陶德友 吳麗平 胡金喜

●論 著

Foxp3、NRP1和NRP2在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)及意義

陶德友 吳麗平 胡金喜

目的 研究叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（Foxp3）、神經(jīng)纖毛蛋白（NRP）在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌（IDC）中的表達(dá)及其臨床意義，并探討Foxp3、NRP1和NRP2表達(dá)的相關(guān)性。方法 采用免疫組化En Vision法檢測108例乳腺IDC、45例纖維腺瘤和66例正常乳腺組織中Foxp3、NRP1和NRP2的表達(dá)，分析3者的表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素及基因分型的關(guān)系。結(jié)果 在正常乳腺組織、纖維腺瘤和乳腺IDC中Foxp3、NRP1和NRP2陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。乳腺IDC中Foxp3表達(dá)與組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)（均P＜0.05）；NRP1和NRP2表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)（均P＜0.05）。Foxp3、NRP1和NRP2表達(dá)兩兩均呈正相關(guān)（均P＜0.05）。結(jié)論 乳腺IDC中Foxp3、NRP1和NRP2呈現(xiàn)高表達(dá)，聯(lián)合檢測Foxp3、NRP1和NRP2對于評估乳腺癌的生物學(xué)特性、預(yù)后和指導(dǎo)治療具有重要的臨床價值。

叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子 神經(jīng)纖毛蛋白1 神經(jīng)纖毛蛋白2 乳腺癌 基因分型

叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（forkhead/winged-helix，F(xiàn)oxp3）是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在調(diào)節(jié)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell,Treg）發(fā)育過程中起重要作用。體外實驗證實，F(xiàn)oxp3在肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、急性T細(xì)胞白血病等不同組織起源的多種腫瘤細(xì)胞系存在不同水平的表達(dá)[1]。神經(jīng)纖毛蛋白（neuropilin,NRP）最初被鑒定為神經(jīng)元受體，作為腫瘤相關(guān)生長因子的共受體。NRP家族由NRP1和NRP2兩種基因構(gòu)成。近來研究顯示，NRP參與多種信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞骨架組織、血管生成和腫瘤演進(jìn)[2]。本研究采用免疫組化En Vision法檢測Foxp3、NRP1和NRP2在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌（infiltrating ductal carcinoma,IDC）組織中的表達(dá)，分析3者在IDC中的表達(dá)及其臨床意義，并探討Foxp3、NRP1和NRP2表達(dá)的相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1 對象 收集本院2010年1月至2012年9月手術(shù)切除乳腺IDC石蠟標(biāo)本108例?；颊吣挲g22～82歲，中位年齡53.6歲；均為女性。均經(jīng)手術(shù)和病理證實且術(shù)前均未接受放、化療及內(nèi)分泌治療；依據(jù)WHO（2003）乳腺腫瘤組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)分級：Ⅰ級21例，Ⅱ級58例，Ⅲ級29例；參照2002年美國癌癥聯(lián)合委員會第6版乳腺癌

TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期16例，Ⅱ期56例，Ⅲ期28例，Ⅳ期8例；腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性52例，陰性56例；采用2009年美國臨床腫瘤協(xié)會和美國病理家協(xié)會指定的《乳腺癌HER-2基因臨床檢測指南》評分標(biāo)準(zhǔn)判定人類表皮生長因子受體2（HER-2）表達(dá)：陽性27例，陰性81例。另選取45例纖維腺瘤和66例正常乳腺組織（距離乳腺癌組織邊緣＞5cm，并經(jīng)病理檢查證實）石蠟標(biāo)本作為對照組。本文所使用的組織材料均經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法 采用En Vision二步法進(jìn)行免疫組化染色，抗原修復(fù)方法采用高壓鍋檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）煮沸法，一抗反應(yīng)條件為4℃過夜，二抗條件為37℃，0.5h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明并封固。用已知陽性切片作為陽性對照，以PBS液代替一抗作為陰性對照。鼠抗人Foxp3單克隆抗體（1∶50）購自英國Abcam公司，鼠抗人NRP1單克隆抗體（1∶200）和兔抗人NRP2單克隆抗體（1∶100）購自美國Santa Cruz公司，即用型兔抗羊和兔抗鼠免疫組化En VisionTM檢測試劑盒和DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 結(jié)果判定 Foxp3、NRP1、NRP2、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）陽性信號表現(xiàn)為棕黃色或棕黃色顆粒。Foxp3、ER和PR主要定位于細(xì)胞核，NRP1和NRP2主要定位于細(xì)胞質(zhì)。結(jié)果用雙盲法進(jìn)行評估。每張切片隨機(jī)觀察5個以上高倍視野（×400），總計數(shù)不少于1 000個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，染色細(xì)胞數(shù)≥10%為陽性，＜10%為陰性。Her-2免疫組化判斷：Her-2細(xì)胞膜棕黃色為陽性，任何比例的腫瘤細(xì)胞有微弱、不完整的細(xì)胞膜著色或不著色為+或-；＞10%的腫瘤細(xì)胞細(xì)

