衛(wèi) 青，吳平艷，段 孟，張振強(qiáng)，劉維涓 (云南瑞升煙草技術(shù)(集團(tuán))有限公司，云南昆明 650106)

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再造煙葉濃白水中蛋白質(zhì)提取工藝的優(yōu)化研究

衛(wèi) 青，吳平艷，段 孟，張振強(qiáng)，劉維涓*(云南瑞升煙草技術(shù)(集團(tuán))有限公司，云南昆明 650106)

[目的]研究薄片廠抄造段濃白水中蛋白質(zhì)回收工藝，減少廢水中有機(jī)物對環(huán)境造成的污染，促進(jìn)環(huán)境與經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展。[方法]分析pH對提取再造煙葉濃白水中可溶性蛋白質(zhì)的影響，確定適宜工藝參數(shù)。[結(jié)果] 從再造煙葉濃白水中提取可溶性蛋白質(zhì)的最佳工藝參數(shù)為酸溶pH 3.5，堿沉pH 8.0。[結(jié)論] 選取適宜的pH可對高效提取濃白水中蛋白質(zhì)起到?jīng)Q定性作用。

再造煙葉；抄造段；濃白水；提取；蛋白質(zhì)

造紙法再造煙葉生產(chǎn)過程中耗水量很大，據(jù)統(tǒng)計，每生產(chǎn)1 t再造煙葉產(chǎn)品產(chǎn)生廢水量在70 m3以上。因其具有色度高、成分雜、降解難的特點，會對周邊環(huán)境造成嚴(yán)重危害[1-3]。莫立煥等率先對造紙法煙草薄片產(chǎn)生的廢水進(jìn)行了深度研究，發(fā)現(xiàn)廢水中含有木質(zhì)素、纖維素、果膠、多糖、可溶性蛋白質(zhì)等有機(jī)物[4]，其中蛋白質(zhì)的含量最為豐富。研究表明，煙草中蛋白質(zhì)含有各種氨基酸，其含量極其豐富、均衡，經(jīng)精密加工可獲得生物活性肽、氨基酸等附加值高的產(chǎn)品[5-6]。如果能夠?qū)⒃僭鞜熑~廢水中高價值成分——蛋白質(zhì)進(jìn)行回收利用，不僅有助于保護(hù)自然環(huán)境，減少資源浪費，更重要的是目前動物蛋白生產(chǎn)供應(yīng)不足，無法滿足人們的需求，回收利用優(yōu)質(zhì)植物蛋白很可能是一條可行的解決途徑。

迄今為止有關(guān)造紙法再造煙葉廢水方面的研究，均圍繞廢水凈化處理開展工作[7-8]，有關(guān)煙草蛋白提取方面的研究，均是以殘次煙葉為原料進(jìn)行的，并且提取過程繁瑣，難以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)[9-10]。筆者選取再造煙葉抄造成型網(wǎng)布下的濃白水作為研究對象，提取其中煙草蛋白，以減少生產(chǎn)廢水中有機(jī)物對環(huán)境造成的污染，促進(jìn)薄片行業(yè)環(huán)境與經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1原料及主要試劑。白水，由云南某薄片廠提供；NaOH，西隴化工股份有限公司；H3PO4，分析純，西隴化工股份有限公司。

1.1.2主要儀器。SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；PHS-3C型精密pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；centrifuge 5804R型離心機(jī)，Eppendorf；LC-162型冰箱，海爾；MS 204S型電子天平，Switzerland。

1.2 方法

1.2.1煙草蛋白質(zhì)沉淀。用磷酸將白水調(diào)至pH約3.0，靜置一段時間。使用NaOH調(diào)節(jié)溶液至pH約8.0，在4 ℃環(huán)境下靜置3.0 h。若產(chǎn)生沉淀，將沉淀離心分離，對沉淀成分進(jìn)行檢測。

1.2.2煙草蛋白質(zhì)沉淀的最佳pH。將白水分成5份，用磷酸分別調(diào)pH為2.5、3.0、3.5、4.0、5.0，靜置一段時間，使用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH約8.0，在4 ℃環(huán)境下靜置3.0 h，將沉淀離心分離，分別稱量出沉淀物的重量。不同pH白水樣品各設(shè)6次重復(fù)。

