王 偉， 劉雅文， 谷鳳霞， 孫 珍， 堵國(guó)成， 李憲臻*

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

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啤酒腐敗微生物與啤酒微生物穩(wěn)定性研究進(jìn)展

王 偉1,2， 劉雅文2， 谷鳳霞2， 孫 珍2， 堵國(guó)成1， 李憲臻2*

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

盡管生產(chǎn)環(huán)境和衛(wèi)生條件已經(jīng)得到大幅改善，但啤酒生產(chǎn)過(guò)程中仍然會(huì)發(fā)生微生物污染，因此，真正意義上的啤酒純種釀制是很難實(shí)現(xiàn)的。為了有效控制生產(chǎn)過(guò)程中的微生物污染，本文系統(tǒng)介紹了啤酒微生物的多樣性及其在生產(chǎn)工序中的分布，探討了啤酒環(huán)境對(duì)抑制啤酒微生物污染的影響，討論了啤酒微生物對(duì)啤酒質(zhì)量與風(fēng)味的積極貢獻(xiàn)，提出合理控制外源微生物侵染是形成不同啤酒典型特征的關(guān)鍵。

啤酒微生物；微生物穩(wěn)定性；釀制；污染；酵母

雖然啤酒生產(chǎn)技術(shù)有了長(zhǎng)足發(fā)展，但啤酒生產(chǎn)始終無(wú)法實(shí)現(xiàn)完全純種釀造，生產(chǎn)過(guò)程中仍有可能發(fā)生微生物污染，導(dǎo)致啤酒質(zhì)量不穩(wěn)定[1]。工業(yè)化啤酒生產(chǎn)可以通過(guò)巴氏滅菌、過(guò)濾和低溫儲(chǔ)存等預(yù)防啤酒腐敗，但微型啤酒生產(chǎn)和桶裝啤酒則未經(jīng)滅菌，需要特別關(guān)注啤酒的微生物穩(wěn)定性。

1 啤酒微生物分類(lèi)

根據(jù)啤酒腐敗特征及其與啤酒質(zhì)量的關(guān)系，可以將啤酒污染微生物分為專(zhuān)性啤酒微生物、潛在啤酒微生物、間接啤酒微生物、指示微生物和隱性微生物五類(lèi)。

1.1 專(zhuān)性啤酒微生物

專(zhuān)性啤酒微生物能在啤酒環(huán)境中存活，無(wú)需較長(zhǎng)適應(yīng)時(shí)間就能在啤酒中生長(zhǎng)繁殖，并使啤酒產(chǎn)生異味和混濁，嚴(yán)重影響啤酒質(zhì)量。Lactobacillusbrevis、Lb.lindneri、Lb.brevisimilis、Lb.frigidus、Lb.coryniformis、Lb.casei、Pediococcusdamnosus、Pectinatuscerevisiiphilus、Pec.frisingensis、Megasphaeracerevisiae和Selenomonaslacticifex等屬于該類(lèi)微生物[2]。

1.2 潛在啤酒微生物

潛在啤酒微生物在正常情況下不能在啤酒中生長(zhǎng)，但當(dāng)啤酒處在高pH、低啤酒花濃度、低發(fā)酵度、低酒精度或高氧含量等特定條件下則能夠生長(zhǎng)，那些經(jīng)暴露在啤酒中較長(zhǎng)一段時(shí)間后能適應(yīng)生長(zhǎng)的微生物也包括在該類(lèi)微生物中。Lb.plantarum、Lb.lactis、Lb.raffinolactis、Leuconostocmesenteroides、Micrococcuskristinae、Ped.inopinatus、Zymomonasmobilis和Z.raffinosivorans等屬于該類(lèi)微生物[2]。

1.3 間接啤酒微生物

間接啤酒微生物不能在成品啤酒中生長(zhǎng)，但可在生產(chǎn)過(guò)程中的某些階段生長(zhǎng)，使啤酒產(chǎn)生異味。腸道菌和某些野生Saccharomyces菌以及某些好氧酵母等屬于這類(lèi)微生物，Obesumbacteriumproteus和Rahnellaaquatilis是啤酒釀造過(guò)程中最重要的腸桿菌腐敗微生物[3]。

1.4 指示微生物

指示微生物不會(huì)引起啤酒腐敗，但常伴隨啤酒腐敗菌一起生長(zhǎng)，指示微生物的檢出通常預(yù)示釀造過(guò)程中有啤酒腐敗菌存在，表明釀造過(guò)程中的衛(wèi)生狀況發(fā)生問(wèn)題。Acetobacterspp.、Acinetobactercalcoaceticus、Gluconobacteroxydans、Pantoeaagglomerans、Klebsiellaspp.和好氧野生酵母是這類(lèi)微生物的代表[2]。

