李 航， 董 濤， 王明元,3*

(1.華僑大學(xué) 園藝系，福建 廈門 361021;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹(shù)研究所，廣東 廣州 510640；3.華僑大學(xué) 園藝科學(xué)與工程研究所，福建 廈門 361021)

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生物炭對(duì)香蕉苗根際土壤微生物群落與代謝活性的影響

李 航1， 董 濤2， 王明元1,3*

(1.華僑大學(xué) 園藝系，福建 廈門 361021;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹(shù)研究所，廣東 廣州 510640；3.華僑大學(xué) 園藝科學(xué)與工程研究所，福建 廈門 361021)

采用盆栽培養(yǎng)香蕉小苗，以生物炭與土壤的不同比例混合作為培養(yǎng)基質(zhì)。3個(gè)月后采集香蕉苗根際土壤，采用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定微生物數(shù)量；采用BIOLOG-ECO技術(shù)分析香蕉苗根際土壤微生物群落。結(jié)果顯示，生物炭的施加能夠顯著增加土壤中微生物數(shù)量，生物炭低量(C1)施加對(duì)真菌、放線菌的數(shù)量就有明顯提高，最高分別達(dá)到12.1×103cfu/g、10.2×104cfu/g。較高生物炭的施加量(C2、C3)顯著提高細(xì)菌、氨化細(xì)菌和固氮菌數(shù)量，最高分別達(dá)到8.8×106cfu/g、4.5×103cfu/g、17.0×105cfu/g。BIOLOG-ECO分析表明，生物炭的施加提高了微生物群落平均顏色變化率(Average well color development，AWCD)，多樣性指數(shù)和碳源利用豐度。生物炭的施加提高了香蕉苗根際微生物對(duì)碳源的利用能力。在同一時(shí)期，微生物對(duì)不同碳源的利用能力均表現(xiàn)為C3處理組最高，CK較低。結(jié)果表明，生物炭的添加對(duì)提高香蕉苗根際土壤微生物群落數(shù)量，改善微生物群落構(gòu)成和代謝具有顯著作用。

生物炭；香蕉苗；微生物；群落；BIOLOG-ECO

在熱帶、亞熱帶地區(qū)香蕉作為一種主要的經(jīng)濟(jì)水果被廣泛種植，被稱為“智慧之果”、“世界上第一種快餐食物”等美譽(yù)。香蕉的傳統(tǒng)栽培施用大量的化肥，導(dǎo)致香蕉園出現(xiàn)土壤結(jié)構(gòu)破壞，土壤板結(jié)，有機(jī)質(zhì)含量下降，微生物群落活力低等問(wèn)題[1]。生物炭是指在無(wú)氧條件下，將生物質(zhì)熱解轉(zhuǎn)化而成富含碳元素的固體物質(zhì)[2]。田間施用生物炭能明顯增加土壤有機(jī)質(zhì)[3]、無(wú)機(jī)質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、陽(yáng)離子交換量，調(diào)節(jié)土壤pH，增強(qiáng)土壤持水能力，進(jìn)而改善土壤環(huán)境[4]。此外，生物炭的多孔隙結(jié)構(gòu)為土壤中的微生物提供了有利的生長(zhǎng)繁殖環(huán)境，促進(jìn)植物根系周圍微生物群落的發(fā)育，根際微生物群落的呼吸作用與營(yíng)養(yǎng)代謝，促進(jìn)了植物的生長(zhǎng)。Demisie等[5]發(fā)現(xiàn)橡樹(shù)以及竹子所制生物炭可提高土壤中有機(jī)碳含量、土壤聚合性、微生物活性及炭在土壤中的存留時(shí)間，明顯改善紅土的土壤質(zhì)量。王曉輝等[6]研究表明生物炭的添加顯著提高了油菜栽培土壤pH，表明生物炭具有減緩?fù)寥浪峄降哪芰?。Rutigliano等[7]在小麥土地中添加生物炭，發(fā)現(xiàn)在最初3個(gè)月中，土壤微生物底物誘導(dǎo)呼吸作用和一些酶的比活力有明顯提升。谷思玉等[8]通過(guò)盆栽實(shí)驗(yàn)研究不同量生物炭對(duì)大豆根際土壤微生物影響，發(fā)現(xiàn)添加生物炭可明顯提高酸性土壤pH值和微生物數(shù)量，土壤中的有機(jī)碳、有效磷、速效鉀等也顯著提高。近年來(lái)，生物炭作用于植物及土壤微生物的研究日趨增多，已經(jīng)成為生物炭領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，但生物炭對(duì)香蕉幼苗及根際土壤微生物群落的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。目前，對(duì)于土壤微生物群落的研究方法有很多，如脂肪酸分析、FISH、TGGE、DGGE等方法，但都無(wú)法體現(xiàn)微生物群落的總體活性和代謝功能信息[9]。生物炭對(duì)土壤的研究目前還主要集中于對(duì)土壤微生物與土壤酶的傳統(tǒng)研究，對(duì)土壤微生物群落功能的研究還不夠。而B(niǎo)IOLOG技術(shù)經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展已經(jīng)越來(lái)越成熟，在對(duì)不同管理的農(nóng)業(yè)土壤、草地、森林土壤、植物根際和堆肥環(huán)境下都可以有效地描述微生物群落的代謝功能多樣性[10]。本研究通過(guò)微生物量計(jì)數(shù)測(cè)定以及BIOLOG技術(shù)對(duì)土壤微生物進(jìn)行研究，以討論生物炭的添加對(duì)香蕉苗根際微生物的影響，以期為生物炭在香蕉園的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤 取自華僑大學(xué)廈門校區(qū)，將土壤中的枯枝、根系、土壤動(dòng)物、大石塊等雜物挑除后，晾干備用。