胞膜棕黃色著色為++；＞10%的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜棕褐色著色為+++。其中-、+、++視為陰性，+++視為陽性。

1.4 基因分型標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)免疫組化結(jié)果，根據(jù)2011年St.Gallen國際乳腺癌會議專家共識[3]，采用Cheang等[4]根據(jù)ER、PR、HER-2、Ki-67四種免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行乳腺癌分子分型。Luminal A型：ER+，和（或）PR+，Her-2-，Ki-67低表達(dá)。Luminal B型：其一為ER+，和（或）PR+，Her-2-，Ki-67高表達(dá)；其二為ER+，和（或）PR+，Her-2+，Ki-67任意表達(dá)?；准?xì)胞樣型：ER-，PR-，Her-2-，Ki-67任意表達(dá)。Her-2過表達(dá)型：ER-，PR-，Her-2+，Ki-67任意表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件；不同組織間Foxp3、NRP1和NRP2表達(dá)差異比較采用χ2檢驗，F(xiàn)oxp3、NRP1和NRP2兩兩表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 Foxp3、NRP1和NRP2在乳腺IDC、纖維腺瘤和正常乳腺組織中的表達(dá) Foxp3陽性信號主要定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒，在乳腺IDC組織中呈彌漫表達(dá)，見圖1a；在對照組織陽性表達(dá)率極低，僅表達(dá)于導(dǎo)管上皮細(xì)胞，見圖1b。NRP1陽性信號主要定位于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒，在乳腺癌組織陽性率較高，見圖1c；在對照組織陽性表達(dá)強度較弱，見圖1d。NRP2陽性信號主要定位于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒，在乳腺癌組織陽性率較高，見圖1e；對照組織陽性表達(dá)率較低，見圖1f。Foxp3、NRP1和NRP2在正常乳腺組織、纖維腺瘤和乳腺IDC中陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

圖1 Foxp3、NRP1和NRP2在乳腺IDC、纖維腺瘤和正常乳腺組織中的表達(dá)（a：Foxp3在乳腺IDC組織中的表達(dá)；b.Foxp3在正常乳腺組織中不表達(dá)；c.NRP1在乳腺IDC組織中的表達(dá)；d.NRP1在正常乳腺組織中的表達(dá)；e.NRP2在乳腺IDC組織中的表達(dá)；f.NRP2在乳腺纖維腺瘤組織中不表達(dá)；En Vision二步法×100）

表1 Foxp3、NRP1和NRP2在乳腺IDC、纖維腺瘤和正常乳腺組織中的陽性表達(dá)情況[例（%）]

2.2 Foxp3、NRP1和NRP2在乳腺IDC中陽性表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 Foxp3表達(dá)在乳腺IDC中隨著組織學(xué)分級升高、TNM分期進(jìn)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移其陽性率分別遞增，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），而與患者年齡、腫瘤大小均無關(guān)（均P＞0.05）。NRP1和NRP2陽性表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小及組織學(xué)分級均無關(guān)（均P＞0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)（均P＜0.05），見表2。