1.5 隱性微生物

隱性微生物是指啤酒釀造過(guò)程中偶爾能檢測(cè)到，甚至在某些條件下能存活并能從成品啤酒中分離出來(lái)的一類(lèi)微生物，這類(lèi)微生物對(duì)啤酒質(zhì)量不構(gòu)成任何危害，通常是土壤/水源性微生物，是由水污染引起或在長(zhǎng)期運(yùn)行的生產(chǎn)線(xiàn)上逐漸形成。產(chǎn)孢細(xì)菌、腸桿菌、球菌和產(chǎn)膜酵母是典型的這類(lèi)微生物[2]。如果檢出頻率過(guò)高，說(shuō)明衛(wèi)生狀況有待改善。

2 啤酒微生物的多樣性

迄今為止，僅發(fā)現(xiàn)有少數(shù)幾類(lèi)細(xì)菌能在啤酒這種惡劣條件下生長(zhǎng)并使啤酒腐敗，包括革蘭陽(yáng)性菌和陰性菌(表1)[4]。革蘭陽(yáng)性菌幾乎都屬于乳酸菌，對(duì)生產(chǎn)危害性最大，70%以上的啤酒腐敗都與這類(lèi)菌有關(guān)[3]；革蘭陰性菌Pectinatus和Megasphaera是導(dǎo)致啤酒腐敗的第二主要微生物，因?yàn)楝F(xiàn)代啤酒技術(shù)已大幅降低了成品啤酒中的氧含量，這類(lèi)嚴(yán)格厭氧菌在啤酒腐敗中的作用正在逐漸增加；與細(xì)菌相比，野生酵母對(duì)啤酒腐敗較不嚴(yán)重，但卻很難從釀酒酵母中除去。

表1 啤酒微生物及其對(duì)啤酒質(zhì)量的影響

續(xù)表1

注：“+”代表反應(yīng)陽(yáng)性；“-”代表反應(yīng)陰性

2.1 乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB)

LAB是革蘭陽(yáng)性、非生孢子的桿菌或球菌，嚴(yán)格發(fā)酵型、兼性厭氧。啤酒LAB具有抗啤酒花活性，能在普通LAB無(wú)法存活的啤酒中生長(zhǎng)，主要通過(guò)產(chǎn)生絮狀物和形成酸味與非典型氣味等使啤酒腐敗[5]。最主要的啤酒LAB是Lb.brevis，能形成各種異味和芳香味并使啤酒混濁[6]； 其次是Ped.damnosus， 能產(chǎn)生雙乙酰等各種不良風(fēng)味[7]。

一般而言，啤酒花的存在可以保障革蘭陽(yáng)性菌不能在啤酒中生長(zhǎng)，但某些LAB在適應(yīng)啤酒花的過(guò)程中，進(jìn)化出抗啤酒花基因horA和horC等，而在啤酒中生存并腐敗啤酒[1]。horA和horC基因分別編碼ATP依賴(lài)型和質(zhì)子動(dòng)勢(shì)依賴(lài)型多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，賦予LAB啤酒花抗性。LAB的啤酒腐敗能力與菌種狀態(tài)相關(guān)[8]，啤酒花抗性是唯一的種間差異，其典型特征是腐敗菌和非腐敗菌共存于同一類(lèi)LAB中。

2.1.1 乳桿菌(Lactobacillus) 并不是所有乳桿菌都能在啤酒中生長(zhǎng)，事實(shí)上，只有少數(shù)乳桿菌才能腐敗啤酒[6]。Lb.brevis在啤酒生產(chǎn)過(guò)程中被檢出的頻率較高[6]，是專(zhuān)性異型發(fā)酵菌，一般對(duì)啤酒花具有抗性。Lb.lindneri是僅次于Lb.brevis的啤酒腐敗乳桿菌，大約15%～20%的啤酒腐敗是由其引起的[3]，該菌對(duì)啤酒花具有高抗性，耐熱溫度比其他LAB高。與上述兩菌相比，Lb.buchneri、Lb.casei、Lb.coryneformis、Lb.curvatus和Lb.plantarum則是不常見(jiàn)的啤酒腐敗LAB[9]，Lb.brevisimilis、Lb.malefermentans、Lb.parabuchneri、Lb.collinoides和Lb.paracaseisubsp.paracasei也曾經(jīng)被報(bào)道是啤酒腐敗LAB[9]。

2.1.2 小球菌(Pediococcus)Pediococcus是革蘭陽(yáng)性球菌，同型發(fā)酵，能在啤酒中生長(zhǎng)并產(chǎn)生絲狀物和大量雙乙酰，存在于從麥汁到成品啤酒的各個(gè)釀造環(huán)節(jié)。生產(chǎn)中已發(fā)現(xiàn)的小球菌包括Ped.acidilactici、Ped.damnosus、Ped.dextrinicus、Ped.halophilus、Ped.inopinatus、Ped.Parvulus和Ped.pentosaceus[5]，其中，Ped.damnosus是最常見(jiàn)的啤酒腐敗菌，能夠抗啤酒花，通常在啤酒和后酵過(guò)程中出現(xiàn)，很少在接種酵母中被檢出。而Ped.inopinatus則經(jīng)常在接種酵母中被檢出，但很少在發(fā)酵過(guò)程的其他階段發(fā)現(xiàn)[2]。Ped.inopinatus和Ped.dextrinicus能在高于pH 4.2和低酒精、低啤酒花濃度的啤酒中生長(zhǎng)，但從未發(fā)現(xiàn)Ped.pentsaceus和Ped.acidilactici會(huì)影響成品啤酒的質(zhì)量[2]。

