白宇皓，陳真真，談宏斌，刁慧珊，梁邦平，李家創(chuàng)，劉 洋，武 軍，趙繼新，楊群慧，陳新宏

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/陜西省植物遺傳工程育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100； 2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，山西忻州 034000； 3.陜西省種業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司，陜西楊凌 712100)

穗發(fā)芽抗性相關(guān)分子標(biāo)記在73個(gè)小麥品種中的有效性評(píng)價(jià)

白宇皓1,2，陳真真1，談宏斌3，刁慧珊1，梁邦平1，李家創(chuàng)1，劉 洋1，武 軍1，趙繼新1，楊群慧1，陳新宏1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/陜西省植物遺傳工程育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100； 2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，山西忻州 034000； 3.陜西省種業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司，陜西楊凌 712100)

為發(fā)掘小麥抗穗發(fā)芽種質(zhì)資源，并對(duì)與抗穗發(fā)芽相關(guān)的分子標(biāo)記的有效性進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)73個(gè)國(guó)內(nèi)外小麥品種進(jìn)行了穗發(fā)芽抗性鑒定，同時(shí)利用4對(duì)穗發(fā)芽抗性相關(guān)分子標(biāo)記(Vp-1B3、wmc104、Xbarc170、Xgwm155)對(duì)上述品種進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，73個(gè)品種的穗發(fā)芽抗性差異明顯，發(fā)芽指數(shù)變化范圍為0.29%～88.48%，其中13個(gè)品種的發(fā)芽指數(shù)小于10%。分析發(fā)芽指數(shù)與分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果之間的相關(guān)性表明，Vp-1B3標(biāo)記與穗發(fā)芽抗性相關(guān)，wmc104、Xbarc170、Xgwm155標(biāo)記與穗發(fā)芽抗性相關(guān)性不顯著。煙農(nóng)23、蘭考181、陜農(nóng)33、西農(nóng)585、美105、美231、PBW550、DL788-2等8個(gè)品種為具有 Vp-1Bb基因型的高抗穗發(fā)芽品種。

小麥；穗發(fā)芽；發(fā)芽指數(shù)；分子標(biāo)記

小麥在收獲前遇到潮濕陰雨天氣而在穗上發(fā)芽稱作成熟期穗發(fā)芽(pre-harvest sprouting,PHS)，發(fā)生穗發(fā)芽的小麥在產(chǎn)量、品質(zhì)、加工價(jià)值上都相應(yīng)下降，同時(shí)對(duì)下年的種子品質(zhì)也有較大影響[1]。在我國(guó)，受小麥穗發(fā)芽影響的區(qū)域十分廣泛，長(zhǎng)江中下游地區(qū)、西南冬麥區(qū)、東北春麥區(qū)、黃淮冬麥區(qū)等在小麥成熟期易出現(xiàn)連續(xù)陰雨的地區(qū)穗發(fā)芽發(fā)生較為嚴(yán)重。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，受穗發(fā)芽影響的小麥種植面積占全國(guó)總小麥種植面積的83%[2]。因此，穗發(fā)芽抗性材料的發(fā)掘與抗穗發(fā)芽品種的選育是小麥抗性育種的重要課題之一。