表2 Foxp3、NRP1和NRP2在乳腺IDC中陽性表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系[例（%）]

2.3 Foxp3、NRP1和NRP2陽性表達(dá)與乳腺IDC基因分型的關(guān)系 各亞型間Foxp3陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但各亞型間NRP1和NRP2陽性表達(dá)率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。乳腺癌基底細(xì)胞樣型及Luminal A型組中NRP1和NRP2陽性表達(dá)率均明顯低于Luminal B型和Her-2過表達(dá)組（均P＜0.05）。乳腺癌Her-2過表達(dá)組NRP1和NRP2陽性率均高于Luminal B型組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 Foxp3、NRP1和NRP2表達(dá)與乳腺IDC基因分型的關(guān)系[例（%）]

2.4 Foxp3、NRP1和NRP2表達(dá)在乳腺IDC中的相關(guān)性 NRP1和NRP2在乳腺IDC中表達(dá)均與Foxp3表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.42、0.41，均P＜0.05），NRP1表達(dá)與NRP2表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.50，P＜0.05）。

3 討論

Foxp3屬于具有叉頭螺旋結(jié)構(gòu)為特征、多種功能的蛋白分子大家族成員，主要表達(dá)于CD4+CD25+Treg，在一定程度上可反映Treg的水平和功能活性。Treg以細(xì)胞膜特異性表達(dá)CD4和CD25為特征，是形成腫瘤免疫耐受的重要部分。Foxp3+CD4+CD25+Treg在腫瘤免疫逃逸過程中起關(guān)鍵性作用[5]，因此對Foxp3的研究主要集中于Treg。近年來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3不僅僅表達(dá)于Treg，而在某些實體腫瘤組織和細(xì)胞中也存在不同程度的表達(dá)。免疫組化染色結(jié)果顯示，腫瘤組織內(nèi)Treg和腫瘤細(xì)胞均表達(dá)Foxp3。79.3%的印戒細(xì)胞癌患者存在Foxp3表達(dá)，且Foxp3表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。腫瘤細(xì)胞中Foxp3表達(dá)可能在胃癌免疫逃逸過程中扮演重要作用，并與胃硬癌的惡性潛能相關(guān)[6]。Wang等[7]研究證實，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Foxp3表達(dá)在高級別膠質(zhì)瘤發(fā)展中起關(guān)鍵性作用，并與高級別膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為有關(guān)，F(xiàn)oxp3高表達(dá)者較低表達(dá)者預(yù)示預(yù)后不良。本研究顯示，F(xiàn)oxp3在乳腺IDC中陽性表達(dá)率明顯高于纖維腺瘤和正常乳腺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示Foxp3過表達(dá)可能與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)。Foxp3表達(dá)在乳腺IDC中隨著組織學(xué)分級升高、TNM分期進(jìn)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移其陽性率分別遞增，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而與患者年齡、腫瘤大小無相關(guān)性，表明Foxp3表達(dá)程度與乳腺癌的轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，與Yoshii等[6]在胃癌中研究結(jié)果一致。本研究顯示Foxp3表達(dá)與乳腺IDC基因分型無關(guān)，表明Foxp3表達(dá)對于預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后意義及指導(dǎo)內(nèi)分泌治療意義小。

NRP家族屬于細(xì)胞膜表面跨膜糖蛋白，包括NRP1和NRP2兩個成員，調(diào)節(jié)血管和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的許多不同方面。NRP1在血管內(nèi)皮作為血管內(nèi)皮生長因子A亞型受體，在淋巴管瓣膜內(nèi)皮作為軸突導(dǎo)向因子（semaphorin）受體；NRP2通過血管內(nèi)皮生長因子C誘導(dǎo)淋巴管生長；通過與血管內(nèi)皮生長因子作用來阻止腫瘤細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)血管生成[8-9]。NRP是多功能共受體，參與腫瘤的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移和免疫，可作為抗癌藥物發(fā)展很好的靶向[10]。采用短發(fā)夾RNA技術(shù)敲出NRP1可抑制舌鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，考慮到NRP1在舌鱗癌中存在高表達(dá)，其可以作為舌癌分化的一個有用標(biāo)志物和舌癌治療的一個靶向[11]。有研究報道，NRP2基因和蛋白均與大腸癌的分化程度、浸潤深度、淋巴管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Duke分期和淋巴管密度相關(guān)，NRP2表達(dá)可能調(diào)節(jié)淋巴管生成，并且在大腸癌發(fā)生和發(fā)展中扮演重要作用[12]。