2.2 醋酸菌(Acetic acid bacteria)

醋酸菌有10個(gè)屬，與啤酒腐敗有關(guān)的主要是G.oxydans[10]。因?yàn)槟軐⒕凭趸癁橐宜?，醋酸菌能在高酒精度中生存，并產(chǎn)生尖酸的異味和芳香味。醋酸菌污染大都發(fā)生在灌裝線(xiàn)上，且與氧通量有關(guān)。在灌裝和過(guò)濾工序中，70%污染微生物是A.pasteurianussubsp.pasteurianus，在發(fā)酵過(guò)程和清酒罐中也偶爾發(fā)現(xiàn)有Acetobacter和Gluconobacter污染[1]。

2.3 腸桿菌(Enterobacteriaceae)

只有少數(shù)腸桿菌偶爾會(huì)被發(fā)現(xiàn)與啤酒釀造相關(guān)，如O.proteus、R.aquatilis和Citrobacterfreundii[10]。O.proteus通過(guò)產(chǎn)生乙偶姻、乳酸、丙醇、DMS、異丁醇和2,3-丁二醇腐敗啤酒和麥汁[11]，一般只在接種酵母中發(fā)現(xiàn)，且在發(fā)酵前24 h具有重要影響，用污染有O.proteus的酵母釀造的啤酒會(huì)產(chǎn)生一種歐洲防風(fēng)草樣或水果異味[3]。Cb.freundii和R.aquatilis通過(guò)產(chǎn)生雙乙酰、二甲基硫化物、乙偶姻、乙醛、乳酸和2,3-丁二醇等形成的各種異味和芳香物而影響啤酒質(zhì)量[2]，這些化合物的產(chǎn)生總是發(fā)生在發(fā)酵的開(kāi)始階段。Enterobacteragglomerans也是一種污染接種酵母的腐敗菌，能夠延遲發(fā)酵過(guò)程，當(dāng)麥汁被E.agglomerans污染后，所釀啤酒會(huì)含有不正常的高水平雙乙酰和二甲硫醚[3]。

2.4 發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)

Z.mobilis是發(fā)酵單胞菌中第一個(gè)分離到的啤酒腐敗菌，耐氧性厭氧，在pH 3.4以上和酒精濃度(體積分?jǐn)?shù))10%以下生長(zhǎng)，一般都在灌裝階段被發(fā)現(xiàn)[12]。因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生高水平的乙醛和硫化氫，通常使啤酒具有果味和硫化物味特征，其啤酒腐敗活性與Pectinatus菌相似[10]。

2.5 果膠桿菌(Pectinatus)

果膠桿菌是嚴(yán)格厭氧的革蘭陰性菌，能產(chǎn)生大量乙酸、丙酸和乙偶姻而使啤酒混濁[10]，已在很多啤酒生產(chǎn)線(xiàn)上分離到這類(lèi)菌，大約在20%～30%微生物污染中起主要作用，特別是在非巴氏殺菌的啤酒中[13]。目前已確認(rèn)的有Pec.cerevisiiphilus、Pec.frisingensis和Pec.haikarae，它們因形成各種脂肪酸、硫化氫和甲硫醇等，使啤酒混濁并有類(lèi)似臭雞蛋的難聞氣味[13]，主要感染未經(jīng)巴氏殺菌的啤酒。

2.6巨型球菌(Megasphaera)

巨型球菌是嚴(yán)格厭氧的革蘭陰性菌，腐敗特征是混濁，并形成大量丁酸和少量乙酸、異戊酸、己酸與乙偶姻[14]。這類(lèi)菌只在發(fā)酵開(kāi)始階段出現(xiàn)，當(dāng)酒精濃度高于2.8%時(shí)抑制生長(zhǎng)，但酒精濃度高于5.5%時(shí)才完全不生長(zhǎng)。巨型球菌一般都與果膠桿菌同時(shí)出現(xiàn)，大約與3%～7%的啤酒腐敗有關(guān)[14]。由于現(xiàn)代灌裝技術(shù)大幅降低了成品啤酒中的氧含量，由Megasphaera和Pectinatus引起的啤酒腐敗正呈上升趨勢(shì)。目前已發(fā)現(xiàn)M.cerevisiae、M.paucivorans和M.sueciensis與啤酒腐敗有關(guān)[13]，與Pectinatus菌一樣，所產(chǎn)硫化氫會(huì)使啤酒有一種糞便氣味[13]，主要感染低酒精度的非巴氏殺菌啤酒。