穗發(fā)芽抗性的機(jī)理較為復(fù)雜，抗性性狀受到多種因素影響，其中種子自身因素包括種子休眠水平、種子結(jié)構(gòu)、穗部形態(tài)、干燥能力等[3]；環(huán)境因素包括環(huán)境溫度、水分、光照、土壤氮含量等[4]。種子的休眠特性是影響穗發(fā)芽抗性的主要因素[5]，有一系列調(diào)控種子休眠的基因和QTL被定位到了小麥基因組染色體上。Groos等[6]用不抗穗發(fā)芽的白皮品種與抗穗發(fā)芽的紅皮品種雜交后構(gòu)建連鎖圖譜，在控制種皮顏色的R基因和 taVp1基因位點(diǎn)附近定位了3個(gè)與穗發(fā)芽相關(guān)的QTL，位于第三同源群長(zhǎng)臂上。Flintham等[7]將1個(gè)與休眠相關(guān)的主效基因Phs定位于4AL上，并分析了白皮小麥和紅皮小麥中近等R基因的差異與休眠水平的關(guān)系，解釋了紅皮小麥有較好的穗發(fā)芽抗性的原因。Chao等[8]在2A、2B、3A、4A和7B染色體上發(fā)現(xiàn)了與種子休眠和穗發(fā)芽抗性相關(guān)的基因，但同時(shí)認(rèn)為穗發(fā)芽抗性受多基因控制且與種子休眠特性呈弱相關(guān)。Yang等[9]發(fā)現(xiàn) Vp-1基因的等位變異 Vp-1B與穗發(fā)芽抗性相關(guān)，并開發(fā)出定位于3BL上的Vp-1B3標(biāo)記。Vp-1B3標(biāo)記對(duì)89份白皮小麥品種進(jìn)行驗(yàn)證，抗穗發(fā)芽品種可擴(kuò)增出845 bp或569 bp片段，感穗發(fā)芽品種擴(kuò)增出652 bp片段。Roy等[10]通過對(duì)分別由5個(gè)重組自交系構(gòu)建的抗感池進(jìn)行分離群體分組分析，發(fā)現(xiàn)定位于6B染色體上的STS標(biāo)記wmc104與穗發(fā)芽抗性顯著相關(guān)。Mares等[11]在4A染色體上發(fā)現(xiàn)1個(gè)與種子休眠相關(guān)QTL，并證明位于其一側(cè)的SSR標(biāo)記Xbarc170與種子休眠有關(guān)。Kulwal等[12]發(fā)現(xiàn)1個(gè)定位于3AL染色體上與種子休眠相關(guān)的主效QTL，與SSR標(biāo)記Xgwm155緊密連鎖。

育種過程中應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)能較為高效地對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，但穗發(fā)芽抗性易受環(huán)境因素影響，且在基因水平上又受多基因位點(diǎn)調(diào)控，因此，已開發(fā)的標(biāo)記對(duì)于其他不同遺傳背景的小麥的適用性和有效性還需要進(jìn)一步檢驗(yàn)，單一鑒定方法所得出的鑒定結(jié)果的可靠性也值得商榷。鑒于此，本研究采用籽粒鑒定法對(duì)73個(gè)小麥品種的穗發(fā)芽抗性進(jìn)行鑒定，并選擇4對(duì)與穗發(fā)芽抗性相關(guān)的分子標(biāo)記對(duì)上述品種進(jìn)行檢驗(yàn)。這4對(duì)分子標(biāo)記分別定位于小麥4條染色體上，且均在一定范圍內(nèi)進(jìn)行過有效性驗(yàn)證，其中Vp-1B3標(biāo)記在已有報(bào)道中有效性驗(yàn)證得到一致的結(jié)論，其他3對(duì)標(biāo)記在不同的品種中的有效性需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究進(jìn)一步擴(kuò)大驗(yàn)證范圍，確定4對(duì)標(biāo)記在實(shí)際應(yīng)用中的適應(yīng)性，以期篩選出能夠廣泛利用的穗發(fā)芽抗性標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的73份小麥品種遺傳背景較為廣泛，8份為美國(guó)品種，14份為印度品種，51份為國(guó)內(nèi)品種(表2)，于2014年10月種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)楊凌小麥試驗(yàn)示范基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)芽指數(shù)測(cè)定

各小麥品種蠟熟期時(shí)取穗，自然干燥7 d后脫粒。籽粒經(jīng)1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒后用無(wú)菌水沖洗干凈。將籽粒腹溝向下置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽。第2天起記錄各品種每天發(fā)芽的籽粒數(shù)，以觀察到種皮明顯裂開作為發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)[14]，觀察記錄7 d。每個(gè)品種設(shè)置3次重復(fù)，取3次重復(fù)的平均值作為各品種發(fā)芽指數(shù)(germination index,GI)。

GI =(7×N1+6×N2+5×N3+…+1×N7)/(7×籽粒總數(shù))×100%

其中，N1至N7分別代表第1天至第7天籽粒的發(fā)芽數(shù)。

1.2.2 抗穗發(fā)芽分子標(biāo)記檢測(cè)

采用CTAB法[15]提取73份供試材料葉片的基因組總DNA。選用Vp-1B3、wmc104和Xbarc170、Xgwm155四對(duì)穗發(fā)芽抗性分子標(biāo)記(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括10×PCR buffer 2.5 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL、dNTPs 2 μL、Taq酶0.25 μL、模板DNA 100 ng，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。Vp-1B3標(biāo)記的PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，59 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，36個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。Xbarc170和Xgwm155標(biāo)記的PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，36個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。wmc104標(biāo)記的PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，61 ℃ 1 min (每個(gè)循環(huán)降低0.25 ℃)，72 ℃ 2 min，36個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。Vp-1B3標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，wmc104、Xbarc170和Xgwm155標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)[16]。

