龔業(yè)莉 李佳楠 黃麗霞

(江漢大學(xué)，武漢430056 )

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高麗參提取液對(duì)大鼠自身免疫性腦脊髓膜炎的保護(hù)作用①

龔業(yè)莉 李佳楠 黃麗霞②

(江漢大學(xué)，武漢430056 )

目的：探討高麗參提取液(Korean red ginseng extract，KRG)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)的治療作用及相關(guān)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。方法：取SD大鼠30只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組(實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型)和實(shí)驗(yàn)組(高麗參提取液治療)，每組10只，對(duì)EAE大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分及體重測(cè)量，通過病理學(xué)HE染色和免疫組化觀察25 d腦和脊髓炎癥浸潤(rùn)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠脊髓和淋巴結(jié)CD4+、CD4+/IFN-γ+(Th1)、CD4+/IL-17+(Th17)和CD4+/Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量，實(shí)時(shí)熒光定量q-PCR檢測(cè)大鼠脊髓和淋巴結(jié)IFN-γ、IL-17、IL-23和Foxp3 mRNA水平的表達(dá)。結(jié)果：治療組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯改善，體重明顯增加；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)癥狀和病理改變減輕；與模型組相比，治療組中大鼠脊髓和淋巴結(jié)CD4+、CD4+/IFN-γ+、CD4+/IL-17+T細(xì)胞數(shù)量減少，而CD4+/Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量增多(P<0.05)；大鼠脊髓和淋巴結(jié)IFN-γ、IL-17、IL-23 mRNA表達(dá)下降，而Foxp3 mRNA表達(dá)增加(P<0.05)。結(jié)論：高麗參提取液通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的CD4+、CD4+/IFN-γ+、CD4+/IL-17+和CD4+/Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量和CD4+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的水平對(duì)EAE起保護(hù)作用。

高麗參提取液；自身免疫性腦脊髓膜炎；白介素-17；白介素-23

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(Experimental autoimmune encephalomyelintis， EAE)是一種主要由T細(xì)胞介導(dǎo)的，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)脫髓鞘以及炎癥浸潤(rùn)為主要特征的自身免疫性疾病。目前關(guān)于EAE發(fā)病機(jī)制并不明確，也缺乏理想藥物進(jìn)行治療。研究發(fā)現(xiàn)，高麗參提取液(Korean red ginseng extract，KRG)在預(yù)防糖尿病以及動(dòng)脈硬化、高血壓等方面具有明顯的效果，此外，高麗參還具有促進(jìn)血液循環(huán)，防止疲勞，增強(qiáng)免疫力以及抗癌等方面的療效[1-3]。近年來也有研究表明，高麗參提取液對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)也具有保護(hù)作用[4，5]。本研究采用豚鼠全脊髓勻漿制備大鼠EAE模型，探討高麗參提取液對(duì)EAE的作用，并觀察大鼠行為學(xué)變化和CNS的病理學(xué)改變，試圖為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 大鼠30只，雌性，6～8周，150～200 g。豚鼠6只，雌雄不拘，250～300 g，均由華中科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 材料和試劑 高麗參提取液，濃度為1 ml含生藥3 g，湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供。髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)多肽片段由聯(lián)美生物科技有限公司合成；結(jié)核菌素、百日咳毒素(Difco公司，美國(guó))；完全弗氏佐劑(Sigma公司，美國(guó))；Real-time PCR試劑盒(TaKaRa公司，日本)；熒光團(tuán)標(biāo)記的抗小鼠單克隆抗體(mAb)：APC-CD4、FITC-IFN-γ、PE-IL-17、APC-Foxp3及同型對(duì)照均購(gòu)自eBiosciences公司。ABI 7500 PCR儀(ABI公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備 30只SD大鼠隨機(jī)分為3組：正常組，模型組和實(shí)驗(yàn)組(每組10只)，實(shí)驗(yàn)組與模型組：實(shí)驗(yàn)組大鼠分別于背側(cè)中線兩側(cè)皮下四點(diǎn)髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)與完全弗氏佐劑(CFA)混合的乳化抗原(100 μg/只)，免疫當(dāng)天及第2天給小鼠皮下注射百日咳疫苗(BPV)0.1 ml(含菌量為1010個(gè)/ml)。正常組：大鼠腳墊皮內(nèi)注射CFA和0.9%NaCl溶液制成的乳劑，注射部位和劑量同模型組。實(shí)驗(yàn)組在免疫前，灌胃高麗參提取液50 mg/kg，連續(xù)給予7 d預(yù)處理；模型組和正常對(duì)照組在造模前用等量的0.9%NaCl溶液灌胃7 d預(yù)處理。免疫當(dāng)日計(jì)算為0 d。