3 啤酒微生物分布

來(lái)自于酵母與麥汁原料、發(fā)酵與熟化過(guò)程或生產(chǎn)設(shè)備等的微生物污染為初次污染，來(lái)源于灌裝過(guò)程的微生物污染為二次污染。50%以上的啤酒腐敗都是二次污染引起的，但初次污染所引起的啤酒腐敗則更為嚴(yán)重[15]。啤酒制造過(guò)程中各個(gè)階段可能出現(xiàn)的啤酒微生物見(jiàn)圖1。

圖1 啤酒微生物及其在釀造工藝中可能出現(xiàn)的階段Fig.1 Beer microorganisms in the different stage of the brewing process

3.1 大麥和麥汁

麥汁中的微生物主要來(lái)源于麥田、儲(chǔ)存過(guò)程和麥汁加工過(guò)程，包括植物品種、氣候、土壤、儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)榷紩?huì)影響大麥和麥汁中的微生物種類(lèi)[15]。Fusariumgraminearum和F.culmorum產(chǎn)霉菌毒素在釀造過(guò)程中無(wú)法剔除或降解，會(huì)留存在成品啤酒中[15]。大麥中的微生物群落因收獲后管理措施的不同而有很大差異，大麥表面的微生物通過(guò)形成致密的生物膜，能提高對(duì)干燥、加熱和抗生素等的耐性[15]。表2列出了收獲后大麥中常見(jiàn)的微生物種類(lèi)[15]。

表2 收獲后大麥中常見(jiàn)微生物

3.2 糖化和麥汁分離

如果糖化溫度下降或未加酒花麥汁保持在60 ℃以下，嗜溫菌會(huì)在糖化過(guò)程中繁殖。大多數(shù)LAB因?qū)ζ【苹舾卸荒茉诩尤肫【苹ǖ柠溨写婊睿吧L(zhǎng)的LAB會(huì)使麥汁含有令人不快的異味[4]。Bacillus的孢子會(huì)存留在麥芽和谷物等輔料中，在麥芽煮沸過(guò)程中能存活下來(lái)。研究發(fā)現(xiàn)B.coagulans在55～70 ℃的甜麥汁中放置2 h會(huì)產(chǎn)生大量乳酸，并與亞硝胺形成有關(guān)[16]。當(dāng)用污染有R.aquatilis的麥汁生產(chǎn)啤酒時(shí)，成品啤酒中能檢測(cè)到異常水平的雙乙酰和雙甲基硫化物[2]。

3.3 發(fā)酵

野生酵母是發(fā)酵過(guò)程常見(jiàn)污染菌之一，分為非Saccharomyces和Saccharomyces菌，會(huì)使啤酒產(chǎn)生混濁、異味和芳香等異常狀況[1]，發(fā)酵過(guò)程污染的非Saccharomyces菌主要包括Brettanomyces、Candida、Debaryomyces、Dekkera、Filobasidium、Hanseniaspora、Kluyveromyces、Pichia、Torulaspora和Zygosaccharomyces等。同型發(fā)酵Ped.damnosus是在釀酒酵母和啤酒中最常見(jiàn)的球菌污染物，但Ped.inopinatus常發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母中，很少在發(fā)酵過(guò)程的其他階段檢出，這類(lèi)菌能使啤酒含有高雙乙酰并延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間[3]。革蘭陰性厭氧菌S.lacticifex和Zymophilusraffinosivorans也存在于釀酒酵母中，是啤酒腐敗菌。在釀酒酵母中存在的O.proteus和R.aquatilis抑制發(fā)酵并使啤酒形成高pH值。在發(fā)酵早期被Enterobacteriaceae屬中的某些菌污染的釀酒原料與游離氨基酸脫羧形成生物氨有關(guān)[17]。

3.4 灌裝

在非巴氏滅菌的成品啤酒中，20%～30%啤酒腐敗都是由Pectinatus菌引起的，在麥汁和瓶裝啤酒中會(huì)產(chǎn)生大量乙酸和丙酸以及乙偶姻，其啤酒腐敗的典型特征是混濁和因硫化氫和甲硫醇形成的臭雞蛋味[10]。7%以上的啤酒腐敗是由Megasphaera引起的，M.cerevisiae是目前發(fā)現(xiàn)該屬中唯一能引起啤酒腐敗的菌[10]，盡管有報(bào)道該菌能在5.5%酒精中生長(zhǎng)，但在pH低于4.1和酒精濃度高于2.8%時(shí)生長(zhǎng)常被抑制，該菌引起的啤酒腐敗通常會(huì)產(chǎn)生大量丁酸和小量乙酸、硫醇、異戊酸和戊酸，以及乙偶姻和硫化氫，后者會(huì)使啤酒產(chǎn)生難聞的氣味[10]。盡管LAB包含很多屬，但能引起啤酒腐敗的很少，Lactobacillus和Pediococcus對(duì)啤酒質(zhì)量危害最大，會(huì)產(chǎn)生不愉快的酸味和非典型氣味等，啤酒腐敗LAB也與生物胺產(chǎn)生有關(guān)[16]。

