李斌　楊筱君

[摘要] 目的 探討microRNA-451（miR-451）在肝癌患者血漿中的表達水平及其臨床意義。 方法 選擇2015年3～10月在棗莊礦業(yè)集團中心醫(yī)院住院治療的42例肝癌患者和42例健康體檢者作為研究對象，利用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測血漿中miR-451的表達水平，分析肝癌患者血漿中miR-451表達水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。 結(jié)果 miR-451在肝癌患者血漿中表達水平（0.43±0.16）明顯低于對照組（0.59±0.21），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；肝癌患者血漿中miR-451水平在不同性別、年齡、分化程度及甲胎蛋白水平間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），而與腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、靜脈侵犯、腫瘤數(shù)量及TNM分期明顯相關(guān)（P < 0.05）。 結(jié)論 肝癌患者血漿中miR-451表達水平降低，可能參與了肝癌的發(fā)病過程。

[關(guān)鍵詞] 肝癌；microRNA-451；臨床意義；血漿

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）10（b）-0087-04

[Abstract] Objective To explore the plasma levels of microRNA-451 （miR-451） and their clinical significances in patients with hepatocellular carcinoma. Methods 42 patients with hepatocellular carcinoma and 42 healthy controls in Central Hospital of Zaozhuang Coal Mining Group from March to October 2015 were enrolled in the study. The plasma levels of miR-451 were detected by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）. The relationships between clinical pathological characteristics and the plasma levels of miR-451 of hepatocellular carcinoma were analyzed. Results The plasma level of miR-451 in the patients with hepatocellular carcinoma （0.43±0.16） was lower than that in healthy controls （0.59±0.21）， with statistically significant difference （P < 0.01）. There were no statistically significant differences in plasma levels of miR-451 among patients with different gender， ages， tumor differentiations， AFP levels （P > 0.05）， but which had statistically significant differences among patients with different tumor sizes， lymph node metastasis， venous invasion， tumor numbers and TNM stages （P < 0.05）. Conclusion The plasma levels of miR-451 decrease in the patients with hepatocellular carcinoma， which may participate in the pathology of hepatocellular carcinoma.

[Key words] Hepatocellular carcinoma； microRNA-451； Clinical significance； Plasma

原發(fā)性肝癌簡稱肝癌，是指起源于肝細胞或肝內(nèi)膽管上皮細胞的惡性腫瘤，是我國常見的惡性腫瘤之一，死亡率在惡性腫瘤中居第2位。肝癌的病因和發(fā)病機制尚未完全清楚，可能與病毒性肝炎、食物與飲水、毒物與飲水及遺傳因素等有關(guān)[1]。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類長度為18～25個核苷酸的單鏈非編碼RNA，不編碼蛋白，主要通在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮基因調(diào)節(jié)作用。研究證實，miRNAs與實體腫瘤及血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。國內(nèi)外研究證實多種miRNAs在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮了一定作用，與肝癌的早期診斷、治療及預(yù)后密切相關(guān)[4-5]。miR-451是2005年發(fā)現(xiàn)的一種miRNA。多項研究發(fā)現(xiàn)，miR-451在多種實體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤中表達異常[6-13]。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，miR-451在肝癌細胞系、肝癌組織中表達水平下調(diào)[14-16]。本研究采用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測miR-451在肝癌患者血漿中的表達水平，并分析其與肝癌臨床病理參數(shù)及甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）之間的關(guān)系，初步探討miR-451在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3～10月在棗莊礦業(yè)集團中心醫(yī)院腫瘤外科及肝膽外科住院治療的肝癌患者42例，其中，男34例，女8例；年齡40～73歲，平均（52.46±10.37）歲。所有患者均經(jīng)過術(shù)后病理證實為肝細胞肝癌，排除合并自身免疫性疾病、轉(zhuǎn)移性肝癌、炎癥性疾病及嚴重的心腎疾病者。選擇42名正常的健康體檢者為對照組，其中，男31名，女11名；年齡39～70歲，平均年齡（50.73±9.81）歲。本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器

miRNA-提取分離試劑盒、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品，實時定量PCR試劑盒為德國Qiagen公司產(chǎn)品，高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司，紫外分光光度計購自美國基因有限公司，實時定量PCR擴增儀購自美國Bio-Rad公司，Cobas E601全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購自瑞士Roche診斷公司。

