1.2.3 納豆芽胞桿菌中重組質(zhì)粒鑒定 挑取單菌落于5 mL含氯霉素(25 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用AatII和XbaⅠ進行雙酶切鑒定，篩選得到陽性克隆子[11]。將陽性克隆子進行核苷酸序列測定(由上海華大基因公司完成)，用生物信息學(xué)軟件將所得序列和NCBI發(fā)布的序列進行比對分析。

1.2.4 重組質(zhì)粒pHT43/CB在納豆芽胞桿菌中蛋白的水平表達 將攜帶重組表達質(zhì)粒pHT43/CB的納豆芽胞桿菌在含有氯霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD值為0.6～0.8，加入1 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)24 h，獲取蛋白樣，進行Tricine-SDS-PAGE電泳，其濃縮膠濃度為5%，電泳時電壓為30 V，分離膠濃度16%，電壓為200 V[12]。電泳結(jié)束后，進行Western-bloting驗證[13]。

1.2.5 重組質(zhì)粒在納豆芽胞桿菌中的穩(wěn)定性 參考經(jīng)典質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性測定方法，經(jīng)適當(dāng)修改后，在有選擇壓力(添加氯霉素)和無選擇壓力(未添加氯霉素)的條件下，測定pHT43/CB重組質(zhì)粒在納豆芽胞桿菌中的遺傳穩(wěn)定率[14]。將重組子分別接種于5 mL有選擇性培養(yǎng)基(含25 μg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基)和無選擇性培養(yǎng)基中，37 ℃、130 r/min培養(yǎng)12 h；每12 h傳代1次，連續(xù)傳代培養(yǎng)30代；利用重組質(zhì)粒pHT43中含有氯霉素抗性的特征，每傳代10次進行質(zhì)粒穩(wěn)定率測定；質(zhì)粒穩(wěn)定率等于從不含氯霉素抗性的平板上選取100個單菌落，點種于含氯霉素抗性的平板上，得出最后長出的菌落數(shù)的百分率。

1.2.6 轉(zhuǎn)入pHT43/CB的納豆芽胞桿菌的抑菌活性的測定 吸取0.1 mL金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的培養(yǎng)物(菌數(shù)為107cfu/mL)分別均勻涂布于LB固體平板上，自然干燥30 min，將牛津杯(內(nèi)徑為6 mm)均勻放置在平板上，確保其與平板培養(yǎng)基接觸面無空隙，分別吸取0.2 mL 轉(zhuǎn)入pHT43/CB的納豆芽胞桿菌、轉(zhuǎn)入pHT43的納豆芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、干酪乳桿菌等益生菌發(fā)酵液于牛津杯中(菌數(shù)均為109cfu/mL)，37 ℃培養(yǎng)10～12 h，觀測抑菌活性[15]。

針對本課題所研究得出的協(xié)同育人機制，將在廈門理工學(xué)院新絲路時尚學(xué)院學(xué)院進行試行實踐，因為“實踐是檢驗真理的唯一標準”，我們將在實踐的檢驗中研究和探索出一套實際效果好、可操作性強且具有可推廣性的一套協(xié)同育人機制。

1.2.7 含pHT43/CB的納豆芽胞桿菌及野生菌株生長曲線的測定 為驗證外源重組質(zhì)粒對野生菌種的整體生長水平是否有影響，采用比濁法，將發(fā)酵液適度稀釋，每隔2 h測定1次含pHT43/CB的納豆芽胞桿菌及野生菌在630 nm處的OD值，繪制其生長曲線圖[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CB基因序列獲取

擴增出CB片段如圖1所示，在100 bp處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期大小相符，測序片段全長105 bp，將測序結(jié)果與NCBI上報道CB的cDNA全序列基因(基因登錄號：NM_001043995.1)進行Blast比對分析，其中該目的基因的CDs區(qū)位于107～184 bp處，結(jié)果顯示其同源性為97%(圖2)，之后進行氨基酸序列比對，結(jié)果同源性為100%，即堿基的突變并未影響目的蛋白的改變。

圖1 CB基因PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 PCR products of the CB gene

