陳彥彬

【摘要】 目的 分析miR-21在乳腺癌組織中的表達(dá)。方法 32例乳腺癌患者和32例乳腺良性病變患者， 均通過逆轉(zhuǎn)錄—多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）方法檢測(cè)病變組織中的miR-21的表達(dá)情況， 分析miR-21與乳腺癌的關(guān)系。并使用轉(zhuǎn)染的方法將miR-21轉(zhuǎn)入MDA-MB231乳腺癌細(xì)胞中， 了解miR-21對(duì)MDA-MB231細(xì)胞遷移的作用。結(jié)果 乳腺癌組織中miR-21的相對(duì)表達(dá)量為（1.89±0.23）高于乳腺良性病變組織的（0.42±0.04）（P<0.05）；在對(duì)MDA-MB231細(xì)胞這一乳腺癌細(xì)胞系展開RNA轉(zhuǎn)染時(shí)， 所用方法為L(zhǎng)ipofectamine2000轉(zhuǎn)染法， 確保轉(zhuǎn)染率>90%；轉(zhuǎn)染miR-21可以增加乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB231的遷移能力（P<0.05）。結(jié)論 miR-21表達(dá)異常參與乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展過程。

【關(guān)鍵詞】 miR-21；乳腺癌；表達(dá)

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.29.021

microRNA（miRNA）是一類小的、內(nèi)源性調(diào)節(jié)多種生物作用的非編碼RNA， 可以參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控， 調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和死亡， 從而影響到生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老及死亡等生命過程。近年來有研究發(fā)現(xiàn)：在多種腫瘤細(xì)胞中， miRNA均出現(xiàn)異常表達(dá)， 且在腫瘤的形成、進(jìn)展及耐藥性中發(fā)揮重要作用， 以miR-21異常表達(dá)尤為顯著[1]。目前， 關(guān)于miR-21在乳腺癌組織的表達(dá)變化， 在乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展中的關(guān)系， 極少有文獻(xiàn)報(bào)道。本次實(shí)驗(yàn)主要是研究miR-21在乳腺癌組織中的表達(dá)情況， 證實(shí)miR-21與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2015年1月～2016年1月間本院收治的32例乳腺癌患者， 年齡16～58歲， 平均年齡（36.4±6.1）歲；32例乳腺良性病變患者， 包括18例纖維瘤和14例乳腺腺病， 年齡18～59歲， 平均年齡（36.7±6.9）歲。所有患者均為接受過放射療法、化學(xué)療法或免疫療法， 進(jìn)行手術(shù)后， 將患者切除的乳腺組織標(biāo)本在10 min內(nèi)存入液氮中。所有患者的診斷均經(jīng)病理檢查結(jié)果證實(shí)， 排除既往有腫瘤病史及其他部位轉(zhuǎn)移的乳腺腫瘤。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 細(xì)胞及試劑 生物資源中心ATCC提供的MDA-MB231細(xì)胞（人乳腺癌細(xì)胞系）， 使用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基（含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基、10%胎牛血清）， 放于培養(yǎng)箱（37℃恒溫、5%CO2的飽和濕度）中培養(yǎng)， 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)90%以上后， 按照1∶3傳代。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000及TRIzol、SYBR Green PCR試劑盒、miR-21、用Boyden小室進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)。

1. 2. 2 實(shí)驗(yàn)方法 ①提取細(xì)胞的總RNA（熒光定量PCR Trizol法）， 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將逆轉(zhuǎn)錄的cDNA放置于-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。采?-△△Ct方法計(jì)數(shù)miR-21的表達(dá)量， 以內(nèi)參基因U6作為標(biāo)準(zhǔn)， 采用Pfaffl法進(jìn)行相對(duì)定量：△Ct tumor=Ct（待測(cè)基因）-Ct（內(nèi)參基因U6）， △Ct normol=Ct（待測(cè)基因）-Ct（內(nèi)參基因U6）， RQ=tumor/ normol（T/N）=2-△△Ct[2]。②細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種24 h后， 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合度時(shí)方能用于轉(zhuǎn)染。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)依據(jù)其轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行操作， 時(shí)間為36 h， 而后可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。③遷移能力運(yùn)用傷口愈合實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的遷移能力進(jìn)行分析。