1.3 方法

1.3.1 定量RT-PCR檢測血漿中miR-451表達水平 所有研究對象均空腹無菌采集5 mL靜脈血，放入EDTA抗凝管中，均在手術(shù)、放療或化療等抗腫瘤治療前進行血樣采集。采集的血樣在25℃下2500 r/min離心10 min后吸取上層血漿至EP管中，再4℃ 12 000 r/min離心10 min后收集上層血漿至新的EP管中，-80℃保存用于實驗。

血漿中總RNA提取采用miRNA-提取分離試劑盒，利用紫外分光光度儀檢測RNA溶液OD260及OD280值并計算OD260/OD280值，比值在1.8～2.1之間的RNA溶液符合質(zhì)量要求，用于后續(xù)實驗。

使用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進行cDNA第一鏈合成，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。根據(jù)文獻[17-18]分別合成miR-451、內(nèi)參照U6的逆轉(zhuǎn)錄引物及PCR引物，miR-451逆轉(zhuǎn)錄引物序列：TCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGA AA CTCAGT，PCR上游引物序列：AAACCGTTACCATTACTGAG，下游引物序列：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG；U6逆轉(zhuǎn)錄引物序列：AACGXTTCACGAATTTGCGT，PCR上游引物序列：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物序列：AACGXTTCACGAATTTG CGT。采用SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑進行PCR反應(yīng)。20 μL反應(yīng)體系包括上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ 10 μL、3.0 μL模板及5.0 μL雙蒸水。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，然后95℃ 5 s、62℃ 40 s，進行35個循環(huán)，每個樣本的每個基因均設(shè)立3個復(fù)孔，PCR反應(yīng)結(jié)束后自動獲得循環(huán)閾值（CT值）。采用2-ΔΔCT計算miR-451在血漿中的表達水平。

1.3.2 電化學(xué)發(fā)光法測定血清中AFP水平 肝癌患者空腹抽取3 mL靜脈血，3000 r/min離心5 min后吸取上層血清，采用全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進行血清AFP水平測定，嚴格按照操作說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血漿中miR-451表達水平比較

采用定量RT-PCR檢測兩組血漿miR-451表達水平，結(jié)果顯示，miR-451在肝癌患者血漿中表達水平為（0.43±0.16），明顯低于對照組（0.59±0.21），二者差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.928，P < 0.01）。

2.2 血漿中miR-451表達水平與肝癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

結(jié)果顯示，肝癌患者血漿中miR-451表達水平在不同性別、年齡、分化程度及AFP水平之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；與腫瘤≤5 cm、無淋巴轉(zhuǎn)移、靜脈侵犯陰性及單發(fā)腫瘤患者相比，腫瘤>5 cm、有淋巴轉(zhuǎn)移、靜脈侵犯陽性及多發(fā)腫瘤的肝癌患者血漿中miR-451表達水平分別明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期肝癌患者血漿中miR-451水平明顯低于Ⅰ/Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

3 討論

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，對化療和放療不敏感，早期治療性切除是目前治療肝癌最有效的方法，早期診斷是提高手術(shù)效果的關(guān)鍵，但肝癌早期診斷較為困難，尋找早期診斷指標是肝癌研究領(lǐng)域中迫切需要解決的問題。miRNA主要通過與靶基因mRNA的3端非編碼區(qū)域結(jié)合，降解靶基因或抑制靶基因的表達，從而發(fā)揮基因調(diào)節(jié)作用，廣泛參與了細胞增殖、凋亡、分化等生理病理過程。國內(nèi)外大量研究證實，miRNAs在許多腫瘤中表達上調(diào)或下調(diào)，參與了腫瘤的病理過程[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-10、miR-21、miR-221及miR-224等在肝癌中表達上調(diào)，而miR-101、miR-122、miR-199、miR-214等在肝癌中表達下調(diào)，同時多種miRNA與肝癌的轉(zhuǎn)移、預(yù)后及治療反應(yīng)性密切相關(guān)[4-5]。