3.5 成品啤酒

Lb.brevis是成品啤酒中最普遍存在的腐敗菌，具有抗啤酒花能力[3]。由于能發(fā)酵糊精和淀粉，會(huì)導(dǎo)致啤酒混濁和高消糖度，在成品啤酒中形成高雙乙酰含量，是啤酒腐敗中需要特別關(guān)注的污染菌[5]。Lb.lindneri也是成品啤酒中常見(jiàn)污染菌，約占成品啤酒腐敗的15%～20%[12]。其他導(dǎo)致成品啤酒腐敗的乳桿菌還有Lb.buchneri、Lb.casei、Lb.collinoides、Lb.coryneformis和Lb.plantarum，但這些異型發(fā)酵LAB遠(yuǎn)沒(méi)有Lb.brevis或Lb.lindneri常見(jiàn)[12]。

Pediococci污染會(huì)使啤酒粘附性增加，最常見(jiàn)的是具有啤酒花抗性并高產(chǎn)雙乙酰的Ped.damnosus[5]，Ped.inopinatus和Ped.dextrinicus也能夠在pH 4.2以上且低酒精、低啤酒花濃度的啤酒中生長(zhǎng)[3]。成品啤酒中也發(fā)現(xiàn)有Ped.claussenii[3]，但隨著衛(wèi)生條件的改善，Pediococcus菌引起的啤酒腐敗正逐漸下降。

Kocuriakristinae是非典型啤酒腐敗菌，能在低酒精與低啤酒花濃度和高于pH 4.5的啤酒中生長(zhǎng)，產(chǎn)生水果型非典型芳香[3]。

4 啤酒的微生物穩(wěn)定性

啤酒對(duì)絕大多數(shù)微生物都是一種極度貧乏和惡劣的生存環(huán)境，對(duì)腐敗微生物具有天然抗性，包括4%～5%酒精濃度、pH 3.8～4.7酸性條件、高CO2濃度與極低氧含量的厭氧環(huán)境、低含量糖與氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物。啤酒也含有啤酒花苦味酸，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有毒性。

啤酒中的酒精能通過(guò)增加質(zhì)子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的通路，改變細(xì)胞膜透性，使細(xì)胞無(wú)法保持體內(nèi)pH平衡，從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)低pH的敏感性[18]。低pH能強(qiáng)化弱有機(jī)酸進(jìn)入胞內(nèi)的能力，導(dǎo)致胞內(nèi)酸化，破壞胞內(nèi)酶系統(tǒng)并使?fàn)I養(yǎng)吸收減少，引起代謝衰竭。低pH也與啤酒花抗菌性表現(xiàn)協(xié)同作用[7]，因?yàn)槠【苹咕钚噪SpH降低而增加，一般認(rèn)為pH每降低0.2能增大50%的啤酒花抗菌活性[5]。很多病原菌在典型的啤酒pH條件下都不能生長(zhǎng)，僅有Yersiniaenterocolitica、Staphylococcusaureus、C.botulinum和Salmonellaspp.能在啤酒的pH水平下生長(zhǎng)[19]，而且，即使能在這種低pH下生長(zhǎng)，啤酒中的其他抑菌因子如乙醇、啤酒花、CO2等也能保證這些病原菌不能存活。

降低啤酒中的氧含量，不僅能提高啤酒化學(xué)穩(wěn)定性，也能降低很多病原菌生長(zhǎng)的可能性[19]。CO2能通過(guò)各種機(jī)制抑制病原菌生長(zhǎng)：形成厭氧環(huán)境以排除好氧病原菌生長(zhǎng)、使pH降低從而影響?hù)然兔擊然磻?yīng)等。營(yíng)養(yǎng)缺乏也對(duì)微生物污染產(chǎn)生抑制作用，因?yàn)橛坞x氨基氮、總可溶氮和麥芽三糖的水平增加，明顯提高細(xì)菌生長(zhǎng)活性[20]。在啤酒生產(chǎn)過(guò)程中加入啤酒花的目的是為了賦予啤酒一種特殊的苦味和芳香，但是，啤酒花中很多化合物如蛇麻酮、葎草酮、異葎草酮和蛇麻酸已被證明能夠誘導(dǎo)B.subtilis的細(xì)胞膜泄漏[5]，導(dǎo)致糖和氨基酸過(guò)膜的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)被抑制，使呼吸中斷和蛋白質(zhì)、DNA與RNA合成終止。啤酒花不僅能影響質(zhì)子動(dòng)勢(shì)的損耗，也能使二價(jià)陽(yáng)離子在啤酒花敏感細(xì)胞中受約束，進(jìn)一步抑制細(xì)胞代謝[1]。啤酒花苦味酸在提高微生物穩(wěn)定性方面起主要作用[5]，能夠保護(hù)啤酒免受包括病原菌等大部分微生物感染，但其僅能抑制革蘭陽(yáng)性菌，對(duì)革蘭陰性菌無(wú)效。