本研究證實，乳腺IDC組織中NRP1和NRP2陽性表達(dá)率遠(yuǎn)高于纖維腺瘤和正常乳腺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明NRP1和NRP2可能是兩種癌基因。NRP1和NRP2高表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與患者年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級無關(guān)；提示NRP1和NRP2異常表達(dá)均參與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程，并與乳腺癌預(yù)后密切相關(guān)。推測NRP1和NRP2可能通過與血管內(nèi)皮生長因子受體結(jié)合，刺激血管或者淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)新生毛細(xì)血管網(wǎng)的建立，提高血管通透性，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。NRP1和NRP2陽性表達(dá)率均與乳腺癌基因分型亞型明顯相關(guān)。Luminal B型和Her-2過表達(dá)組中存在Her-2及NRP1和NRP2過表達(dá)，提示預(yù)后差。NRP1和NRP2聯(lián)合檢測可能對于評估乳腺癌患者預(yù)后和指導(dǎo)內(nèi)分泌治療具有重要臨床意義。

Foxp3、NRP1和NRP2在乳腺IDC中表達(dá)經(jīng)等級相關(guān)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)oxp3、NRP1和NRP2在乳腺癌中的表達(dá)兩兩呈正相關(guān)。提示3者在乳腺IDC的發(fā)生和發(fā)展過程中起協(xié)同作用。聯(lián)合檢測Foxp3、NRP1和NRP2對于評估乳腺癌的生物學(xué)特性、預(yù)后和指導(dǎo)治療具有重要的臨床價值。

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Expressions of Foxp3,Neuropilin-1 and Neuropilin-2 in infiltrating ductal breast carcinoma and their significance

TAO Deyou，WU Liping，HU Jinxi.Department of Surgery,Luqiao Hospital of Enze Medical Group,Taizhou 318050,China

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of Foxp3,Neuropilin-1(NRP1)and Neuropilin-2(NRP2)in infiltrating ductalcarcinoma (IDC)ofthe breast and their significance.Methods The expressions ofFoxp3,NRP1 and NRP2 were detected by immunohistochemicalEn Vision method in 108 cases ofIDC ofthe breast,45 cases offibroadenoma,66 cases ofnormal breast tissue.The relationship of foxp3,NRP1 and NRP2 expression with clinical pathological features and genotyping of breast carcinoma was analyzed. Results The expressions of Foxp3,NRP1 and NRP2 in breast IDC were significantly higher than those in fibroadenoma and normal breast tissue (all P＜0.05).The expression of Foxp3 in IDC of the breast was correlated with histological grade,lymph node metastasis and TNM stage (all P＜0.05);the expression of NRP1 and NRP2 was correlated with lymph node metastasis and TNMstage(all P＜0.05).There was a positive correlation among Foxp3,NRP1 and NRP2(all P＜0.05). Conclusion The expressions of Foxp3,NRP1 and NRP2 are up-regulated in IDC of the beast,indicating that the combined detection of Foxp3,NRP1 and NRP2 may be used for evaluation ofbiologicalbehavior and prognosis ofbreast carcinoma.

Foxp3 Neuropilin-1 Neuropilin-2 Breast carcinoma Gene type

2016-01-06）

（本文編輯：陳麗）

臺州市科技計劃項目（102KY13）；臺州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）科研基金（15EZA3）

318050 臺州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）路橋醫(yī)院外科（陶德友、吳麗平）；浙江省臺州醫(yī)院腫瘤外科（胡金喜）

陶德友，E-mail：9890830@qq.com