秦 霞，劉 紅，任曉燕，柴翠元

(淮南聯(lián)合大學(xué) 化工系，安徽 淮南 232038)

應(yīng)用亞臨界水技術(shù)對枇杷葉中熊果酸的提取工藝優(yōu)化研究

秦 霞，劉 紅，任曉燕，柴翠元

(淮南聯(lián)合大學(xué) 化工系，安徽 淮南 232038)

因?qū)嵱玫乃幱脙r值，熊果酸的亞臨界水萃取技術(shù)受到相關(guān)研究者的關(guān)注。為有效提高熊果酸的提取率，以亞臨界水萃取過程中的萃取時間、萃取溫度、溶劑流速和系統(tǒng)壓力為可變因素，通過設(shè)計正交試驗及應(yīng)用高效液相色譜對熊果酸進行定量測定，最終確定最佳的提取工藝：原料的粒徑60目、提取溫度 200 ℃、 提取時間75 min、 系統(tǒng)壓力 15 MPa，提取率達到 70.09%。亞臨界水萃取方法不僅提高熊果酸的提取率，還是一種新型的綠色萃取技術(shù)，具有良好的發(fā)展前景。

亞臨界水提?。昏凌巳~；熊果酸；高效液相色譜

有關(guān)研究表明，熊果酸具有消炎抗菌、降血脂及血糖、抗氧化、抗腫瘤等醫(yī)藥作用，熊果酸作為枇杷葉中存在的天然成分之一，因其多種藥理作用及較低的含量，各研究者對其提取工藝的研究越來越深刻[1]。由于傳統(tǒng)常用的溶劑提取法存在提取耗費時間過長、目標物產(chǎn)品質(zhì)量較差、溶劑殘留嚴重，且會對環(huán)境產(chǎn)生一定的危害與污染等一些問題，使亞臨界水提取技術(shù)受到了廣泛的關(guān)注。亞臨界水又稱為高溫水，是在一定的壓力下，通過加熱將水溫升高至100～374℃，但水仍保持液體狀態(tài)[2]。高溫高壓條件下，液體水的微觀結(jié)構(gòu)、物理特性、化學(xué)特性均發(fā)生了很大的變化，水的極性增強，進而對有機物的溶解性提高。亞臨界水的這些特性使其成為一種綠色環(huán)保的提取技術(shù)，在國際上有著良好的發(fā)展前景[3]。高溫高壓下亞臨界水提取技術(shù)工藝過程會因提取原料與目標物的不同而產(chǎn)生較大差異[4]。由于熊果酸巨大的醫(yī)藥實用價值，本文以枇杷葉為天然的原料，以枇杷葉的粉碎程度粒徑、提取溫度、提取時間、提取壓力為可變因素，設(shè)計正交試驗，最后通過高效液相色譜技術(shù)對熊果酸進行定量研究，確定亞臨界水技術(shù)對熊果酸提取的最佳工藝。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料與設(shè)備

枇杷葉(深圳市現(xiàn)代中藥科技公司)；超純水(實驗室自制)；熊果酸標液(純度≥98%)；乙醇(上海方野化工有限公司，優(yōu)級純)；亞臨界水提取裝置(實驗室自制)；高速萬能粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)；AL2002電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州巴立科技有限公司)；Prominence LC-20A HPLC高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 采用亞臨界水提取技術(shù)提取枇杷葉中的熊果酸

以質(zhì)量較好的枇杷葉為原料，枇杷葉的粒徑、提取溫度、提取時間、提取壓力為可變因素，設(shè)計正交試驗(L9(34))，根據(jù)正交設(shè)計方法按表安排試驗。選取質(zhì)量、外觀大致相同的枇杷葉，分別將其粉碎為粒徑20目、40目、60目、80目的粉末，放入提取柱中，通過壓力泵將去離子水放入預(yù)熱器中進行加熱， 在分別達到預(yù)定的提取溫度100 ℃、150 ℃、200 ℃、250 ℃時，去離子水進入提取柱中，待系統(tǒng)壓力分別達到設(shè)定值(5 MPa、10 MPa、15 MPa、20 MPa)時，開始對提取時間進行計時，萃取至設(shè)定的時間(45 min、60 min、75 min、90 min)時，將熊果酸提取液進行冷卻收集[5]。