圖2 CB基因核酸序列的比對Fig.2 Nucleic acid sequence alignent of the CB gene

2.2 納豆芽胞桿菌中重組表達載體的構(gòu)建和鑒定

重組質(zhì)粒pHT43/CB，片段長為8 162 bp，見圖3。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到納豆芽胞桿菌中，提取陽性克隆子，進行單雙酶切鑒定，如圖4，其中pHT43載體片段長度為8 057 bp。在105 bp處出現(xiàn)目的基因的條帶，其大小符合預(yù)測值，證明重組表達載體的質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入納豆芽胞桿菌中。

圖3 重組載體的構(gòu)建Fig.3 Construction of the recombinant plasmid

圖4 重組載體酶切驗證Fig.4 Identification results of the recombinant plasmid with endonuclease reactionM：DL2 000標準分子量；1：pHT43/CB重組載體；2：Xba I和Aat II雙酶切；3：Xba I單酶切M：DL2 000 Marker；1：Recombinant plasmid；2：pHT43/CB digested with Xba I and Aat II；3：pHT43/CB digested with Xba I

2.3 Western-blot檢測結(jié)果

為了驗證重組載體在納豆芽胞桿菌中是否高效表達，經(jīng)過24 h的IPTG誘導(dǎo)后，提取菌體蛋白樣，該目的蛋白大小為3.8 kD，之后進行Western-blot驗證結(jié)果(見圖5)，經(jīng)誘導(dǎo)后的目的蛋白條帶明顯加粗，即目的蛋白表達量明顯提高。

圖5 Western-blot 檢測納豆芽胞桿菌中CB基因蛋白表達Fig.5 Western-blot analysis of the expression of CB in Bacillus natto1:重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的蛋白表達情況；2:重組菌未誘導(dǎo)的蛋白表達情況；3:標準品1:Protein expression of recombinant strains after induction with IPTG；2:Protein expression of recombinant strains before induction；3:Standard of CB

2.4 質(zhì)粒穩(wěn)定性測定結(jié)果

重組質(zhì)粒pHT43/CB的穩(wěn)定性，結(jié)果見圖6。從圖6A和B中對比可知，重組質(zhì)粒分別在選擇性培養(yǎng)基(添加氯霉素，Cm+)和無選擇性培養(yǎng)基(無氯霉素，Cm-)傳代培養(yǎng)30次的菌落數(shù)比值均為100%，說明重組質(zhì)粒pHT43/CB的穩(wěn)定性良好。

2.5 含有pHT43/CB重組菌的抑菌活性測定結(jié)果

實驗測定重組菌的抑菌活性，結(jié)果見圖7。圖7a、b表示抑制大腸埃希菌的效率，發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌的抑菌活性優(yōu)于重組菌，枯草芽胞桿菌和重組菌的抑菌活性均較低，但重組菌的抑菌活性優(yōu)于野生菌的抑菌活性；圖7c、d表示抑制金黃色葡萄球菌的效果，重組菌的抑菌活性明顯高于干酪乳桿菌、枯草芽胞桿菌及其野生菌。

圖6 重組子質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測Fig.6 Plasmid stability test of the recombinantsa、b、c：選擇性培養(yǎng)基中第10、20、30代重組質(zhì)粒pHT43/CB生長情況；d、e、f：無選擇性培養(yǎng)基中第10、20、30代重組質(zhì)粒pHT43/CB生長情況a，b，c：respectively represent the stability of recombinant bacteria of 10,20 and 30 passage in resistant (chloramphenicol was added) medium; d，e，f：respectively represent the stability of recombinant bacteria of 10,20 and 30 passage in non-resistant (no chloramphenicol) medium

圖7 含有pHT43/CB的重組菌與其他乳酸菌抑菌活性的比較Fig.7 The comparison of the inhibitory activity between pHT43/CB Bacillus natto and other bacteriaa、b：以大腸埃希菌為指示菌；c、d：以金黃色葡萄球菌為指示菌；①干酪乳桿菌；②枯草芽胞桿菌；③：含pHT/CB的納豆芽胞桿菌；④納豆芽胞桿菌；⑤含pHT43的納豆芽胞桿菌；⑥H2Oa，b：E. coli bacteria are indicative bacteria; c，d：Staphylococcus aureus indicative bacteria；①Lactobacillus casei; ②Bacillus subtilis;③Bacillus natto with pHT43/CB; ④Bacillus natto; ⑤ Bacillus natto with pHT43; ⑥H2O