1.2.2 臨床EAE癥狀評(píng)分 從免疫當(dāng)天起，每天對(duì)大鼠進(jìn)行稱重，并對(duì)其精神狀況和活動(dòng)情況等行為學(xué)指征進(jìn)行觀察，并進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用國(guó)際通用的Correar 6分[6]評(píng)分法：無(wú)明顯異常為0分，大鼠擺尾無(wú)力為1分，后肢無(wú)力為2分，后肢癱瘓3分，前、后肢全癱瘓4分，瀕死狀態(tài)或死亡5分。將評(píng)分≥1分視為EAE發(fā)病大鼠。

1.2.3 組織學(xué)檢測(cè) 大鼠稱重后，腹腔注射10%的水合氯醛4 ml/kg。麻醉后，固定于解剖板上，備皮，消毒，迅速取出腦組織和腰髓節(jié)段。中性福爾馬林緩沖溶液固定72 h，分別取腦干及腰髓節(jié)段石蠟切片，然后進(jìn)行HE染色。并根據(jù)文獻(xiàn)[7]進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+、CD4+/IFN-γ+、CD4+/IL-17+和CD4+/Foxp3+T細(xì)胞表達(dá) 25 d處死各組大鼠，無(wú)菌條件下分別獲取大鼠脊髓和淋巴結(jié)，通過機(jī)械研磨、裂解紅細(xì)胞后，PBS洗3次，制成單個(gè)核細(xì)胞懸液。加入APC-CD4、FITC-IFN-γ、PE-IL-17、APC-Foxp3 抗大鼠mAb及同型對(duì)照抗體三標(biāo)記細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 Real-time PCR(q-PCR)檢測(cè)IFN-γ、IL-17、IL-23和Foxp3 mRNA表達(dá) 25 d提取各組大鼠脊髓和淋巴結(jié)，加入Trizol 試劑提取總RNA，用Real-time PCR Kit(TaKaRa 公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用SYBR green Ⅰ Real-time PCR Kit(TaKaRa 公司)試劑盒擴(kuò)增目的基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，GAPDH作為內(nèi)參。各基因引物序列見表1。

2 結(jié)果

2.1 臨床EAE癥狀評(píng)分 體重方面，空白對(duì)照組至25 d體重持續(xù)增長(zhǎng)，皮毛光滑，未見異常。模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠體重均有不同程度下降，起病8 d明顯下降，進(jìn)食少，活動(dòng)少，皮毛粗糙，至第15天體重達(dá)最低點(diǎn)，而后體重逐漸增長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組較模型組體重下降程度輕，實(shí)驗(yàn)組與模型組免疫后8～25 d體重變化差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。神經(jīng)功能評(píng)分方面，空白對(duì)照組平均評(píng)分為0分，模型組大鼠在免疫后第6天開始發(fā)病，至第14天達(dá)到高峰，表現(xiàn)為雙下肢癱瘓，肌力下降，二便失禁；實(shí)驗(yàn)組大鼠表現(xiàn)為相對(duì)緩慢的起病過程，臨床癥狀也相對(duì)較輕，實(shí)驗(yàn)組與模型組免疫后6～25 d神經(jīng)功能評(píng)分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1，各組大鼠發(fā)病和轉(zhuǎn)歸情況見表2。

2.2 組織學(xué)變化 HE染色顯示，對(duì)照組大鼠腦和脊髓未發(fā)現(xiàn)炎癥浸潤(rùn)，而模型組大鼠腦和脊髓均有不同程度的炎癥浸潤(rùn)，以血管周圍為主，尤其靜脈周圍明顯，呈“袖套狀”變化，病癥多發(fā)性，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以腦干最明顯，脊髓次之。實(shí)驗(yàn)組較模型組腦和脊髓炎癥浸潤(rùn)顯著減輕，其病灶數(shù)和“袖套狀”均顯著低于模型組。組織學(xué)評(píng)分，與模型組腦和脊髓組織學(xué)評(píng)分分別為(3.96±0.93)和(3.06±0.81)，實(shí)驗(yàn)組腦和脊髓組織學(xué)評(píng)分分別為(2.59±0.49)和(1.88±0.57)。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組在腦和脊髓的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.696，P=0.000；t=10.483，P=0.000)。見圖2。

表1 各基因引物序列

Tab.1 Primer sequences for target genes

TargetgenesPrimersequencesIFN?γUpstreamGAAAGCCTAGAAAGTCTGAATAACDownstreamGCAGCGACTCCTTTTCCGCTTCCTIL?17UpstreamCTCAGACTACCTCAACCGTTCCDownstreamAGGATCTCTTGCTGGATGAGAACIL?23UpstreamGACCTGCTGGCAATAGCTTCDownstreamGGGTCTCCCAAGGAAAGGTAFoxp3UpstreamTGCATCAGCTCTCCACTGTADownstreamCTGTCTTTCCTGGGTGTACCTGAGCGGAPDHUpstreamAGGTCATCCCAGAGCTGAACGDownstreamCACCCTGTTGCTGTAGCCGTAT

