廉玉利++李依娜++王煒琪++孟德勇

【摘 要】本文闡述了生長素的種類和生物合成過程，色氨酸單加氧酶是細(xì)菌中生長素生物合成過程中的重要限速酶，其編碼基因iaaM已被克隆并在植物基因工程得到廣泛應(yīng)用。本文重點(diǎn)綜述了轉(zhuǎn)化iaaM基因可增加植物內(nèi)源生長素的含量，在改善植物的生長發(fā)育狀況，提高作物產(chǎn)量，改良作物品質(zhì)，誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)，參與抗逆反應(yīng)等方面起到了顯著作用，并分析了iaa M基因在植物基因工程中應(yīng)用研究方向。

【關(guān)鍵詞】生長素 色氨酸單加氧酶 植物基因工程

【Abstract】In this paper， the species and biosynthetic process of auxin are elaborated. In bacterium， tryptophan monooxygenase catalyze the rate-limiting step of auxin biosynthesis， and its coding genes have been cloned and used widely in plant genetic engineering .The overview of the iaaM gene transformation can be increased endogenous auxin content which has significant effect in improving growth and development， increasing crop yield and altering crop quality， serving？as？selectionmarker？gene， inducing parthenocarpy， participating in the stress resistance and other aspects.At the last， the paper analyzed the application and research direction of the iaaM gene in plant gene engineering.

【Keywords】auxin； tryptophan monooxygenase gene （iaaM）； plant genetic engineering

生長素是調(diào)控植物生長發(fā)育最重要的植物激素之一。生長素在調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂與伸長、向性運(yùn)動(dòng)、頂端優(yōu)勢、細(xì)胞衰老、花器官的形成、逆境應(yīng)答等生長發(fā)育都具有十分重要的作用，它對植物的早期發(fā)育和形態(tài)建成均具有重要意義。色氨酸單加氧酶（IAAM）是細(xì)菌中吲哚乙酰胺途徑催化生長素生物合成的關(guān)鍵酶，也是最重要的限速酶。本文就生長素的合成、色氨酸單加氧酶基因（簡稱iaaM基因）以及其在植物基因工程上應(yīng)用進(jìn)行了綜述，旨在為探索生長素合成機(jī)理和生理作用機(jī)理及色氨酸單加氧酶基因在植物基因工程上應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為通過基因工程手段調(diào)整植物激素水平進(jìn)行作物遺傳育種展示了廣闊的應(yīng)用前景。

1 生長素素的生物合成與iaaM基因

研究生長素合成的分子基礎(chǔ)、生化機(jī)制以及合成限速酶，對界定生長素在植物發(fā)育中的功能、利用基因工程技術(shù)調(diào)整生長素在植物中的含量以及調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育都具有重要作用。

1.1 生長素的生物合成

生長素主要包括3-吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、4-氯吲哚乙酸（4-Cl-IAA）和苯乙酸（PAA）四種類型。IAA是天然植物生長素的主要活性成分，是最早發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)植物生長的激素，依據(jù)IAA合成過程的中的主要中間產(chǎn)物，把依賴色氨酸的生物合成過程劃分為4個(gè)途徑（圖1）：吲哚乙腈途徑、吲哚乙酰胺途徑、吲哚丙酮酸途徑和色胺途徑。其中吲哚乙腈途徑是植物生長素合成過程的次要途徑，在植物的特殊發(fā)育階段或特殊環(huán)境下啟動(dòng)，主要存在于十字花科、禾本科、芭蕉科等的一些植物中，最近在葫蘆科、茄科、豆科和薔薇科也發(fā)現(xiàn)腈水解酶活性，但在水稻、玉米、煙草中尚未發(fā)現(xiàn)該途徑；吲哚乙酰胺途徑僅存在于銅綠色假單胞菌、植物伴生菌和農(nóng)桿菌等細(xì)菌中，能使寄生植物形態(tài)發(fā)生改變，本途徑在植物中尚未發(fā)現(xiàn)。吲哚丙酮酸途徑是高等植物合成IAA的主要途徑，在巴西固氮螺和陰溝腸桿菌等根際固氮菌中也存在該途徑；色胺途徑常與吲哚丙酮酸途徑同時(shí)進(jìn)行，是大麥、 燕麥、煙草、豌豆、擬南芥等植物IAA合成重要途徑[1]。如圖1所示。