表1 本研究選用的4對(duì)穗發(fā)芽抗性標(biāo)記

Table 1 Four markers associated with pre-harvest sprouting resistance in this study

標(biāo)記名稱Markername引物序列(5'-3')Primersequence(5'-3')染色體Chromosome標(biāo)記類型Markertype抗性條帶Resistantfragment參考文獻(xiàn)ReferenceVp-1B3F:TGCTCCTTTCCCAATTGG3BLSTS845bp/569bp[9]R:ACCCTCCTGCAGCTCATTGwmc104F:TCTCCCTCATTAGAGAGTTGTCCA6BSTMSβ[10]R:ATGCAAGTTTAGAGCAACACCAXbarc170F:CGCTTGACTTTGAATGGCTGAACA4ASSRC[11]R:CGCCCACTTTTTACCTAATCCTTTTGAAXgwm155F:CAATCATTTCCCCCTCCC3ALSSRc[12]R:AATCATTGGAAATCCATATGCC

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 23.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及單因素ANOVA檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 73個(gè)品種穗發(fā)芽抗性表現(xiàn)

73個(gè)品種按GI值可分為4類，高抗(GI<10%)、中抗(10%60%)，其中，高抗品種13個(gè)，包括美215、美105、美114、美231、HD2932、PBW550、UP2338、煙農(nóng)23、淮核09182、蘭考181、陜農(nóng)33、周麥24、西農(nóng)585，平均GI值為4.72%，變異范圍為0.29%～9.62%；中抗品種32個(gè)，平均GI值為21.14%，變異范圍為10.19%～28.95%；中感品種20個(gè)，平均GI值為42.96%，變異范圍為30.38%～58.48%；高感品種8個(gè)，平均GI值為72.44%，變異范圍為61.81%～88.48%。

2.2 4對(duì)穗發(fā)芽抗性相關(guān)分子標(biāo)記的有效性

2.2.1 STS標(biāo)記Vp-1B3的有效性

73個(gè)品種中有68個(gè)品種用Vp-1B3標(biāo)記可擴(kuò)增出569 bp或652 bp兩種類型的產(chǎn)物，分別是抗穗發(fā)芽和感穗發(fā)芽品種的特異性產(chǎn)物。其中，可擴(kuò)增出569 bp產(chǎn)物的品種有31個(gè)，平均GI值為19.34%，變異范圍為1.90%～61.81%；可擴(kuò)增出652 bp產(chǎn)物的品種有37個(gè)，平均GI值為37.54%，變異范圍為0.29%～88.48%。5個(gè)品種沒有擴(kuò)增出這2個(gè)類型的產(chǎn)物。圖1為部分品種擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果。方差分析表明，檢測(cè)出這2類產(chǎn)物的品種之間GI值的差異達(dá)到顯著水平(F=16.60，P=0.000 1)。

2.2.2 STMS標(biāo)記wmc104的有效性

73個(gè)品種中有69個(gè)品種用wmc104標(biāo)記可擴(kuò)增出α、β、γ、δ四種類型產(chǎn)物中的一種，β型擴(kuò)增產(chǎn)物是抗穗發(fā)芽品種的特異性產(chǎn)物，α、γ、δ三種類型產(chǎn)物是感穗發(fā)芽品種的特異性產(chǎn)物。其中，可擴(kuò)增出α型產(chǎn)物的品種13個(gè)，平均GI值為26.93%，變異范圍為0.29%～72.10%；擴(kuò)增出β型產(chǎn)物的品種34個(gè)，平均GI值為32.33%，變異范圍為3.05%～69.81%；擴(kuò)增出γ型產(chǎn)物的品種16個(gè)，平均GI值為32.17%，變異范圍為1.90%～88.48%；擴(kuò)增出δ型產(chǎn)物的品種6個(gè)，平均GI值為19.86%，變異范圍為2.38%～32.00%。4個(gè)品種沒有擴(kuò)增出這4個(gè)類型的產(chǎn)物。圖2為部分品種擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果。方差分析表明，檢測(cè)出這4類產(chǎn)物的品種之間GI值的差異沒有達(dá)到顯著水平(P=0.49)。

M：DL2000；1：小偃503；2：蘭考7號(hào)；3：周麥18；4：西農(nóng)8006；5：西農(nóng)9871；6：西農(nóng)3517；7：西農(nóng)2000；8：美6；9：美105；10：美231；11：PBW343；12：DBW-17。

M:DL2000;1:Xiaoyan 503;2:Lankao 7;3:Zhoumai 18;4:Xinong 8006;5:Xinong 9871;6:Xinong 3517;7:Xinong 2000;8:Mei 6;9:Mei 105;10:Mei 231;11:PBW343;12:DBW-17.