5 啤酒微生物的積極作用

一直以來(lái)，有兩個(gè)重要觀念始終貫穿于啤酒生產(chǎn)過(guò)程：一個(gè)是啤酒生產(chǎn)是純種釀造，另一個(gè)是啤酒生產(chǎn)務(wù)必要保證無(wú)菌過(guò)程。但是，正如前面所討論的，啤酒微生物始終伴隨在啤酒生產(chǎn)過(guò)程中，即使再潔凈的衛(wèi)生環(huán)境也無(wú)法避免啤酒酵母之外的微生物侵染。

事實(shí)上，不是所有啤酒微生物都對(duì)啤酒釀造具有負(fù)面作用，Hartnett等[21]從大麥中分離到6株能夠合成某些細(xì)菌素的LAB，研究發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌素能夠抑制釀造過(guò)程中的啤酒腐敗菌。由大麥等啤酒原輔料帶來(lái)的這些LAB，不僅能防治制麥和糖化過(guò)程中的微生物污染，而且在麥汁煮沸過(guò)程中被殺死，但所產(chǎn)生的細(xì)菌素由于其自身的熱穩(wěn)定性與pH穩(wěn)定性和對(duì)啤酒酵母無(wú)作用，可以在發(fā)酵過(guò)程中繼續(xù)發(fā)揮抗微生物活性，以防止后續(xù)的麥汁和啤酒被腐敗微生物污染。研究也發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌素由于是小分子肽，對(duì)啤酒風(fēng)味不產(chǎn)生任何不利作用。乳酸菌Lb.fermenti、Lb.helveticus、Lb.acidophilus和Lb.plantarum能產(chǎn)生細(xì)菌素，其中的一些細(xì)菌素對(duì)B.cereus、Sc.aureus、C.botulinum、C.perfringens、C.dificile和Listeriamonocytogenes等病原菌具有抑菌活性[22]。

由大麥表面帶入的絲狀真菌能產(chǎn)生各種水解酶，比如，大麥表面污染微生物Rhizopusoligosporus產(chǎn)生β-葡聚糖酶、木聚糖酶和蛋白酶，但淀粉降解能力并沒(méi)有增加[23]，因此，在制麥過(guò)程中能夠改善麥芽糖化效果，提高麥汁浸出率和氨基酸含量，進(jìn)而明顯改善啤酒發(fā)酵特性。

迄今在腐敗啤酒中分離到的啤酒微生物中，60%～90%都是LAB，尤以Lb.brevis最常見(jiàn)[1,9]，但并非所有LAB都是啤酒腐敗菌。某些LAB能通過(guò)其代謝特性，直接或間接影響釀造過(guò)程，以改善啤酒品質(zhì)、安全性和風(fēng)味等[22]。糖化過(guò)程中由大麥引入的某些LAB菌因產(chǎn)酸而降低pH，有利于麥芽糖化，因?yàn)檎Ｇ闆r時(shí)的pH值為5.7～5.75，不利于糖化酶如β-葡聚糖酶(4.5～4.8)、 α-淀粉酶(5.3～5.7)、 β-淀粉酶(5.1～5.3)和羧肽酶(4.5～4.6)等發(fā)揮作用，由LAB引起糖化醪酸化的優(yōu)點(diǎn)包括較高的發(fā)酵極限、更寬的蛋白降解和更短的過(guò)濾時(shí)間，同時(shí)還可以改善啤酒苦味、雙乙酰還原、啤酒色澤和風(fēng)味穩(wěn)定性等[24]。

某些LAB中具有蛋白水解體系，能催化蛋白質(zhì)水解為短肽和游離氨基酸，直接或間接成為風(fēng)味物質(zhì)的前體，同時(shí)也為酵母發(fā)酵產(chǎn)酒精提供足夠的氮源[25]，其中的精氨酸氨肽酶還能水解苦味肽以釋放出芳香族氨基酸，為香味化合物的形成提供前體物質(zhì)。

某些Lb.brevis能將大麥等細(xì)胞壁中的半纖維素聚糖水解利用，而另一些Lb.brevis能夠同時(shí)發(fā)酵大多數(shù)不同的糖質(zhì)化合物，比如，核糖和葡萄糖、麥芽糖和果糖等可同時(shí)被利用，大幅降低啤酒中的不可發(fā)酵糖的含量，提高啤酒發(fā)酵度[26]。生物胺由于其對(duì)人體的危害性，是影響啤酒質(zhì)量的重要物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)，某些乳桿菌如Lb.plantarum能夠通過(guò)胺氧化酶降低生物胺在啤酒中的含量[27]，因此，釀造過(guò)程中的Lb.plantarum對(duì)于啤酒生產(chǎn)是有利的。釀造過(guò)程中的某些Lactobacillus菌也能通過(guò)產(chǎn)生抗生素物質(zhì)，控制病原菌污染[28-29]。