1.2 iaaM基因

目前在生化和遺傳上都研究比較透徹的IAA合成途徑是吲哚乙酰胺途徑，該途徑最早發(fā)現(xiàn)于假單胞菌，后來在植物伴生菌中得到鑒定。在根癌農(nóng)桿菌中（圖1），iaaM基因編碼色氨酸單加氧酶，它催化色氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)镮AM，iaaH基因編碼吲哚乙酰胺水解酶，催化IAM生成IAA的反應(yīng)，吲哚乙酰胺水解酶是生長素在細(xì)菌中生物合成重要限速酶[2]。在擬南芥和煙草中發(fā)現(xiàn)的吲哚乙酰胺水解酶與細(xì)菌的IAAH催化區(qū)域序列同源，都能催化吲哚乙酰胺（IAM）合成IAA，然而，植物尚未發(fā)現(xiàn) iaaM基因和色氨酸單加氧酶，因此植物中存在的該途徑與細(xì)菌生物合成IAA過程相似但不相同[1]。

研究微生物中IAA合成途徑的對開展植物體內(nèi)IAA合成的研究具有重要啟示作用。利用基因工程手段把iaaM基因克隆并轉(zhuǎn)化到植物中，觀察轉(zhuǎn)基因植物從分子水平到表型的變化，從而能為研究和調(diào)控植物中IAA的表達(dá)水平提供強(qiáng)有力的證據(jù)支持。

2 iaaM基因的應(yīng)用

已有研究表明通過轉(zhuǎn)化iaaM基因可增加植物內(nèi)源的生長素的含量，具有改善植物的生長發(fā)育狀況，提高作物產(chǎn)量，改良作物品質(zhì)，誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)，參與抗逆反應(yīng)等作用。

2.1 對生長發(fā)育的影響

生長素對植物形態(tài)發(fā)育與建成起著重要作用，利用農(nóng)桿菌來源的iaaM基因的遺傳轉(zhuǎn)化，有助于研究轉(zhuǎn)基因植物中生長素水平變化對植物營養(yǎng)器官形態(tài)發(fā)育的影響。李朝霞[3]研究表明隨著轉(zhuǎn)iaaM基因植株的IAA水平升高，保衛(wèi)細(xì)胞的長度增加、柵欄組織細(xì)胞增大和葉片厚度增加、而氣孔密度減小，葉片長度減少50%，單位面積葉片的細(xì)胞數(shù)減少，而體積增大，可能是由于過量生長素水平可能減少葉原基分生細(xì)胞的分裂次數(shù)，但能促進(jìn)葉細(xì)胞生長和分化。荊風(fēng)雪[4]將來源于棉花纖維細(xì)胞高效表達(dá)的E6基因啟動(dòng)子與iaaM構(gòu)建重組基因轉(zhuǎn)化黃花蒿，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的腺毛密度與對照組相比提高了約21%，腺毛細(xì)胞大小約增加1.16倍。彭彥等[5]將擬南芥韌皮部特異啟動(dòng)子ASUS1基因啟動(dòng)子和iaaM融合基因轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)大多轉(zhuǎn)基因煙草都出現(xiàn)生長異常的生長素過度表型且生長遲緩、葉片卷曲，較野生型煙草植株相比莖的橫切面韌皮部細(xì)胞數(shù)量顯著增加，排列更加緊密整齊，木質(zhì)部分化較早，其根部則在韌皮部薄壁細(xì)胞處誘生大量根原基，莖段有大量不定根分化，在不定根上有大量側(cè)根和根毛的分化。TV Bavrina[6]和VV Alekseeva[7]研究也發(fā)現(xiàn)而轉(zhuǎn)iaaM基因植物中的IAA水平若過量增加，將會(huì)引起植株形態(tài)不正常，不定根增多，種子不萌發(fā)。