1.1.2 供試作物 香蕉(Musaparadisiaca)：中蕉3號(hào)幼苗，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所提供。

1.1.3 供試生物炭 由香蕉假莖經(jīng)過(guò)高溫厭氧制備，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 利用盆栽實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)4個(gè)實(shí)驗(yàn)組：不施加生物炭組(CK)，生物炭施加(生物炭施加量重量百分比)組1%(C1)、2%(C2)、3%(C3)，共4個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)5盆，每盆裝入土壤或生物炭土壤混合基質(zhì)共5 kg，共20盆。2014年4月12日，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的中蕉3號(hào)香蕉苗定植盆中，每盆1棵。放置在華僑大學(xué)園藝系溫室培養(yǎng)，常規(guī)管理。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 通過(guò)平均顏色變化率(Average well color development，AWCD)、物種豐度指數(shù)(H)、均勻度指數(shù)(E)和碳源利用豐度指數(shù)(S)對(duì)BIOLOG-ECO板進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[16-17]：①平均顏色變化率計(jì)算方法(采用168 h數(shù)據(jù)，下同)：AWCD = Σ(C-R)/n。其中，C為每個(gè)平板小孔在590 nm和750 nm兩波段處的光密度差值，若差值為負(fù)值或小于0.06則以0計(jì)算；R表示對(duì)照孔的光密度值；n為培養(yǎng)基碳源種類數(shù)(在ECO板中n為31)。②物種豐度指數(shù)計(jì)算方法：H=-ΣP(lnP)。其中P為每個(gè)孔的相對(duì)吸光度與整個(gè)平板相對(duì)吸光度之和間的比值：P=(C-R)/Σ(C-R)。③均勻度指數(shù)計(jì)算方法：E=H/lnS。④碳源利用豐度指數(shù)S：為利用碳源數(shù)量總和。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2003，Origin(V8)進(jìn)行處理，主成分分析采用IBM SPSS Statistics 19統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 施加生物炭對(duì)香蕉苗根際土壤微生物數(shù)量的影響

2.1.1 施加生物炭對(duì)細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量的影響 由圖1A可知，香蕉苗土壤施加生物炭培養(yǎng)3個(gè)月后， C1、C2、C3處理中細(xì)菌數(shù)量相較于CK均有明顯升高，呈現(xiàn)CK

圖1 生物炭對(duì)香蕉苗根際土壤細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量的影響Fig.1 Effects of biochar on bacteria, fungus and actinomycetes in rhizospheric soil of banana seedlings

2.1.2 施加生物炭對(duì)放線菌、固氮菌數(shù)量的影響 圖2A為在各處理組中香蕉苗根際土壤中固氮菌數(shù)量的情況，表現(xiàn)為CK

圖2 生物炭對(duì)香蕉苗根際土壤固氮菌、氨化細(xì)菌數(shù)量的影響Fig.2 Effects of biochar on azotobacter and ammonifying bacteria in rhizospheric soil of banana seedlings

2.2 香蕉苗根際土壤微生物群落代謝情況

2.2.1 施加生物炭對(duì)微生物群落AWCD的影響 如圖3所示，不同生物炭處理組的AWCD隨著時(shí)間呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，各曲線均有一段延緩期，可能是由于培養(yǎng)溫度較低，微生物群落活性也較低，需要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)才能達(dá)到較高的活性。CK組的拐點(diǎn)出現(xiàn)在72 h，C1組在48 h，C2、C3組在36 h。在168 h內(nèi)，AWCD的最大值與變化速率均呈現(xiàn)C3>C2>C1>CK。這說(shuō)明了生物炭的添加明顯提高了香蕉苗根際土壤中微生物利用碳源的能力，從而提高了微生物群落的活性，并且隨著添加碳源量的增加而增加。