6 展 望

啤酒釀造過(guò)程中的微生物污染是無(wú)法避免的，有些啤酒微生物來(lái)源于啤酒原輔料，有些來(lái)源于啤酒釀造過(guò)程中的生產(chǎn)環(huán)境；有些啤酒微生物對(duì)啤酒釀造是有害的，會(huì)引起啤酒腐敗，但有些是有益的，可以改善啤酒質(zhì)量。事實(shí)上，對(duì)啤酒腐敗微生物的傳統(tǒng)定義是能夠在啤酒環(huán)境中生長(zhǎng)而導(dǎo)致啤酒產(chǎn)生異味和混濁的微生物，研究發(fā)現(xiàn)某些污染微生物能夠改善啤酒風(fēng)味或抑制有害微生物在啤酒中生長(zhǎng)。維持某些啤酒微生物在啤酒生產(chǎn)工藝中的穩(wěn)定生長(zhǎng)，可以保持品牌啤酒的特定風(fēng)味，對(duì)于啤酒生產(chǎn)是有利的。因此，絕對(duì)的純種釀造工藝無(wú)法實(shí)現(xiàn)品牌啤酒間的差異性，而不同地域、不同生產(chǎn)廠的特殊生產(chǎn)環(huán)境所形成的特定混菌發(fā)酵，才是形成不同啤酒典型特征的關(guān)鍵。所以，有關(guān)啤酒微生物研究應(yīng)更加關(guān)注如何有效控制合理的外源微生物侵染與啤酒風(fēng)味的相互影響。

[1] Suzuki K. 125th Anniversary review: microbiological instability of beer caused by spoilage bacteria[J]. J I Brewing, 2011, 117(2): 131-155.

[2] Vaughan A, O'Sullivan T F, Sinderen D. Enhancing the microbiological stability of malt and beer[J]. J I Brewing, 2005, 111(4): 355-371.

[3] Hollerová I, Kubizniaková P. Monitoring gram-positive bacterial contamination in Czech breweries [J]. J I Brewing, 2001, 107(6): 355-358.

[4] Sakamoto K, Konings W N. Beer spoilage bacteria and hop resistance[J]. Int J Food Microbiol, 2003, 89(2): 105-124.

[5] Suzuki K, Iijima K, Sakamoto K, et al. A review of hop resistance in beer spoilage lactic acid bacteria[J]. J I Brewing, 2006, 112(2): 173-191.

[6] Lin J, Cao Y, Sun J, et al. Monitoring spoilage bacteria and wild yeasts in eastern Chinese breweries[J]. J Am Soc Brew Chem, 2008, 66(1): 43-47.

[7] Menz G, Vriesekoop F, Zarei M, et al. The growth and survival of food borne pathogens in sweet and fermenting brewers’wort [J]. Int J Food Microbiol, 2010, 140(1): 19-25.

[8] Suzuki K, Sami M, Ozaki K, et al. Genetic characterization of hop-sensitive variants obtained from beer-spoilageLactobacillusbrevis[J]. J Am Soc Brew Chem, 2005, 63(1): 11-16.

[9] Menz G, Andrighetto C, Lombardi A, et al. Isolation, identification and characterization of beer-spoilage lactic acid bacteria from microbrewed beer from Victoria, Australia[J]. J I Brewing, 2010, 116(1): 14-22.

[10]van Vuuren H J J, Priest F G. Gram-negative brewery bacteria. In: Priest F G, Campbell I. Brewing Microbiology[M]. New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2003: 219-245.

[11]Priest F G, Barker M. Gram-negative bacteria associated with brewery yeasts: reclassification ofObesumbacteriumproteusbiogroup 2 asShimwelliapseudoproteusgen. nov., sp. nov., and transfer ofEscherichiablattaetoShimwelliablattaecomb. nov. [J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2010, 60(4): 828-833.

[12]Stewart G G. Beer stability. In: Priest F G, Stewart G G. Handbook of Brewing[M]. Boca Raton: Taylor E Francis Group, 2006: 715-726.

[13]Paradh A D, Mitchell W J, Hill A E. Occurrence ofPectinatusandMegasphaerain the major UK breweries [J]. J I Brewing, 2011, 117(4): 498-506.

[14]Juvonen R, Suihho M L.Megasphaerapaucivoranssp. nov.,Megasphaerasueciensissp. nov. andPectinatushaikaraesp. nov., isolated from brewery samples, emended description of genusPectinatus[J].Int J Syst Evol Microbiol, 2006, 56(4): 695-702.

