莊凱麗 廉姜芳

●綜 述

miRNA和siRNA在hERG基因相關(guān)疾病中的研究進(jìn)展

莊凱麗 廉姜芳

1991年Warmke等首先從果蠅中克隆到EAG（ether-a-go-go）基因，其編碼一種電壓門控性鉀通道，即EAG K+通道。EAG K+通道有3個亞家族，其中EAG相關(guān)基因(hERG)K+通道在人海馬中被發(fā)現(xiàn)，其編碼的K+通道稱為hERG K+通道[1]。hERG主要在心臟中表達(dá)，編碼快速激活延遲整流鉀通道的a亞基，在動作電位復(fù)極化中發(fā)揮重要作用。至今其相關(guān)研究從未中斷，并取得了一定的進(jìn)展，尤其是在長QT綜合征（KQTS）和腫瘤方面。1993年，Kee等[2]發(fā)現(xiàn)控制秀麗新小桿線蟲發(fā)育的時序性的基因lin-4不編碼蛋白質(zhì)，其相應(yīng)的mRNA水平?jīng)]有發(fā)生變化。這一矛盾現(xiàn)象沒有引起足夠的重視。2000年，Reinhart等[3]在秀麗新小桿線蟲中發(fā)現(xiàn)與lin-4類似的基因。自此，科學(xué)界開始了miRNA的時代。1999年，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)21～23ntRNA引發(fā)植物基因表達(dá)沉默[4]。進(jìn)一步研究揭示這種RNAi由雙鏈RNA轉(zhuǎn)換而來。筆者就miRNA和siRNA在hERG基因相關(guān)疾病中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 hERG

hERG編碼快速激活延遲整流鉀通道Ikr的α亞基，在心肌動作電位的復(fù)極化，消化、分泌、生殖系統(tǒng)的耦合收縮，神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳導(dǎo)和人體的發(fā)育等方面起著重要作用[5]。hERG基因因突變、藥物等因素可影響通道的轉(zhuǎn)運(yùn)，基因過表達(dá)或低表達(dá)以及異位過表達(dá)可出現(xiàn)相應(yīng)的功能異常。

2 miRNA與siRNA

小RNA主要包括miRNA和siRNA兩大類。此外，還有核糖體開關(guān)、反義核酸等非編碼RNA。但以siRNA和miRNA研究最多見。miRNA是長度在19～25nt的調(diào)控蛋白質(zhì)生物合成的一類重要的內(nèi)源性非編碼RNA。雙鏈miRNA分子被解鏈，單鏈的miRNA主要與AGO結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，然后可通過與靶mRNA的3′UTR近乎完全互補(bǔ)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平使其降解，或者與之不完全互補(bǔ)結(jié)合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而在基因表達(dá)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。人類基因編碼的miRNA多達(dá)1 800多種，調(diào)控約60%的基因。miRNA在人類的生理、病理生理過程中通過其自身的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)起著重要的作用。真核細(xì)胞沒有特定的基因編碼內(nèi)源性siRNA，siRNA具有特定長度（21～25nt）和特定序列的小片段RNA。siRNA與miRNA相似，也主要與AGO2結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，與靶序列mRNA完全互補(bǔ),通過降解靶序列導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。shRNA呈發(fā)卡狀，是siRNA的前體。

3 miRNA、siRNA在hERG基因相關(guān)疾病的研究

hERG基因相關(guān)性疾病中，以KQTS和腫瘤研究最多，其它相關(guān)性疾病少有研究。在腫瘤的研究進(jìn)展中，衍生出心臟-腫瘤學(xué)科[6-8]。

3.1 KQTS hERG基因突變或其參與編碼的Ikr通道受到藥物等因素影響后，心室復(fù)極延遲而引發(fā)Q-T間期延長，常并發(fā)室性心律失常，尤其是尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速（TdP）、暈厥，嚴(yán)重者可致心臟性猝死。