1. 3 觀察指標(biāo)[3] 觀察兩組患者的miR-21的表達(dá)量、細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及miR-21對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用 χ2 檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 兩組患者的miR-21的表達(dá)量 乳腺良性病變組織中， miR-21的相對(duì)表達(dá)量為（0.42±0.04）；乳腺癌組織中， miR-21的相對(duì)表達(dá)量為（1.89±0.23）；兩組間的miR-21的相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.679， P=0.000<0.05）。

2. 2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率結(jié)果 在對(duì)MDA-MB231細(xì)胞這一乳腺癌細(xì)胞系展開RNA轉(zhuǎn)染時(shí)， 所用方法為L(zhǎng)ipofectamine2000轉(zhuǎn)染法， 確保轉(zhuǎn)染率>90%。

2. 3 miR-21對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響 在經(jīng)過24 h后， miR-21的傷口寬度為愈合前的10%， 無miR-21的傷口寬度為愈合前的50%， 傷口愈合結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-21可以增加乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB231的遷移能力（χ2=38.10， P=0.000<0.05）。

3 討論

乳腺癌是以一種常見的惡性腫瘤， 近年來， 我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。由于乳腺癌早期缺乏典型癥狀， 且缺乏乳腺保健意識(shí)， 以至于病情嚴(yán)重后才進(jìn)行就醫(yī)。乳腺癌是一種較為復(fù)雜的疾病， 其發(fā)生原因是由于多種基因異變?cè)斐傻模?主要為癌基因及抑癌基因這兩大類基因的變異。在進(jìn)行乳腺癌的診治中無法早期診斷， 且無法在治療中防止腫瘤擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移， 因此需研究乳腺癌的早期診斷標(biāo)志物。

miRNA是一類約為22nt大小的非編碼單鏈RNA分子。隨著基因技術(shù)研究的不斷深入， miRNA在腫瘤組織中表達(dá)異常已有大量的研究證實(shí)這一觀點(diǎn)， 不同的腫瘤組織， 其異常表達(dá)方式不同， 在某些腫瘤組織中， miRNA的表達(dá)是下降的， 且還參與了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程， 但也有一些腫瘤組織（腦膠質(zhì)瘤及肺癌）中， miRNA在其組織中的表達(dá)是上升的， miR-21可以調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移， 調(diào)節(jié)方式為：調(diào)節(jié)PTEN蛋白的表達(dá)；還可以調(diào)節(jié)腦膠質(zhì)瘤的增殖能力， 調(diào)節(jié)方式為：STAT3信號(hào)通路[4]。近年來， 由于miRNA已形成廣泛關(guān)注， 其參與腫瘤的轉(zhuǎn)移的這一過程已經(jīng)過很多學(xué)者的證實(shí)。

本次實(shí)驗(yàn)中， miR-21在乳腺癌組織中的表達(dá)要高于miR-21在乳腺良性病變組織的表達(dá)， 表明miR-21可能參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程；在對(duì)MDA-MB231細(xì)胞這一乳腺癌細(xì)胞系展開RNA轉(zhuǎn)染時(shí)， 所用方法為L(zhǎng)ipofectamine2000轉(zhuǎn)染法， 確保轉(zhuǎn)染率>90%；通過研究miR-21對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響， 表明轉(zhuǎn)染miR-21可以增加乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB231的遷移能力。miR-21在乳腺癌中的表達(dá)可以作為一種新型的疾病診斷、分類及預(yù)后的檢查工具， 可以用于惡性腫瘤的診斷、治療及判斷預(yù)后。

綜上所述， miR-21在乳腺癌中的表達(dá)是顯著上升的， 且可以增加乳腺癌細(xì)胞的遷移能力， 初步表明， miR-21表達(dá)異常與乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展過程具有密切的關(guān)系。

參考文獻(xiàn)

[1] 卞國(guó)奉， 陳愛軍. miR-21、miR-155在乳腺癌患者血液與腫瘤組織中表達(dá)水平的相關(guān)性研究. 海南醫(yī)學(xué)， 2012， 23（18）：1-3.

[2] 劉奎. let-7a和miR-21在乳腺癌組織中的表達(dá)及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞作用的研究. 江蘇大學(xué)， 2015.

[3] 白建平， 盧建躍， 孫新增， 等. miR-21和miR-106a在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義. 寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2015， 37（5）：553-556.

[4] 劉文新， 李月峰， 朱小蘭， 等. miR-21對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的影響. 江蘇醫(yī)藥， 2014， 40（17）：1998-2001.

[收稿日期：2016-8-16]