將白水分成5份，用磷酸將其均調(diào)至pH約3.0，靜置一段時間，使用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，在4 ℃下靜置3.0 h，將沉淀離心分離，分別稱量出沉淀物的重量。不同pH白水樣品各設(shè)6次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草蛋白質(zhì)的沉淀將試驗得到的白色沉淀物送至云南同創(chuàng)檢測技術(shù)股份有限公司進(jìn)行成分檢測，得到沉淀主要成分為蛋白質(zhì)。由此表明，試驗從煙草漿料中成功提取到了蛋白質(zhì)(沉淀為水溶性蛋白質(zhì))。試驗提取得到的煙草蛋白質(zhì)沉淀量是否會隨pH變化而變化，需要對不同pH下的試驗結(jié)果進(jìn)行分析。

2.2 白水中蛋白質(zhì)提取的最佳pH

2.2.1酸溶最佳pH。酸溶的最佳pH測定結(jié)果如表1所示。蛋白質(zhì)沉淀質(zhì)量隨不同pH酸溶的變化趨勢如圖1所示。從表1、圖1可以看出，隨酸溶pH的變化，沉淀質(zhì)量隨之變化，這是由于不同的pH酸溶程度不同，因此蛋白質(zhì)沉淀溶解量不同(圖2)。當(dāng)pH達(dá)到3.5時，沉淀質(zhì)量為3.252 3 g，達(dá)到最大值，比沉淀最低值3.200 6 g高出1.6%；當(dāng)pH為4.0、5.0時，由于蛋白質(zhì)酸溶并不徹底，導(dǎo)致沉淀質(zhì)量隨pH的增大而減少，其變化趨勢如圖1所示。

表1 各樣品不同酸溶pH下的蛋白質(zhì)沉淀質(zhì)量

圖1 蛋白質(zhì)沉淀質(zhì)量隨不同酸溶pH的變化趨勢

圖2 不同pH酸溶的蛋白質(zhì)沉淀

根據(jù)方差分析結(jié)果得知，F(xiàn)>F-crit = 5.317 655，P<0.01，表明模型達(dá)到極顯著，酸溶的pH對蛋白質(zhì)沉淀量具有極顯著的影響，煙草蛋白的沉淀量隨pH的降低而增大，直至達(dá)到沉淀量的最大值。

利用回歸分析，對酸溶pH與煙草蛋白沉淀量的關(guān)系進(jìn)行分析，并對回歸方程進(jìn)行預(yù)估，取R2最大的方程，得到回歸方程為y=0.128 3x4-1.904 5x3+10.383x2-24.642x+24.705，R2值為1(擬合度很高)，預(yù)估擬合曲線如圖3所示?？梢钥闯觯崛躳H與煙草蛋白沉淀量呈顯著負(fù)相關(guān)。

圖3 酸性條件下煙草蛋白沉淀量的擬合曲線

2.2.2堿沉最佳pH。堿沉的最佳pH測定結(jié)果，參見表2所示。蛋白質(zhì)的沉淀隨不同pH堿沉的變化趨勢如圖4所示。由表2、圖4可以看出，不同pH堿沉后的蛋白質(zhì)沉淀量不同，這是由于pH不同，導(dǎo)致堿沉的程度不同(圖5)，如pH為7.0時，堿沉并不徹底，蛋白質(zhì)沉淀量少。當(dāng)pH達(dá)到8.0時，沉淀物達(dá)到最大值為2.326 3 g，比pH為7.0對應(yīng)的沉淀量1.564 8 g高出48.66%；而pH小于8.0時，由于堿沉不徹底，沉淀量隨pH減小而減少，其變化趨勢如圖4所示。

表2 各樣品不同pH堿沉下的蛋白質(zhì)沉淀質(zhì)量

圖4 蛋白質(zhì)沉淀質(zhì)量隨不同堿沉pH的變化趨勢

圖5 不同pH堿沉的蛋白質(zhì)沉淀

根據(jù)方差分析結(jié)果得知，F(xiàn)>F-crit = 5.317 655，P<0.01，表明模型達(dá)到極顯著，堿沉的pH對蛋白質(zhì)沉淀量具有極顯著的影響，沉淀量隨pH增大而增加，直至達(dá)到沉淀量的最大值。