心肌miRNA的相關(guān)研究起步較晚且多是建立在骨骼肌研究基礎(chǔ)之上。2002年，Kagos-Quintana等[9]發(fā)現(xiàn)miR-1和miR-133在心肌組織表達(dá)最豐富,且有一定的組織特異性,說明這兩種miRNA對心肌細(xì)胞發(fā)育具有重要意義。Chen等[10]對此進(jìn)行了驗(yàn)證。之后的研究揭示了miRNA與心肌肥大、心肌缺血、糖尿病性心肌病等不同病理發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，且發(fā)現(xiàn)缺血性心肌病和糖尿病性心肌病中miR-133表達(dá)明顯增高，抑制ERG和KCNQ1基因的表達(dá)，引發(fā)Q-T間期延長，但miR-133對糖尿病性心肌的KCNQ1抑制作用不明顯[11]。Hedley等[12]發(fā)現(xiàn)miR-1-1和miR-133a-1基因序列沒有發(fā)生變化。雖然miR-1-2有一個位點(diǎn)（n.100A＞G）和miR-133a-2有兩個位點(diǎn)（n.19G＞A andn.98C＞T）的改變，但不影響miRNA的成熟?？梢钥闯?，miR-1-1，miR-1-2，miR-133a-1和miR-133a-2序列變化與先天性KQTS的發(fā)病無明顯關(guān)系。miR-133靶向小鼠的ERG基因，使Ikr通道功能喪失，Q-T間期延長，但是在hERG上還未發(fā)現(xiàn)其結(jié)合位點(diǎn)[13]。miR-133家族與miR-1的亞族共同調(diào)控hERG基因表達(dá)[14]。經(jīng)As2O3誘導(dǎo)后，豚鼠心肌細(xì)胞的miR-1和miR-133及其反式激活血清應(yīng)答因子表達(dá)水平均明顯上調(diào)，導(dǎo)致ERG蛋白水平下降，Q-T間期延長[15]。慢性氧化應(yīng)激過程中，miR-17-5p作用于多個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的伴侶Hsp70、Hsc70、CANX和Golga2，從而減少hERGK+通道蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)[16]。如圖1所示。

siRNA序列靶向干預(yù)已轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-hERG（野生型）、WT/E637K-hERG（雜合型）和E637K-hERG（突變型）的HEK-293細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其能有效地沉默E637K突變體的表達(dá)，并且不影響干預(yù)前細(xì)胞的生長和凋亡。在通道電流方面，siRNA不僅增加了雜合型電流幅度，而且糾正了通道電流的特性，但對野生型通道的電流幅度和通道特性沒有明顯的影響[17]。基于siRNA此作用特點(diǎn)，其在KQTS未來基因治療方面是很有前景的。Zarzoso等[18]就此項(xiàng)研究作出評論：小干擾RNA對于hERG K+通道轉(zhuǎn)運(yùn)的恢復(fù)是很有希望的一種基因治療方案。RNA干擾伴侶分子FKBp38而降低其表達(dá)水平，隨之hERG轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)了下降[19]。誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞在心臟疾病方面的研究已較為成熟。經(jīng)特異性RNA干擾攜帶KCNH2 c.G1681A突變基因的表達(dá)，心肌細(xì)胞的APD和K+電流可恢復(fù)正常[20]。如圖1所示。

圖1 miRNA和siRNA作用于心肌細(xì)胞ERG基因

3.2 腫瘤 由于腫瘤本質(zhì)上是一種多基因異常疾病，通過激活一種或多種原癌基因的表達(dá)及抑癌基因的突變?nèi)笔亩鼓[瘤細(xì)胞逃避了正常生長調(diào)控機(jī)制，自主進(jìn)行增殖和侵襲，出現(xiàn)惡性表型。hERG的癌癥組織中過表達(dá)，如腎癌[21]、神經(jīng)細(xì)胞瘤[22]、白血病[23]和乳腺癌[24]，與癌細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、發(fā)病和轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系[25]。阻礙通道的生成或抑制其轉(zhuǎn)運(yùn)成為癌癥治療的一個新途徑。

Calin等[26]于2002年首次對miRNA與腫瘤的關(guān)系作出報道，此后人們發(fā)現(xiàn)miRNA在多種腫瘤中特異表達(dá),并且在腫瘤的增殖、分化、侵襲轉(zhuǎn)移、治療效果中扮演了重要角色，在腫瘤的早期診斷及治療中可能具有重要意義。隨著對miRNA研究的深入，發(fā)現(xiàn)它們具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化和凋亡的功能。這些效應(yīng)通過調(diào)控信號分子，如細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、促凋亡和抗凋亡基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)[27]。這預(yù)示著miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后存在著密切的聯(lián)系。多項(xiàng)研究證實(shí)，某些miRNA在部分腫瘤中特異性高表達(dá)。如果它們的被抑靶基因是抑癌基因，其升高可以刺激腫瘤增殖、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移等，則這些miRNA扮演了癌基因角色[28]。另有證據(jù)提示miRNA尚可扮演抑癌基因的角色，不僅多個miRNA被發(fā)現(xiàn)在腫瘤中表達(dá)降低，而且通過抑制Drosha而降低miRNA生成時發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的惡性程度降低[29]。hERG1控性鉀離子通道的EAG家族成員之一，其編碼的鉀通道是一種特殊類型的鉀通道,具有內(nèi)向整流特性。研究發(fā)現(xiàn)hERG1基因在胰腺癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)，并與胰腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等生物活性密切相關(guān)，但其在腫瘤中的調(diào)控機(jī)制方面的作用尚不明確。miR-96可下調(diào)hERG1的表達(dá)，同時胰腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲方面也顯著受到了抑制。針對miR-96/herg1的基因靶向治療在胰腺癌的治療中有潛在的應(yīng)用前景[30]。多數(shù)急性髓細(xì)胞白血病異常表達(dá)miR-9/9，后者通過下調(diào)ERG基因表達(dá)來干擾正常的中性粒細(xì)胞分化[31]。TMPRSS2-ERG癌基因存在于50%以上前列腺癌患者，其表達(dá)預(yù)示預(yù)后不良。TMPRSS2-ERG基因融合誘發(fā)前列腺腫瘤，研究發(fā)現(xiàn)miR-200C參與此病理生理過程[32]。此外，miR-145可以調(diào)控前列腺癌原癌基因ERG的轉(zhuǎn)錄后水平來抑制疾病的發(fā)展進(jìn)程[33]。如圖2所示。