2.2 提高作物產(chǎn)量，改良作物品質(zhì)

生長素具有誘導(dǎo)光合產(chǎn)物向其含量高的部位運(yùn)輸?shù)哪芰Γ翘岣吖酀{效率的重要調(diào)控因子，說明局部生長素合成對作物籽粒灌漿具有重要的生物學(xué)功能。在生產(chǎn)實(shí)踐中，提高內(nèi)源或外源生長素水平可有效增加結(jié)實(shí)率和座果率，增大果實(shí)和提高籽粒的重量以提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。

Zhang等[8]利用矮牽牛種子表皮特異啟動(dòng)子FBP7驅(qū)動(dòng)iaaM基因的表達(dá)既特異提高了棉花胚珠表皮生長素的含量，且對棉花生長發(fā)育和其他農(nóng)藝性狀也產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)FBP7：iaaM基因棉花的種子表皮纖維數(shù)量增加且衣分可以達(dá)到48%以上，提高了近15%，纖維細(xì)度也有明顯改善，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品和品質(zhì)性狀同步提高。Mezzetti B等[9]等將驅(qū)動(dòng)胚珠及子房基因的特異表達(dá)的啟動(dòng)子DefH9與iaaM融合基因?qū)胨N薇科的草莓和覆盆子，研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株花序的數(shù)量和每個(gè)花序的座果數(shù)量均增加，單個(gè)果實(shí)的重量和尺寸也增加，最終使轉(zhuǎn)基因草莓和覆盆子的產(chǎn)量分別增加180%和100%，同時(shí)能使去雄的轉(zhuǎn)基因草莓和覆盆子單性結(jié)實(shí)。文秀紅[10]將種子特異啟動(dòng)子SSP與iaaM融合基因轉(zhuǎn)入油菜，轉(zhuǎn)基因植株在形態(tài)上未表現(xiàn)出生長素含量過高的表現(xiàn)，植株的種子增大增多，增產(chǎn)達(dá)15.2%。研究者們利用IAA可使植物的莖伸長、木質(zhì)化加劇的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)iaaM基因的楊樹或其他木材植物，節(jié)間伸長，葉面積增大，有強(qiáng)的頂端優(yōu)勢，高度和莖的直徑均增加，增加了其作為木材的優(yōu)良品質(zhì)[11，12]。對轉(zhuǎn)基因番茄、葡萄、草莓等果蔬的成分分析表明，果實(shí)顏色、可溶性固體、干物質(zhì)總量、有機(jī)酸、總多酚等果實(shí)質(zhì)量相關(guān)重要參數(shù)無明顯差異。

2.3 作為選擇標(biāo)記基因

iaaM基因作為一個(gè)選擇標(biāo)記基因，其表達(dá)有利于促進(jìn)不定芽的分化并導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株表型發(fā)生反常變化。因此，iaaM基因可作為簡單的表型標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化子，直觀的指示轉(zhuǎn)化是否成功。劉春明等將iaaM和iaaH基因?qū)霟煵菁?xì)胞后，可以在沒有2， 4-D的情況下誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的形成[13]。Zheng X[14]等將p35S（CaMV35S啟動(dòng)子）-pAGL5（胚珠特異啟動(dòng)子）-iaaM、p35S-iaaM、pAGL5-iaaM、pNOS（農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因啟動(dòng)子）-pAGL5-iaaM 4個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，結(jié)合植株的表型變化和RT-PCR檢測iaaM基因在根、莖、葉、花、果實(shí)中的表達(dá)水平，證明了CaMV35S啟動(dòng)子具有將毗鄰的組織或器官特異啟動(dòng)子覆蓋的能力。Alida Ballester[15]利用ipt（異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因）聯(lián)合iaaM/H作為選擇標(biāo)記基因遺傳轉(zhuǎn)化柑橘和甜橙時(shí)，轉(zhuǎn)化率分別達(dá)7.2%和6.7%。

2.4 誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)