1.2.2 高效液相色譜條件和提取液中熊果酸含量的測定

1)色譜條件：SHISEIDO C-18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；體積比為85∶15∶0.05的乙腈-水磷酸流動相；1.0 mL/min的流速；210 nm的檢測波長；30 ℃柱溫。

2)原料溶液的制備：準確稱量枇杷葉10 g，用乙醇作為溶劑對熊果酸進行萃取，料液比1∶12，經(jīng)回流萃取2 h，過濾，重復(fù)操作，濾渣用乙醇超聲輔助提取30 min，將兩種提取液合并,并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干，用乙醇定容至250 mL，搖勻并用0.45 μm的微孔濾膜過濾，設(shè)置樣品的進樣量為10 μL，通過高效液相色譜測定得到熊果酸含量為1.038%。

3)應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)對各個實驗所得到的提取液中的含量進行測定，并計算熊果酸的提取率S。提取率S(%) =提取液中熊果酸的量/(原料質(zhì)量×原料中熊果酸含量)×100[6-9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料粉碎度(粒徑)對提取率的影響

用粉碎機將枇杷葉粉碎后分別過20目、40目、60目、80目篩，每份為10 g，將其放入提取柱中，分別采用10 MPa的提取壓力、90 min的提取時間、200 ℃的提取溫度，應(yīng)用實驗室自制的亞臨界水提取設(shè)備，對枇杷葉中的熊果酸進行提取，應(yīng)用高效液相色譜分析法，對提取液中的熊果酸含量進行測定，并計算熊果酸的提取率，進行繪圖。

由圖1所示，在枇杷葉粒徑分別為20目、40目、60目、80目的條件下,采用亞臨界水提取技術(shù)提取所得的熊果酸含量隨著粒徑的減小而逐漸升高，當枇杷葉粒徑超過60目以后，熊果酸的提取率又呈現(xiàn)降低的趨勢，在粒徑為60目時，熊果酸的提取率達到最高。在一定的范圍內(nèi)，枇杷葉中熊果酸的提取率隨著枇杷葉破碎度的增大而提高，但是當破碎度大于60目時，熊果酸提取率又出現(xiàn)下降的趨勢，熊果酸存在于植物組織細胞中，植物組織的粉碎度對植物細胞的破壁有較大程度的影響，當細胞的破壁率處于較高的水平時，細胞中存在的熊果酸才易被提取出來。另外，枇杷葉的破碎度越高，其組織總面積就越大，熊果酸則越容易從枇杷葉內(nèi)部擴散出來。但是，當枇杷葉的破碎度達到一定程度時，熊果酸的提取率反而會有所下降。這主要是因為，枇杷葉粒徑過小時會比較容易形成“沖團”現(xiàn)象，進而降低了熊果酸的提取率。

圖1 不同枇杷葉粒徑對熊果酸提取率影響

2.2 提取溫度對提取率的影響

使用亞臨界水萃取裝置對枇杷葉中熊果酸進行萃取，將系統(tǒng)壓力設(shè)為10 MPa；萃取時間為90 min；原料粒徑60目，設(shè)定萃取溫度分別為100 ℃、150 ℃、200 ℃、250 ℃，對目標物進行萃取，并通過高效液相色譜測定熊果酸的含量，計算提取率，進而繪圖分析。

圖2表明，當提取溫度在200 ℃之前， 熊果酸的提取率會隨著提取溫度的升高明顯提高，當提取溫度100 ℃時，僅僅有少量的熊果酸被提取出來，提取率達到28%，當溫度到達200 ℃后，熊果酸的提取率高達57.20%。但是隨著溫度的進一步升高，可以聞到明顯的枇杷葉子的焦糊味，而熊果酸的提取率也隨之明顯下降。提取溫度作為影響枇杷葉中熊果酸提取率的關(guān)鍵性因素，對于提取效果、提取速度等均有較大的影響。水的極性隨水溫升高而下降，溶解性增強，因此，通過提取溫度控制可以控制提取溶劑的極性，影響熊果酸的提取率。但是，當溫度過高時會對枇杷葉原料產(chǎn)生一定的破壞作用，葉子出現(xiàn)明顯的焦糊味道，進而使枇杷葉中的熊果酸遭到破壞，嚴重影響到熊果酸的提取率，因此，應(yīng)當將200 ℃作為枇杷葉熊果酸的萃取最佳溫度。