圖3 不同生物炭處理對(duì)微生物群落AWCD的影響變化Fig.3 Effects of biochar on microbial communities AWCD

2.2.2 施加生物炭對(duì)香蕉苗根際土壤微生物群落多樣性的影響 從表 1可以看出，生物炭處理組中微生物群落多樣性指數(shù)與均勻度指數(shù)均明顯高于CK組，表明根際土壤中的微生物復(fù)雜性、功能多樣性隨著生物炭施加量的增加而增加。同時(shí)，生物炭處理組也與CK組的均勻度指數(shù)呈顯著差異，表明生物炭在改善微生物種群均勻度方面也有明顯作用。生物炭施加組碳源利用豐度高于CK組，但組間差異不明顯，說(shuō)明生物炭的施加未能改變微生物群落利用底物碳源的數(shù)量。從168 h時(shí)的AWCD比較可看出，生物炭的添加明顯提高了AWCD值，并且隨著生物炭添加量的增加，對(duì)應(yīng)AWCD值增加的效果也越明顯。

2.2.3 施加生物炭對(duì)土壤微生物群落碳源利用能力的影響 圖4為不同生物炭處理后，香蕉苗根際土壤中微生物連續(xù)168 h對(duì)六大類碳源的利用情況。由圖4可看出，培養(yǎng)72 h后各組間利用碳源的情況出現(xiàn)差異，并在168 h各處理組達(dá)到最大值。其中復(fù)合物、糖類、羧酸類、氨基酸類具有較高AWCD值，說(shuō)明它們是微生物群落利用的主要碳源，而胺類和酚類化合物明顯利用較少。糖類、氨基酸類和胺類均呈現(xiàn)C3>C2>C1>CK的趨勢(shì)，而復(fù)合物與羧酸類碳源為C3>C1>C2>CK，酚類碳源為C3>C2>CK>C1。復(fù)合物和胺類在168 h培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)各處理組間未出現(xiàn)顯著差異。糖類和羧酸類分別在120 h和96 h開(kāi)始生物炭處理組AWCD值顯著高于CK組，但處理組間未有顯著差異。氨基酸48 h開(kāi)始生物炭處理組就與CK組產(chǎn)生顯著差異，并在之后的培養(yǎng)中高濃度生物炭處理組(C2、C3)顯著高于低濃度處理組(C1)。酚類碳源的AWCD值在48 h后高濃度生物炭處理組(C2、C3)顯著高于空白組(CK)與低濃度生物炭處理組(C1)。表明生物炭的施加可以促進(jìn)香蕉苗根際微生物群落對(duì)主要碳源的利用。同時(shí)較高濃度的生物炭施加還能提高根際微生物對(duì)胺類、酚類碳源的利用能力。

表1 不同生物炭施加量對(duì)土壤微生物群落多樣性指數(shù)和168 h AWCD的影響

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(下同)

圖4 不同生物炭量施加對(duì)土壤微生物碳源底物AWCD的影響Fig.4 Effects of biochar on AWCD of carbon substrate by soil microbial community

通過(guò)主成分分析，可以利用降維思想，從大量的數(shù)據(jù)中揭示出存在于微生物群落之間的功能差異性，在主成分分析后可以用點(diǎn)在降維后的主元向量空間中的位置來(lái)反映不同的微生物群落功能性關(guān)系的遠(yuǎn)近。圖5為不同生物炭處理組香蕉苗根際土壤微生物群落多樣性的主成分分析圖。從圖5中可以看出，主成分PC1的貢獻(xiàn)率為58.46%，主成分PC2貢獻(xiàn)率為25.34%，PC1遠(yuǎn)大于PC2， PC1更能反映出不同處理組間的差異，因此可以根據(jù)PC1對(duì)微生物群落功能性進(jìn)行分析。觀測(cè)各處理組點(diǎn)的分布，可發(fā)現(xiàn)CK組處于PC1負(fù)端方向，C1組接近零點(diǎn)，而C2、C3生物炭處理組則集中在PC1的正向方向，生物炭處理組與CK組表現(xiàn)出明顯的分布差異。這表明CK組與生物炭處理組在生物群落功能性方面具有明顯差異，生物炭對(duì)于增強(qiáng)土壤中微生物群落功能性具有顯著的作用。同時(shí)，不同量生物炭處理組點(diǎn)并沒(méi)有十分集中，表明生物炭的添加不同程度地影響了微生物群落的功能性。