利用回歸分析，對堿沉pH與煙草蛋白質(zhì)沉淀量的關(guān)系進(jìn)行分析，并對回歸方程進(jìn)行預(yù)估，取R2最大的方程，得到回歸方程為y=-0.346 2x2+5.904 9x-22.798，R2值為0.987 4(擬合度很高)，預(yù)估擬合曲線如圖6?？梢缘贸?，堿沉pH與煙草蛋白沉淀量呈顯著正相關(guān)。

圖6 堿性條件下煙草蛋白質(zhì)沉淀量的擬合曲線

3 結(jié)論與討論

早期研究表明[11-12]，煙草中的蛋白質(zhì)分為可溶性蛋白和不溶性蛋白。可溶性蛋白的1/2左右是葉綠體蛋白(Fraction Ⅰ protein，F(xiàn)Ⅰ蛋白)，另外1/2為其他可溶性蛋白質(zhì)的復(fù)合物(Fraction Ⅱ protein，F(xiàn)Ⅱ蛋白)。FⅠ蛋白(Rubisco蛋白)只溶解于底物1，5-二磷酸核酮糖(RuBP)或高濃度鹽(如NaCI)溶液中；FⅡ蛋白因其為混合物，不能結(jié)晶，但可以被丙酮萃取和水洗提純，不含色素和酚類等雜質(zhì)的性質(zhì)。依據(jù)兩者不同的理化性質(zhì)及白色沉淀物性狀，可推斷薄片生產(chǎn)過程中的程中的濃白水含有的煙草蛋白應(yīng)歸為FⅡ蛋白。該試驗表明，可通過酸堿工藝從白水中提取出可溶性蛋白質(zhì)，進(jìn)行煙草蛋白的回收利用。當(dāng)堿沉pH一定，酸溶pH > 3.5時，煙草蛋白沉淀量隨著酸溶pH的減小而增大；當(dāng)酸溶pH一定，堿沉pH < 8.0時，煙草蛋白質(zhì)沉淀量會隨堿沉pH的增大而增大；在pH 3.5時進(jìn)行酸溶，同時，pH 8.0時進(jìn)行堿沉，煙草蛋白質(zhì)沉淀量最大。中性偏堿可獲得蛋白質(zhì)量最大，這一結(jié)果同Platis等試驗結(jié)論一致。中性偏堿的環(huán)境下，蛋白質(zhì)提取率較高，這可能與煙草蛋白的等電點pI>7有關(guān)[13]。

總之，煙草蛋白是一種極具利用潛力和發(fā)展前景的植物蛋白資源，深入研究開發(fā)這種資源不僅有助于提高煙草的綜合利用價值，還可促進(jìn)煙草行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。尤其對于造紙法再造煙葉生產(chǎn)企業(yè)而言，由生產(chǎn)廢水中提取煙草蛋白既保護(hù)了自然環(huán)境，減輕了對周邊環(huán)境的污染，又可促進(jìn)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，增加企業(yè)收入，有較好的應(yīng)用前景。

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Optimization of Protein Extraction Technology of Concentrated White Water of Reconstituted Tobacco

WEI Qing, WU Ping-yan, DUAN Meng, LIU Wei-juan*et al (Yunnan Reascend Tobacco Technology (Group) Co., Ltd., Kunming, Yunnan 650106)

[Objective] To research the protein extraction technology in concentrated white water in chip factory, and to alleviate the environmental pollution caused by organic compounds, and to promote sustainable environment and economic development. [Method] Effects of pH value on soluble protein in concentrated white water were researched. [Result] The optimal technology parameter for extracted soluble protein was as follows: acid extraction pH 3.5, alkali precipitation pH 8.0. [Conclusion] A suitable pH value plays a decisive role in efficient protein extraction of concentrated white water.

Reconstituted tobacco; Papermaking; Concentrated white water; Extraction; Protein

衛(wèi)青(1979- )，男，云南石屏人，高級工程師，碩士，從事再造煙葉技術(shù)研究。*通訊作者，研究員，博士，從事再造煙葉技術(shù)研究及產(chǎn)品開發(fā)、推廣、應(yīng)用。

2016-09-09

S 572

A

0517-6611(2016)30-0067-03