單性結(jié)實(shí)是人們獲得無籽果實(shí)的有效途徑之一，iaaM基因的胚珠特異性表達(dá)提高果實(shí)中生長素濃度，刺激子房發(fā)育成果實(shí)，可創(chuàng)造遺傳穩(wěn)定的單性結(jié)實(shí)品種，為植物單性結(jié)實(shí)育種提供了新的基因和思路。Rotino等把DefH9與iaaM融合基因?qū)肭炎?，提高IAA在胚珠、子房等組織的合成水平，獲得100%的單性結(jié)實(shí)座果率，產(chǎn)品質(zhì)量也得到了提高。Pandolfini等將改良融合基因DefH9-RI-iaaM導(dǎo)入番茄，所結(jié)單性番茄果實(shí)無畸形果且品質(zhì)較高。目前，iaaM基因已被應(yīng)用用于煙草、覆盆子、黃瓜、草莓等植物單性結(jié)實(shí)。

2.5 抗逆作用

生長素在植物生根中起中心作用，很多誘發(fā)生根因子都是通過生長素起作用的。體外施加生長素可促進(jìn)不定根和側(cè)根的生長發(fā)育，且內(nèi)源生長素含量升高的轉(zhuǎn)基因或突變植株均表現(xiàn)出側(cè)根增加，抗旱能力增強(qiáng)。轉(zhuǎn)iaaM基因的轉(zhuǎn)基因煙草根系發(fā)達(dá)、含水量高、保水能力強(qiáng)、耐熱性和抗旱性強(qiáng)。吳忠義研究表明外源IAAM/AtCKX3基因在玉米的根中特異性表達(dá)，促進(jìn)了根系的生長發(fā)育，從而提高了玉米的抗旱性，且轉(zhuǎn)基因株系在正常澆水條件下的生長發(fā)育沒有受到抑制。該研宄說明促進(jìn)根系的生長發(fā)育才是提高植物抗旱性的關(guān)鍵有效途徑，為抗旱新種質(zhì)材料創(chuàng)制提供了一個(gè)新的思路。

特定啟動(dòng)子調(diào)控下的iaaM基因表達(dá)引起的單性結(jié)實(shí)，在不利于授粉的條件下也能保持產(chǎn)量的穩(wěn)定，因而轉(zhuǎn)iaaM基因的單性結(jié)實(shí)作物本身就具有一定的抗逆能力。Rotino GL等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)iaaM基因的番茄在花期、座果期出現(xiàn)顯著高溫， 仍然保持了相當(dāng)高的產(chǎn)量，單果數(shù)增加。Rotino GL等獲得的轉(zhuǎn)基因茄子在寒冷的冬季也能正常坐果。

除此之外，趙麗紅研究發(fā)現(xiàn)iaaM和ACC脫氨基酶基因的協(xié)同表達(dá)可提高植物對重金屬的吸收和組織中中金屬的含量，還有研究發(fā)現(xiàn)把iaaM基因轉(zhuǎn)化根際微生物，iaaM基因表達(dá)的產(chǎn)物能促進(jìn)其寄生植物的抗旱性和抗病原菌能力。

3 展望

近年來，隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，基因工程技術(shù)廣泛地應(yīng)用于植物的遺傳與改良，大力推動(dòng)了生長素和iaaM基因在植物基因工程的研究與應(yīng)用，但解析植物中生長素的合成代謝與器官發(fā)生發(fā)育過程的關(guān)系還需進(jìn)一步探討，對于轉(zhuǎn)iaaM基因的植株中生長素與其它激素相互作用機(jī)制以及激素對植物生長發(fā)育的作用還需進(jìn)一步探究，大部分轉(zhuǎn)iaaM基因的研究還處于轉(zhuǎn)化階段，對轉(zhuǎn)基因植物的生理方面還有待在細(xì)胞水平和分子水平進(jìn)行深入研究。隨著更多優(yōu)良特異啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)，利用iaaM基因?qū)⑴嘤龈喈a(chǎn)量高和品質(zhì)優(yōu)的作物新品種。

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