miR-451是在人腦垂體RNA研究中新發(fā)現(xiàn)的miRNA，基因定位于人19q11.2。研究證實，miR-451在腫瘤組織中表達異常[6-13]。與癌旁組織相比，膀胱癌[8]、骨肉瘤[9]、鼻咽癌[10]、肺癌[11]、結(jié)腸癌[12]及甲狀腺癌[13]等多種腫瘤組織中miR-451的表達水平降低。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，肝癌組織中miR-451表達水平下調(diào)且與臨床分期、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)[14]。體外細胞實驗研究發(fā)現(xiàn)，miR-451在肝癌細胞系HepG2和SK-Hep-1中表達水平下調(diào)，可以抑制腫瘤細胞生長、遷移及侵襲，促進凋亡[15]。Li等[16]也證實，miR-451在肝癌組織與細胞中的表達明顯下調(diào)，下調(diào)miR-451可以促進肝癌細胞的增殖，而上調(diào)則抑制肝癌細胞的增殖。研究證實，miRNA由于長度較短且具有較強的抵抗RNA酶降解作用，可以在血液中穩(wěn)定存在[17-22]，是一種理想的腫瘤標志物。目前研究發(fā)現(xiàn)，外周血中miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-122、miR-192等多種miRNAs有望成為肝癌早期診斷指標[5]。多項研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌[23]、腎癌[24]、肺癌[25]患者血漿或血清中miR-451表達異常，與腫瘤的診斷及預(yù)后有關(guān)。為了探討miR-451在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本實驗采用定量RT-PCR法檢測了肝癌患者血漿中miR-451的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，肝癌患者血漿中miR-451的表達水平明顯降低（P < 0.01），這與相關(guān)研究結(jié)果一致[14-16]。提示miR-451是一種抑癌miRNA，肝癌患者體內(nèi)miR-451水平降低，促進了腫瘤的發(fā)生。本研究還統(tǒng)計分析了血漿中miR-451表達水平與肝癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，肝癌患者血漿中miR-451水平在不同性別、年齡、分化程度及AFP水平之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），而與腫瘤大小、腫瘤數(shù)量有關(guān)，且Ⅲ/Ⅳ期肝癌患者血漿中miR-451水平明顯低于Ⅰ/Ⅱ期患者（P < 0.05）。提示miR-451水平的降低不僅參與了肝癌的發(fā)生過程，而且與肝癌的發(fā)展過程有關(guān)，但其具體作用的機制尚不完全清楚。進一步分析表明，發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移、靜脈侵犯的肝癌患者血漿中miR-451水平明顯降低，這與以往的研究結(jié)果基本一致[16-17]。提示低水平miR-451容易導(dǎo)致肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移，miR-451可能發(fā)揮抑制肝癌轉(zhuǎn)移的作用。隨著對miR-451研究的不斷深入，可能為進一步解決肝癌臨床轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)提供新的思路。

綜上所述，肝癌患者血漿中miR-451表達水平降低，且miR-451的表達水平與肝癌腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、靜脈侵犯、腫瘤數(shù)量及臨床分期有關(guān)，提示miR-451可能參與了肝癌的病理過程。但血漿中miR-451的來源及其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制尚不清楚。隨著對miR-451在肝癌中作用研究的不斷深入，可能為肝癌的早期診斷、判斷預(yù)后及治療提供新的靶點。

[參考文獻]

[1] Lafaro KJ，Demirjian AN，Pawlik TM. Epidemiology of hepatocellular carcinoma [J]. Surg Oncol Clin N Am，2015，24（1）：1-17.

[2] Jansson MD，Lund AH. MicroRNA and cancer [J]. Mol Oncol，2012，6（6）：590-610.

[3] Acunzo M，Romano G，Wernicke D，et al. MicroRNA and cancer-a brief overview [J]. Adv Biol Regul，2015，57：1-9.

[4] Zhao X，Yang Z，Li G，et al. The role and clinical implications of microRNAs in hepatocellular carcinoma [J]. Sci China Life Sci，2012，55（10）：906-919.

[5] Li X，Yang W，Lou L，et al. microRNA： a promising diagnostic biomarker and therapeutic target for hepatocellular carcinoma [J]. Dig Dis Sci，2014，59（6）：1099-1107.