2.3 各組大鼠脊髓及淋巴結(jié)CD4+、CD4+/IFN-γ+、CD4+/IL-17+和CD4+/Foxp3+T細(xì)胞表達(dá) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，第25天，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠脊髓和淋巴結(jié)CD4+、CD4+/IFN-γ+、CD4+/IL-17+T細(xì)胞數(shù)量上調(diào)，而CD4+/Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.05)。與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組中大鼠脊髓和淋巴結(jié)CD4+、CD4+/IFN-γ+、CD4+/IL-17+T細(xì)胞數(shù)量減少，而CD4+/Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量增多(P<0.05)。見圖3。

圖1 免疫后各組大鼠平均體重和癥狀評(píng)分變化Fig.1 Changes of average weight and symptom scoring after immunizationNote: *.P<0.05,vs control group；#.P<0.05,vs model group.

圖2 大鼠腦及脊髓組織學(xué)觀察(HE，×200)Fig.2 HE staining of brain and spinal cord(HE×200)Note: A.Control group of the brain；B.Model group of the brain;C.Test group of the brain;D.Control group of the spinal cord；E.Model group of the spinal cord;F.Test group of the spinal cord.

表2 各組動(dòng)物發(fā)病和轉(zhuǎn)歸情況

Tab.2 Incidence and prognosis of rats in all groups

GroupsNumberIncidenceLatency(d)MortalityControlgroup100/1000±000/10Modelgroup1010/1067±071)0/10Testgroup1010/1078±062)0/10

Note：1)P<0.05,vs control group,2)P<0.05,vs model group.

2.4 各組大鼠脊髓及淋巴結(jié)IFN-γ、IL-17、IL-23和Foxp3 mRNA表達(dá) q-PCR結(jié)果顯示，第25天，與正常對(duì)照組比較，模型組脊髓和淋巴結(jié)IFN-γ、IL-17、IL-23 mRNA表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)增高(P<0.05)。而與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠脊髓和淋巴結(jié)IFN-γ、IL-17、IL-23 mRNA表達(dá)下降，而Foxp3 mRNA表達(dá)增加(P<0.05)。見圖4。

圖3 各組大鼠脊髓及淋巴結(jié)CD4+、CD4+/IFN-γ+、CD4+/IL-17+和CD4+/Foxp3+ T細(xì)胞表達(dá)Fig.3 Expression of CD4+，CD4+/IFN-γ+，CD4+/IL-17+ and CD4+/Foxp3+ T cells in spinal cord and lymph nodeNote: *.P<0.05，vs control group；#.P<0.05，vs model group

圖4 各組大鼠脊髓及淋巴結(jié)IFN-γ、IL-17、IL-23和Foxp3 mRNA表達(dá)Fig.4 mRNA expression of IFN-γ，IL-17，IL-23 and Foxp3 in spinal cord and lymph nodeNote: *.P<0.05，vs control group；#.P<0.05，vs model group.

3 討論

EAE中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變與效應(yīng)性T細(xì)胞過度活化以及炎癥細(xì)胞在CNS中過度浸潤(rùn)相關(guān)，也與炎癥細(xì)胞因子和介質(zhì)的高表達(dá)密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過MOG成功誘導(dǎo)大鼠建立的EAE模型，行為學(xué)上表現(xiàn)為發(fā)病期行動(dòng)遲緩，步態(tài)異常，體重下降，尾巴及肢體癱瘓；病理見腦干以及脊髓炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和血管“袖套”樣改變等，驗(yàn)證了文獻(xiàn)報(bào)道[8]，經(jīng)KRG預(yù)處理后，實(shí)驗(yàn)組大鼠體重及癥狀評(píng)分明顯改善，且腦干以及脊髓炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和血管“袖套”樣改變也得到明顯減輕，炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯下調(diào)，提示KRG可通過抑制CNS中炎性反應(yīng)從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