圖1 VP-1B3標(biāo)記擴(kuò)增出的兩種片段類型

Fig.1 Two types of fragments amplified by Vp-1B3 marker

1：小偃503；2：蘭考7號(hào)；3：周麥18；4：西農(nóng)8006；5：西農(nóng)9871；6：西農(nóng)3517；7：西農(nóng)2000；8：中育9037；9：鄭0856。

1:Xiaoyan 503;2:Lankao 7;3:Zhoumai 18;4:Xinong 8006;5:Xinong 9871;6:Xinong 3517;7:Xinong 2000;8:Zhongyu 9037;9:Zheng 0856.

圖2 分子標(biāo)記wmc104擴(kuò)增出的四種片段類型

Fig.2 Four types of fragments amplified by wmc104 marker

2.2.3 SSR標(biāo)記Xbarc170的有效性

有63個(gè)品種用Xbarc170標(biāo)記可擴(kuò)增出A、B、C、D、E五種類型產(chǎn)物之一，C型產(chǎn)物是抗穗發(fā)芽品種的特異性產(chǎn)物，A、B、D、E型產(chǎn)物是感穗發(fā)芽品種的特異性產(chǎn)物。其中，可擴(kuò)增出A型產(chǎn)物的品種2個(gè)，平均GI值為26.62%，變異范圍為12.57%～40.67%；擴(kuò)增出B型產(chǎn)物的品種11個(gè)，平均GI值為35.19%，變異范圍為6.57%～79.71%；擴(kuò)增出C型產(chǎn)物的品種28個(gè)，平均GI值為24.88%，變異范圍為2.38%～88.48%；擴(kuò)增出D型產(chǎn)物的品種10個(gè)，平均GI值為24.43%，變異范圍為0.29%～45.81%；擴(kuò)增出E型產(chǎn)物的品種12個(gè)，平均GI值為35.90%，變異范圍為3.71%～72.10%。10個(gè)品種沒有擴(kuò)增出這5個(gè)類型的產(chǎn)物。圖3為部分品種擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果。方差分析表明，檢測(cè)出這5類產(chǎn)物的品種之間GI值的差異沒有達(dá)到顯著水平(P=0.38)。

1：陜農(nóng)156；2：美6；3：美32；4：美105；5：美114；6：美129；7：美142；8：美215；9：美231；10：LOK-1；11：9W-273。

1:Shannong 156;2:Mei 6;3:Mei 32;4:Mei 105;5:Mei 114;6:Mei 129;7:Mei 142;8:Mei 215;9:Mei 231;10:LOK-1;11:9W-273.

圖3 Xbarc170標(biāo)記擴(kuò)增出的五種片段類型

Fig.3 Five types of fragments amplified by Xbarc170

2.2.4 SSR標(biāo)記Xgwm155的有效性

有68個(gè)品種用Xgwm155標(biāo)記可擴(kuò)增出a、b、c、d四種類型的產(chǎn)物之一，c型產(chǎn)物是抗穗發(fā)芽品種的特異性產(chǎn)物，a、b、d型產(chǎn)物是感穗發(fā)芽品種的特異性產(chǎn)物。其中，可擴(kuò)增出a型產(chǎn)物的品種18個(gè)，平均GI值為27.25%，變異范圍為9.24%～88.48%；擴(kuò)增出b型產(chǎn)物的品種30個(gè)，平均GI值為27.57%，變異范圍為0.29%～65.24%；擴(kuò)增出c型產(chǎn)物的品種10個(gè)，平均GI值為47.03%，變異范圍為16.19%～79.71%；擴(kuò)增出d型產(chǎn)物的品種10個(gè)，平均GI值為28.96%，變異范圍為3.05%～61.81%。5個(gè)品種沒有擴(kuò)增出這4個(gè)類型的產(chǎn)物。圖4為部分品種擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果。方差分析表明，檢測(cè)出這4類產(chǎn)物的品種之間GI值的差異沒有達(dá)到顯著水平(P=0.26)。

1：小偃503；2：蘭考7號(hào)；3：周麥18；4：西農(nóng)8006；5：西農(nóng)9871；6：西農(nóng)3517；7：西農(nóng)2000；8：中育9037；9：鄭0856。

1:Xiaoyan 503;2:Lankao 7;3:Zhoumai 18;4:Xinong 8006;5:Xinong 9871;6:Xinong 3517;7:Xinong 2000;8:Zhongyu 9037;9:Zheng 0856.