[6] Pan X，Wang R，Wang ZX. The potential role of miR-451 in cancer diagnosis， prognosis， and therapy [J]. Mol Cancer Ther，2013，12（7）：1153-1162.

[7] Su Z，Zhao J，Rong Z，et al. MiR-45， a potential prognostic biomarker and tumor suppressor for gastric cancer [J]. Int J Clin Exp Pathol，2015，8（8）：9154-9160.

[8] Zeng T，Peng L，Chao C，et al. miR-451 inhibits invasion and proliferation of bladder cancer by regulating EMT [J]. Int J Clin Exp Pathol，2014，7（11）：7653-7662.

[9] Zhang F，Huang W，Sheng M，et al. MiR-451 inhibits cell growth and invasion by targeting CXCL16 and is associated with prognosis of osteosarcoma patients [J]. Tumour Biol，2015，6（3）：2041-2048.

[10] Zhang T，Sun Q，Liu T，et al. MiR-451 increases radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cells by targeting ras-related protein 14（RAB14）[J]. Tumour Biol，2014，35（12）：12593-12599.

[11] Yin P，Peng R，Peng H，et al. MiR-451 suppresses cell proliferation and metastasis in A549 lung cancer cells [J]. Mol Biotechnol，2015，57（1）：1-11.

[12] Bandres E，Bitarte N，Arias F，et al. microRNA-451 regulates macrophage migration inhibitory factor production and proliferation of gastrointestinal cancer cells [J]. Clin Cancer Res，2009，15（7）：2281-2290.

[13] Wang Z，Zhang H，Zhang P，et al. Upregulation of miR-2861 and miR-451 expression in papillary thyroid carcinoma with lymph node metastasis [J]. Med Oncol，2013，30（2）：577.

[14] Huang JY，Zhang K，Chen DQ，et al. MicroRNA-451：epithelial-mesenchymal transition inhibitor and prognostic biomarker of hepatocelluar carcinoma [J]. Oncotarget，2015，6（21）：18613-18630.

[15] Lv G，Hu Z，Tie Y，et al. MicroRNA-451 regulates activating transcription factor 2 expression and inhibits liver cancer cell migration [J]. Oncol Rep，2014，32（3）：1021-1028.

[16] Li HP，Zeng XC，Zhang B，et al. miR-451 inhibits cell proliferation in human hepatocellular carcinoma through direct suppression of IKK-β [J]. Carcinogenesis，2013，34（11）：2443-2451.

[17] 謝海濤.結(jié)腸癌組織中miR-451表達的檢測與分析[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志，2012，40（3）：257-259.

[18] 張銘，李曉利，許君望，等.結(jié)腸癌患者血漿中microRNA-100的檢測及其與臨床病理特征的關(guān)系[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015，46（8）：44-47.

[19] Zen K，Zhang CY. Circulating microRNAs：a novel class of biomarkers to diagnose and monitor human cancers [J]. Med Res Rev，2012，32（2）：326-348.

[20] Chakraborty C，Das S. Profiling cell-free and circulating miRNA：a clinical diagnostic tool for different cancers [J]. Tumour Biol，2016，37（5）：5705-5714.

[21] He Y，Lin J，Kong D，et al. Current State of Circulating MicroRNAs as Cancer Biomarkers [J]. Clin Chem，2015，61（9）：1138-1155.

[22] Cheng G. Circulating miRNAs： roles in cancer diagnosis，prognosis and therapy [J]. Adv Drug Deliv Rev，2015，81：75-93.

[23] Gu X，Xue JQ，Han SJ，et al. Circulating microRNA-451 as a predictor of resistance to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer [J]. Cancer Biomark，2016，16（3）：395-403.

[24] Redova M，Poprach A，Nekvindova J，et al. Circulating miR-378 and miR-451 in serum are potential biomarkers for renal cell carcinoma [J]. J Transl Med，2012，10（14）：55.

[25] Markou A，Sourvinou I，Vorkas PA，et al. Clinical evaluation of microRNA expression profiling in non small cell lung cancer [J]. Lung Cancer，2013，81（3）：388-396.

（收稿日期：2016-07-12 本文編輯：程 銘）