圖2 提取溫度對熊果酸提取率的影響分布

2.3 系統(tǒng)壓力對枇杷葉中熊果酸提取率的影響

應(yīng)用實驗室自制的亞臨界水提取裝置，設(shè)定熊果酸提取的溫度為200 ℃；粉碎的枇杷葉粒徑為60目；提取時間為90 min；分別設(shè)置系統(tǒng)的壓力為5 MPa、10 MPa、15 MPa、20 MPa，對枇杷葉中的熊果酸進行提取，并根據(jù)提取率的變化進行繪圖，分析系統(tǒng)壓力對枇杷葉中熊果酸提取率的影響。

由圖3可見，系統(tǒng)壓力的變化對熊果酸提取率的影響相對較小，隨著系統(tǒng)壓力的提高，熊果酸的提取率雖然有較小程度的提高，但是在系統(tǒng)壓力到達15 MPa以后，熊果酸的提取率又略有降低。在亞臨界水萃取過程中，系統(tǒng)壓力的主要作用是保證去離子水在高溫狀態(tài)下仍舊可以保持液體狀態(tài)，隨著系統(tǒng)壓力的增大，枇杷葉中的熊果酸更好地析出，水的密度亦會增大，溶解能力增強，有效成分傳質(zhì)速率會相應(yīng)加快。但在系統(tǒng)壓力升高到一定值之后，也會在一定程度上使原料中溶出更多的其他雜質(zhì)，進而影響熊果酸的溶出，另外，從本實驗室的條件考慮，壓力的進一步增大也會對實驗室設(shè)備提出更高的要求，因此，應(yīng)選擇15 MPa作為最佳的枇杷葉熊果酸提取壓力。

圖3 系統(tǒng)壓力對熊果酸提取率的影響

2.4 提取時間對枇杷葉中熊果酸提取率的影響

應(yīng)用亞臨界水提取裝置，設(shè)定熊果酸提取的溫度為200 ℃；粉碎的枇杷葉粒徑為60目；系統(tǒng)壓力為10 MPa；分別設(shè)置提取時間為45 min、60 min、75 min、90 min，對枇杷葉中的熊果酸進行提取，并根據(jù)提取率的變化進行繪圖。

由圖4可見，在提取時間未超過75 min之前，枇杷葉中熊果酸的提取率會隨著提取時間的延長有所提高，對枇杷葉中熊果酸的提取更加充分。但是，在提取時間超過75 min之后，枇杷葉中熊果酸的提取率卻隨著萃取時間的延長而略有降低。應(yīng)用亞臨界水對枇杷葉中熊果酸的提取過程是一個目標物擴散至提取溶劑中至二者平衡的動態(tài)過程，如果在平衡前適當延長熊果酸的提取時間，則會利于熊果酸的進一步析出，但是在平衡之后，整個提取溶液達到了飽和狀態(tài)之后，熊果酸卻不會再有效析出，反而會在高溫高壓的條件下，使熊果酸得到降解，降低其提取率。所以適當?shù)奶崛r間才能獲得較高的提取率。圖4顯示，當提取時間為75 min時，枇杷葉中熊果酸的提取率達到最高。

圖4 提取時間對熊果酸提取率的影響

2.5 枇杷葉中熊果酸的最佳提取工藝

在以上枇杷葉粒徑大小、萃取溫度、系統(tǒng)壓力與萃取提取時間各單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取粉碎度、提取溫度、系統(tǒng)壓力、提取時間這4個因素進行正交試驗，以熊果酸總得率為評價指標。因素水平安排見表1，采用四因素三水平即正交試驗方法找出枇杷葉熊果酸亞臨界水提取的最佳工藝參數(shù)。