siRNA在腫瘤基因治療方面已有很多的研究[34]，但是siRNA的細(xì)胞毒性和低轉(zhuǎn)染率阻礙了其臨床治療方面的研究價值。Whitehead等[35]研究發(fā)現(xiàn)PAMAM-PEG-cRGD作為siRNA靶向hERG基因的載體，不僅在很大一定程度上提高了轉(zhuǎn)染效率，同時所產(chǎn)生細(xì)胞的毒性也是極低的，幾乎可以忽略。這對于其在hERG基因的小干擾RNA方面研究和未來的臨床應(yīng)用都具有一定的意義。在一些研究中，小干擾RNA作為沉默靶基因的實(shí)驗(yàn)方法。小干擾RNA轉(zhuǎn)染至胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1與CFPAC-1中,穩(wěn)定沉默hERG1基因[30]。hERG1基因在胃癌組織過表達(dá)，但在正常的黏膜上皮組織不表達(dá)，而且還發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與癌細(xì)胞的分化和臨床分期相關(guān)聯(lián)[36-37]。順鉑是臨床常用的化療藥物，對于其化療機(jī)制是否與hERG基因編碼的鉀通道有關(guān)，Zhang等[38]利用siRNA干擾作用靶向抑制hERG基因的表達(dá)與聯(lián)合順鉑進(jìn)行研究。結(jié)果顯示hERG與順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有著密切的相關(guān)性，對于推測hERG可能是順鉑化療的靶目標(biāo)提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞周期停滯和凋亡與hERG基因相關(guān)性研究中，同樣用小干擾RNA可抑制hERG基因表達(dá)[39]。小細(xì)胞型肺癌4個細(xì)胞系（SW2、OH1、OH3、H82）均有herg1的表達(dá)，在研究其在腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等機(jī)制時發(fā)現(xiàn)siRNA與ERG通道特異性阻滯劑E-4031效應(yīng)不完全不同，抑制hERG1蛋白的表達(dá)后癌細(xì)胞的增殖減少近50%，通道電流幾乎消失。而E-4031雖然改變通道電流，但并不影響癌細(xì)胞的增殖[40]。Urbinati等[41]發(fā)現(xiàn)siRNA能夠有效地抑制TMPRSS2-ERG癌基因的表達(dá)，有明顯的抗腫瘤效應(yīng)。shRNA與成神經(jīng)細(xì)胞瘤hERG基因結(jié)合，使其停滯在G0/G1期，延緩細(xì)胞增長速度，降低細(xì)胞活性，抑制集落形成。在裸鼠的腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)入shRNA，腫瘤受到了抑制[42]。shRNA沉默herg基因表達(dá)對于延緩腫瘤的增長具有一定的臨床治療意義[43]。如圖2所示。

圖2 miRNA和siRNA作用于腫瘤hERG/hERG1/TMPRSS2-ERG基因

3.3 其它疾病 hERG基因除心臟和腫瘤組織外也有表達(dá)，但在如消化、內(nèi)分泌等系統(tǒng)相關(guān)的miRNA和siRNA研究甚少，故不作敘述。

4 展望

hERG基因表達(dá)異常引發(fā)室性心律失常，嚴(yán)重者可致患者死亡，其臨床診斷困難，治療效果有限。基因診斷和治療或許可以為臨床開辟一條新出路。miRNA在 hERG基因相關(guān)疾病主要扮演病理性的角色，過度上調(diào)或下調(diào)均可引起離子通道的紊亂。miRNA作為診療標(biāo)志物應(yīng)用于臨床具有一定的前景；shRNA和siRNA其作用機(jī)制為降解靶基因hERG基因片段。與miRNA相比，其基因治療效果更明顯。但是機(jī)體有著復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)信號通路，miRNA和干擾RNA基因治療不可避免地干擾其它通道的正常功能。而其如何安全有效地導(dǎo)入靶器官成為基因治療的又一大挑戰(zhàn)。

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2015-10-08）

（本文編輯：馬雯娜）

國家自然科學(xué)基金（81370207）；浙江省自然科學(xué)基金（LY13H020009）

315211 寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院（莊凱麗）；寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院心內(nèi)科（廉姜芳）