圖5 不同生物炭施加量對(duì)根際土壤微生物群落代謝特性的主成分分析Fig.5 Principal component analysis in metabolic characteristic of rhizospheric soil microbial community under different biochar treatments

3 討 論

土壤中施加生物炭可以顯著增加微生物數(shù)量，這與生物炭的自身特性有密切關(guān)系[18-19]。生物炭對(duì)微生物生長(zhǎng)的促進(jìn)可能源于以下幾個(gè)方面[20]：生物炭均有豐富的孔隙結(jié)構(gòu)，添加到土壤中后，明顯優(yōu)化了土壤的保肥能力和通氧量進(jìn)而促進(jìn)了微生物的生長(zhǎng)。另外，生物炭大的比表面積與大量孔徑結(jié)構(gòu)為微生物提供了良好的附著點(diǎn)和理想的生長(zhǎng)場(chǎng)所。生物炭高溫制備過(guò)程中同時(shí)也形成很多新的碳源類型，增加了土壤中的微生物種類。

研究發(fā)現(xiàn)，施加生物炭不同程度地促進(jìn)了土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌、固氮細(xì)菌和氨化細(xì)菌的生長(zhǎng)。Doan等[21]發(fā)現(xiàn)，在施肥土壤中配合施加生物炭，土壤中的細(xì)菌數(shù)較未施加生物炭有明顯提高。可能是由于生物炭的多孔、疏松特性，為土壤中細(xì)菌提供了更多的生長(zhǎng)空間，從而提高了細(xì)菌的數(shù)量。大量的細(xì)菌代謝活動(dòng)和生物炭帶入的大量營(yíng)養(yǎng)元素也改善了土壤肥力情況。生物炭的施加明顯提高氨化細(xì)菌的數(shù)量，而氨化細(xì)菌在將土壤中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮的初始階段起著關(guān)鍵作用[22]，故氨化細(xì)菌增加了土壤中植物可以直接吸收的無(wú)機(jī)氮含量，間接促進(jìn)植物生物量的增加。

Garland等[16]在1991年首先利用BIOLOG微孔板對(duì)微生物菌落特征進(jìn)行描述，隨后BIOLOG微孔板在微生物群落功能研究領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越多[23]。AWCD能夠反映出不同微生物群落對(duì)碳源利用的總能力和功能的多樣性，故AWCD是反映微生物群落代謝的重要指標(biāo)[24-25]。研究表明，AWCD值越高，土壤微生物群落的代謝功能越強(qiáng)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，施加生物炭的土壤微生物群落AWCD在各時(shí)期均高于CK，并且，同一時(shí)期微生物群落AWCD值隨生物炭量的增加而升高。不同處理組的AWCD拐點(diǎn)的出現(xiàn)時(shí)間為C3、C2 36 h,C1 48 h,CK 72 h，原因可能是生物炭的施加導(dǎo)致微生物數(shù)量的不同，并且生物炭的添加促進(jìn)了香蕉苗根際土壤微生物群落的代謝能力。