2.6 含有pHT43/CB重組菌及野生菌生長曲線的測定結(jié)果

含有pHT43/CB重組菌及野生菌生長曲線的測定結(jié)果見圖8，發(fā)現(xiàn)2種菌株在指數(shù)期之前基本無差異，但是重組菌的指數(shù)末期及穩(wěn)定期稍高于野生菌株，可見，外源重組載體并不影響菌株的生長代謝，而且有可能促進菌體代謝。

圖8 納豆芽胞桿菌及重組菌生長曲線Fig.8 Curves of the growth of Bacillus natto and the recombinant

3 討 論

迄今為止，人們已經(jīng)利用微生物成功表達合成了多種天蠶素抗菌肽，例如單基因、融合基因以及雜合肽等。在抗生素耐藥性日益嚴重，病毒病和腫瘤仍未攻克的今天，抗菌肽的出現(xiàn)無疑為人們尋找理想的抗菌、抗病毒和抗腫瘤藥物提供新的研究方向[17]。納豆芽胞桿菌作為表達外源基因的受體菌，其自身的表達系統(tǒng)并未被人們熟知，而且表達系統(tǒng)相對枯草芽胞桿菌尚不穩(wěn)定，本研究將抗菌肽天蠶素B基因轉(zhuǎn)入至原核生物納豆芽胞桿菌中尚屬首次報道。本研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽天蠶素B基因可以成功轉(zhuǎn)入至原核細菌中。因納豆芽胞桿菌同屬于枯草芽胞桿菌的變種，因此本研究按照枯草芽胞桿菌感受態(tài)的制備方法處理納豆芽胞桿菌，同時，pHT43屬于枯草芽胞桿菌表達載體，也有利于轉(zhuǎn)化進行。在本研究連續(xù)傳代過程中，測定質(zhì)粒的穩(wěn)定性為100%，結(jié)果表明天蠶素B能夠在納豆芽胞桿菌中表達并穩(wěn)定傳代，本研究為納豆芽胞桿菌轉(zhuǎn)入外源基因提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

本研究抑制金黃色葡萄球菌的效果明顯高于其野生菌及干酪乳桿菌和枯草芽胞桿菌，但抑制大腸埃希菌的效果不如干酪乳桿菌和枯草芽胞桿菌。因此，轉(zhuǎn)天蠶素B的納豆芽胞桿菌可用于金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌的防治，還可以和干酪乳桿菌等配合共同防治大腸埃希菌等革蘭陰性菌。本研究為開展抗菌肽天蠶素B基因在益生菌中的高效表達和應(yīng)用提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

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Expression of the Antimicrobial Peptide Cecropin B gene in Bacillus natto

ZHANG Shuang1, LUO Chao-chao1, WU Cai-xia2, GAO Xue-jun1

(1.KeyLab.ofAgric.Bio-FunctionalGenes,NEAgric.Uni.,Harbin150030; 2.LifeSci.Res.Ctr.,HebeiNorthUni.,Zhangjiakou075000)

Antimicrobial peptides are a class of small molecule peptides possessing bio-activity appear through inductioninvivo. Cecropin B was first isolated and obtained from wild silkworm body, a thermo-stable soluble peptide, it has stronger resistance among numerous antimicrobial peptides isolated so far. In this experiment, aBacillussubtilisexpression vector pHT43 was used and then transfered the cecropin B gene intoB.nattoand verified the expression and stability in targeted bacteria as well as analysis of the antimicrobial activity, The results showed that cecropin B was expressed inBacillusnattoand could stably transfer to next generation, as well as could improve the antimicrobial activity ofB.natto, its antimicrobial activity againstStaphylococcusaureuswas better than that of bothLactobacilluscaseiandBacillussubtilis. This study provided technical basis for the application of the recombinant bacterium as feed additive. And this paper for the first time reports the expression of cecropin B inB.nattoand have important theoretical significance

cecropin B;Bacillusnatto; expression; generation transfering; antimicroorganism

國家“863”計劃項目(2013AA102504-03)

張雙 女，碩士研究生。研究方向為轉(zhuǎn)基因微生物。E-mail: zhuimengzs@163.com

* 通訊作者。男，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向為動物生物技術(shù)。E-mail: gaoxj5390@sina.com

2014-12-12；

2015-05-05

Q819

A

1005-7021(2016)01-0057-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.010