表1 枇杷葉中熊果酸提取的正交試驗設(shè)計

按照正交試驗設(shè)計方案的工藝條件進行枇杷葉熊果酸的亞臨界提取試驗，并分別利用高效液相色譜分析法測定枇杷葉熊果酸的提取率，結(jié)果見表2。

表2 亞臨界水提取枇杷葉熊果酸正交試驗結(jié)果

由表2的極差可知：4個因素對枇杷葉熊果酸提取率的影響順序依次為提取溫度>提取時間>系統(tǒng)壓力>枇杷葉粉碎度。表2中1～9項所有試驗中，3號實驗A1B3C3D3萃取工藝熊果酸的提取率最佳，而研究分析所得的最佳提取實驗條件為A3B3C3D3，因為其并不在該正交試驗中，因此,做一次驗證實驗，得出該條件下枇杷葉中熊果酸的提取率為72.09%，進而驗證了上述結(jié)論的正確性。最終確定枇杷葉熊果酸的亞臨界水萃取最佳工藝因素組合為：粒徑60目、提取溫度200 ℃、系統(tǒng)壓力15 MPa、提取時間75 min時，枇杷葉的熊果酸提取率最高。

3 結(jié)束語

應(yīng)用亞臨界水提取枇杷葉中的熊果酸作為一個連續(xù)的動態(tài)過程，原料的粉碎度、萃取溫度、系統(tǒng)壓力和萃取時間都會對熊果酸提取效果產(chǎn)生不同程度的影響，通過本實驗，應(yīng)用亞臨界水萃取技術(shù)提取枇杷葉中熊果酸的最優(yōu)工藝條件為：枇杷葉粒徑60目、提取溫度200 ℃、系統(tǒng)壓力15 MPa、提取時間75 min，該條件下枇杷葉中熊果酸的提取率為72.09%。目前，我國通常采用溶劑提取法對熊果酸進行提取，但是該提取方法存在的問題較多，比如提取液的產(chǎn)品質(zhì)量較差、溶劑殘留嚴重、提取所用的溶劑較多、容易產(chǎn)生環(huán)境污染等問題，盡管近些年出現(xiàn)了一些諸如微波、超聲等輔助的辦法，使枇杷葉中熊果酸的提取率得到了一些提高，縮短了提取的時間，但是卻沒有能從根源上解決問題，亞臨界水技術(shù)作為一種綠色環(huán)保的新型萃取技術(shù)，具有較好的發(fā)展前景。

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[責任編輯：郝麗英]

Optimization research of extraction process of ursolic acid from loquat leaf with subcritical water technology

QIN Xia1,LIU Hong2,REN Xiaoyan3,CHAI Cuiyuan4

(Department of Chemistry, Huainan United University,Huainan 232038,China)

The subcritical water extraction technology of bear acid is concerned by the researchers because of its practical medicinal value. In order to improve the extraction rate of the ursolic acid, this paper takes extraction time, extraction temperature, solvent flow rate and system pressure in the process of subcritical water extraction as variable factors, by designing orthogonal test and using high performance liquid chromatography to quantitative analysis ursolic acid, and finally determines the best extraction process: particle size 60 mesh of raw material, extraction temperature of 200 ℃, extraction time of 75 min, system pressure of 15 MPa, and extraction rate reached 70.09%. The subcritical water extraction method not only improves the extraction rate of the ursolic acid, but also serves as a new green extraction technology with development prospects.

subcritical water extraction; loquat leaf; ursolic acid; high performance liquid chromatography

10.19352/j.cnki.issn1671-4679.2016.06.010

2016-07-22

安徽高校省級自然科學(xué)研究項目(KJ2014A235);2014安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃，安徽省高校青年人才基金重點項目(2013SQRL139ZD);高校省級自然科學(xué)研究重點項目(KJ2015A430，KJ2016A655)

秦 霞(1976-)，女，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué).

O636

A

1671-4679(2016)06-0041-04