微生物群落多樣性指數(shù)反映微生物群落中種群的多樣性，一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)微生物多樣性指數(shù)越高，表明微生物的種類越多、越復(fù)雜。同時(shí)反映該微生物群落的功能多樣性越高，反之則越低。微生物群落的碳源利用豐富度與均勻度反映了微生物群落對(duì)不同單一碳源利用的能力和種類中個(gè)體分布的均勻性。生物炭的施加使微生物群落同時(shí)在物種豐度指數(shù)、均勻度指數(shù)上與CK組間均出現(xiàn)了明顯差異，這都表明生物炭的施加促進(jìn)了土壤微生物的生長(zhǎng)，對(duì)微生物群落的代謝功能起到了促進(jìn)作用。BIOLOG-ECO 96微孔板中共有31種六大類碳源(第32為對(duì)照組：水)：復(fù)合物類、糖類、羧酸類、氨基酸類、胺類和酚類化合物[27]。微生物群落對(duì)于每種碳源的利用差異，可以通過(guò)底物碳源反應(yīng)后與顯色劑顯色的變化程度來(lái)體現(xiàn)。目前，利用BIOLOG-ECO技術(shù)研究生物炭對(duì)微生物群落的影響還鮮有報(bào)道，有研究者利用不同的方法、材料發(fā)現(xiàn)了生物炭對(duì)于微生物群落的促進(jìn)作用。Farrel等[28]通過(guò)磷酸脂肪酸分析(PLFAs)和復(fù)合同位素分析(CSIA)的方法，研究土壤微生物對(duì)生物炭中碳源的利用，研究發(fā)現(xiàn)，部分生物炭中的碳元素能夠被微生物利用于呼吸作用及磷酸酯的形成代謝中，從而促進(jìn)微生物群落的生長(zhǎng)。呂偉波[29]測(cè)定分析土壤中微生物量，發(fā)現(xiàn)生物炭能夠提高微生物量，且提高程度隨著濃度的增加而遞增。Muhammad等[30]也發(fā)現(xiàn)不同的生物炭及施加量均能明顯提高細(xì)菌、放線菌、革蘭陰性菌、硫酸還原菌的磷酸脂肪酸含量。但是他們的研究只能揭示生物炭的添加與微生物群落數(shù)量及分子信息方面的關(guān)系，無(wú)法解讀生物炭對(duì)于整個(gè)微生物群落代謝能力、活性的影響。而B(niǎo)IOLOG技術(shù)詳細(xì)地反映了這方面的信息。顧美英等[31]通過(guò)BIOLOG技術(shù)發(fā)現(xiàn)生物炭的施用對(duì)灰漠土與風(fēng)沙土連作棉田的根際、非根際土壤微生物群落的功能多樣性有顯著影響。特別是提高了羧酸類微生物的活性。張千豐[20]通過(guò)向白漿土中施加生物炭，發(fā)現(xiàn)生物炭可有效提高土壤中微生物群落多樣性指數(shù)、碳源利用數(shù)和均勻度指數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)了相似結(jié)論：生物炭的施加可顯著提高香蕉苗根際土壤微生物群落的物種豐度、均勻度，但碳源利用豐度未出現(xiàn)顯著差異。另外，我們發(fā)現(xiàn)生物炭的施加促進(jìn)了香蕉苗根際微生物群落對(duì)糖類、羧酸類和氨基酸類碳源的利用能力。較高濃度的生物炭施加對(duì)微生物群落利用酚類、胺類碳源的能力有促進(jìn)作用?？偟膩?lái)說(shuō)，生物炭的施加對(duì)香蕉苗根際微生物群落具有積極的促進(jìn)作用。

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Effects of Biochar on Microbial Communities and Metabolic Activity in Rhizospheric Soil of Banana Seedlings

LI Hang1, DONG Tao2, WANG Ming-yuan1,3

(1.Dept.ofHorticul., 2.Inst.ofPomology,GuangdongAcad.ofAgric.Sci.,Guangzhou510640；3.Inst.ofHorticul.Sci. &Engin.,HuaqiaoUni.,Xiamen361021)

Potting of banana seedlings was adopted with mixture of biochip and soil in different proportions as cultivation substrata. Rhizospheric soil of banana seedlings was collected three months after the cultivation. The amount of microbes was determined and tested adopting attenuation plat colonies counting and BIOLOG-ECO technique to analyze the rhizospheric microbial communities of banana seedlings. The results showed that the application of biochar significantly increased the quantities of microbes. Low application of biochar (C1) significantly increased the quantity of fungi and actinomycetes at the highest of 12.1×103cfu/g, 10.2×104cfu/g respectively. biochar amendment (C1), while bacteria, ammonifying bacteria and azotobacter were at the high at 8.8×106cfu/g, 4.5×103cfu/g, 17.0×105cfu/g as compared with higher biochar application (C2 and C3). BIOLOG-ECO analysis suggested that the application of biochar improved average well color development (AWCD) of microbial communities, diversity index of Shannon index (H) and carbon source utilization abundance of Evenness index (E). The biochar application improved the capability of rhizospheric microbial communities’ utilization rates of carbon source rate. In addition, the microbial communities’ utilization rates of carbon source in C3 treatment was the highest, and CK was fairly low in the same periods. Finally it was concluded that the addition of biochar had significant effects to improve the quantities of rhizospheric microbial communities and metabolism in banana seedlings.

biochar; banana seedlings; microbe; communities; BIOLOG-ECO

農(nóng)業(yè)部“948”計(jì)劃項(xiàng)目子課題(2011-G16)；廣東省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目(2012A020602023)；廣東省產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目(2012B091000159)

李航 男，碩士研究生。主要從事微生物生理生態(tài)研究。E-mail:lihang20093868@163.com

* 通訊作者。男，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)閳@藝植物生理生態(tài)。Tel: 0592-6162300, E-mail:mywang@hqu.edu.cn

2015-05-20；

2015-07-06

Q939.96

A

1005-7021(2016)01-0042-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.008