大多數(shù)研究認(rèn)為在EAE的免疫機(jī)制中，特異性抗原如MBP誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答，CD4+Th細(xì)胞由Th0向Th1、Th2或Th3細(xì)胞分化[9,10]。Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ以及Th17細(xì)胞分泌IL-17和IL-23，促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)EAE；而Th2細(xì)胞主要有IL-4所驅(qū)動(dòng)誘發(fā)，主要分泌IL4、IL-10、TGF-13等，促進(jìn)B細(xì)胞增生，增強(qiáng)抗體介導(dǎo)的體液免疫，抑制EAE[11]。IL-17能夠刺激多種細(xì)胞，誘發(fā)炎性細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及化學(xué)因子等，IL-17主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，其致炎性較強(qiáng)，缺失Th17的細(xì)胞能夠顯著緩解一些自身免疫疾病的發(fā)生，如EAE等[12]。研究發(fā)現(xiàn)，EAE大鼠模型中，IL-17高峰的出現(xiàn)較IFN-γ早；但I(xiàn)FN-γ高峰持續(xù)時(shí)間較IL-17長(zhǎng)，提示Th1及Th17的分化表達(dá)的一個(gè)主要特點(diǎn)就是階段性[13]。EAE大鼠早期CNS的發(fā)病中Th17細(xì)胞發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，而后期組織炎癥反應(yīng)中Th1細(xì)胞發(fā)揮著至關(guān)重要的主導(dǎo)作用[14,15]；本實(shí)驗(yàn)中，通過KRG預(yù)處理后，EAE大鼠CD4+、CD4+/IFN-γ+(Th1)、CD4+/IL-17+(Th17)T細(xì)胞數(shù)量減少，而CD4+/Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量增多。為了從分子水平驗(yàn)證以上結(jié)果，我們通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IFN-γ、IL-17、IL-23和Foxp3 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型組脊髓和淋巴結(jié)IFN-γ、IL-17、IL-23 mRNA表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)增高，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[16]。而與模型組相比，大鼠脊髓和淋巴結(jié)IFN-γ、IL-17、IL-23 mRNA表達(dá)下降，而Foxp3 mRNA表達(dá)增加。綜上可知，KRG可通過下調(diào)IFN-γ、IL-17、IL-23 mRNA表達(dá)抑制CD4+/IFN-γ+(Th1)、CD4+/IL-17+(Th17)T細(xì)胞的表達(dá)，而通過上調(diào)Foxp3 mRNA表達(dá)增強(qiáng)CD4+/Foxp3+T細(xì)胞表達(dá)，提示KRG可通過上調(diào)Treg數(shù)量，調(diào)節(jié)Th1/Th17細(xì)胞比例，從而增強(qiáng)其免疫抑制活性，影響EAE進(jìn)展，改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臨床相關(guān)癥狀。

綜上所述，高麗參提取液可通過對(duì)Th1、Th17、Foxp3基因以及相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行調(diào)節(jié)，有效降低大鼠EAE的臨床癥狀，改善神經(jīng)中樞系統(tǒng)的炎癥浸潤(rùn)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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[收稿2016-03-24 修回2016-04-28]

(編輯 許四平)

Protective effect of korean red ginseng extract in experimental autoimmune encephalomyelitis rats

GONG Ye-Li ,LI Jia-Nan,HUANG Li-Xia，

Jianghan University，Wuhan 430056 China

Objective:To establish experimental autoimmune cerebral spinal cord inflammation (EAE) model rats,and observe the pathological changes and effect of korean red ginseng extract on EAE model. Methods: 30 SD rats were randomly divided into control group,EAE (model group) group and KRG group.The EAR symptom score and body weight were used to evaluate the rats after the model.The inflammation of the brain and spinal cord demyelinating changes were observed by HE staining.The frequency of CD4+,CD4+/IFN-γ+,CD4+/IL-17+and CD4+/Foxp3+T cells were measured by flow cytometry,and the expression of Foxp3,IFN-γ,IL-17 and IL-23 mRNA were evaluated by Real time-PCR in spinal cord and lymph node. Results: KRGE significantly attenuated symptom score and loss of body weight.Compared with model group,neurological impairment and pathological change were alleviated in KRG group.The number of CD4+,CD4+/IFN-γ+,CD4+/IL-17+were down-regulated in KRG,and the number of CD4+/Foxp3+was up-regulated in the spinal cord and lymph node compared with the model group(P<0.05).The levels of Foxp3 mRNA was also significantly increased,while the levels of IFN-γ，IL-17，IL-23 mRNA were markedly decreased(P<0.05). Conclusion: KRG could have an effect on prevention on EAE in SD rats,may be related to its ability to the regulations the expression levels of CD4+,CD4+/IFN-γ+,CD4+/IL-17+and CD4+/Foxp3+.

Korean red ginseng extract;Experimental autoimmune encephalomyelitis;Interleukin-17;Interleukin-23

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.014

①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81302528)和武漢市青年科技晨光計(jì)劃項(xiàng)目(2015071704011601)資助。

龔業(yè)莉(1985年-)，女，博士，講師，主要從事自身免疫病研究，E-mail：lilygreen66@163.com。

R285.5

A

1000-484X(2016)11-1632-04

②通訊作者，E-mail：hlxgw2011@163.com。