[15]Bokulich NA, Bamfortha CW. The microbiology of malting and brewing [J]. Microbiol Mol Bio Rev, 2013, 77(2): 157-172.

[16]Kalac P, Krízek M. A review of biogenic amines and polyamines in beer [J]. J I Brewing, 2003, 109(2): 123-128.

[17]Gasarasi G, Kelgtermans M, Verstrepen K J, et al. Occurrence of biogenic amines in beer: causes and proposal remedies [J]. Monatsschriftfur Brauwissenschaft, 2003, 56(3-4): 58-63.

[18]Barker C, Park S F. Sensitization ofListeriamonocytogenesto low pH, organic acids, and osmotic stress by ethanol [J]. Appl Environ Microbiol, 2001, 67(4): 1594-1600.

[19]Vriesekoop F, Krahl M, Hucker B, et al. 125th Anniversary review: bacteria in brewing: the good, the bad and the ugly [J]. J I Brewing, 2012, 118(4): 335-345.

[20]Menz G, Aldred P, Vriesekoop F. Pathogens in beer. In: Preedy V R. Beer in Health and Disease Prevention [M]. Amsterdam: Academic Press, 2009: 403-413.

[21]Hartnett DJ, Vaughan A, van Sinderen D. Antimicrobial-producing lactic acid bacteria isolated from raw barley and sorghum [J]. J I Brewing, 2002, 108(2): 169-177.

[22]Lowe D P, Arendt E K. The use and effects of lactic acid bacteria in malting and brewing with their relationships to antifungal activity, mycotoxins and gushing: a review [J]. J I Brewing, 2004,110(3):163-180.

[23]Noots I, Derycke V, Jensen H, et al. Studies on barley starchy endosperm cell wall degradation by Rhizopus VII [J]. J Cereal Sci, 2003, 37(1): 81-90.

[24]Rhee SJ, Lee JE, Lee CH. Importance of lactic acid bacteria in Asian fermented foods [J]. Microb Cell Fact, 2011, 10(S1): S5.

[25]Nandan A, Gaurav A, Pandey A, et al. Arginine specific aminopeptidase fromLactobacillusbrevis[J]. Braz Arch Biol Technol, 2010, 53(6): 1443-1450.

[26]Michlmay H, Hell J, Lorenz C, et al. Arabinoxylan oligosaccharide hydrolysis by family 43 and 51 glycosidases fromLactobacillusbrevisDSM 20054 [J]. Appl Environ Microbiol, 2013, 79(21): 6747-6754.

[27]Capozzi V, Russo P, Ladero V, et al. Biogenic amines degradation byLactobacillusplantarum: toward a potential application in wine [J]. Front Microbiol, 2012, 3: 122.

[28]Yang Z, Jin C, Gao L, et al. Alleviating effects ofLactobacillusstrains on pathogenicVibrioparahaemolyticus-induced intestinal fluid accumulation in the mouse model [J]. FEMS Microbiol Lett, 2013, 339(1): 30-38.

[29]Wada T, Noda M, Kashiwabara F, et al. Characterization of four plasmids harboured in aLactobacillusbrevisstrain encoding a novel bacteriocin, brevicin 925A, and construction of a shuttle vector for lactic acid bacteria andEscherichiacoli[J]. Microbiology, 2009, 155(5):1726-1737.

Advance in Beer Spoilage Microbes and Microbiological Stability of Beer

WANG Wei1,2, LIU Ya-wen2, GU Feng-xia2, SUN Zhen2, DU Guo-cheng1, LI Xian-zhen2

(1.Schl.ofBiotech.,JiangnanUni.,Wuxi214122;2.Schl.ofBio-Engin.,DalianPolytech.Uni.,Dalian116034)

Microbial beer-spoilage incidents still can happen during some stages of the production process despite of the environment and hygienic conditions in the brewery has been improved greatly, therefore, it is difficult to realize pure yeast beer brewing in real meaning. In order to effectively control the microbial contamination in the beer production, the microbial diversity in beer and the distribution of microbial sources in production working processes were introduced systematically in this paper. The effects of beer environment to contain microbial contamination was investigated, and the positive contribution of beer microbes on beer quality and flavor was discussed, and put forward that reasonably control foreign microbial invasion is the key of the formation of the typical characteristics of beer.

spoilage microbes； microbiological stability； brew； contamination； yeast

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371742)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201303095)；大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B11NC078)

王偉 男，博士研究生。研究方向?yàn)槠【莆⑸?。Tel: 0411-86318769，E-mail: dlww98@163.com

* 通訊作者。男，教授，博士生導(dǎo)師。主要從事微生物資源與生物催化研究。Tel: 0411-86323717, E-mail: xianzhen@mail.com

2015-01-04；

2015-03-22

Q93

A

1005-7021(2016)01-0080-09

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.014