圖4 Xgwm155標(biāo)記擴(kuò)增出的四種片段類型

Fig.4 Four types of fragments amplified by Xgwm155 marker

表2 73個(gè)品種的發(fā)芽指數(shù)和4對(duì)抗性標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

Table 2 Germination index(GI) and the results of four markers detected in 73 cultivars

品種Variety發(fā)芽指數(shù)GI/%VP-1B3Xbarc170Xgwm155wmc104美215 Mei2150.29652Dbα淮核09182 Huaihe091821.71----蘭考181 Lankao1811.90569--γ煙農(nóng)23 Yannong232.38569Cbδ陜農(nóng)33 Shaannong333.05569Cdβ周麥24 Zhoumai243.71652Edα美105 Mei1053.71569Db-西農(nóng)585 Xinong5854.76569CbαHD29324.95652Cbγ美114 Mei1146.57652B-β美231 Mei2319.24569Ba-PBW5509.43569CaβUP23389.62569Caβ小偃23 Xiaoyan2310.19652E-γDL788-210.38569CbβWH-14710.86569CbβRAJ-307711.24569DaβLOK-I12.57652Abα周麥18 Zhoumai1815.14652Baγ新麥26 Xinmai2616.19652Ccδ美129 Mei12916.38569Baα西農(nóng)9871 Xinong987118.00569-aδUP-256519.05569Caβ新麥20 Xinmai2019.71569-cβ9W-27319.81569Caβ周麥30 Zhoumai3020.95569Edγ周麥25 Zhoumai2521.81569Caβ蘭考7號(hào) Lankao722.38569Caγ鄭麥0856 Zhengmai085623.05652CbαDBW-1723.14569Cbγ農(nóng)大1108 Nongda110823.52569Cdβ小偃503 Xiaoyan50323.71569Bdα綿1006-8 Mian1006-823.81652Dbβ煙19 Yan1924.10-Caβ中麥895 Zhongmai89524.29652Cbβ小偃22 Xiaoyan2224.57652Cbδ中育9037 Zhongyu903725.05569EcαDBW-1425.05-Cbγ武農(nóng)6號(hào) Wunong625.14569Cbβ豐德存麥5號(hào) Fengdecunmai526.00569-bδ山農(nóng)055843 Shannong05584327.24569Dbγ周麥16 Zhoumai1627.62652Eaγ洛麥23 Luomai2327.81569Cbβ西農(nóng)223 Xinong22328.67569Ebβ西農(nóng)889 Xinong88928.95652Dbγ西農(nóng)8006 Xinong800630.38652Dbβ蘭考815 Lankao81530.95652-dα阜麥12 Fumai1232.00569Cbδ鄭0856 Zheng085634.76652Ecα西農(nóng)3517 Xinong351735.14652Dbβ豫農(nóng)88 Yunong8837.52652Edβ小偃120 Xiaoyan12037.71652Dbβ美32 Mei3237.81652Baβ百農(nóng)416 Bainong41638.10652Cdγ

(續(xù)表2 Continued table 2)

品種Variety發(fā)芽指數(shù)GI/%VP-1B3Xbarc170Xgwm155wmc104周27 Zhou2738.76652Baβ陜農(nóng)56 Shaannong5640.67569Acβ中2210 Zhong221044.19652Cbγ煙22 Yan2245.81652Daβ陜農(nóng)156 Shaannong15646.29652Edβ浚麥35 Xunmai3548.57652Bcα徐麥9158 Xumai915854.19652Ebα西農(nóng)2000 Xinong200055.33652Bbβ美6 Mei655.90652BaβDBW-1656.67652Cbγ山農(nóng)22 Shannong2258.48--bβ浚麥K8 XunmaiK861.81569Cdβ鄭麥111 Zhengmai11163.71652-cβNIAW-3465.24652-bβ小偃24 Xiaoyan2469.81652Ecβ小偃18 Xiaoyan1872.10652Ecα美142 Mei14278.67----偃麥6號(hào) Yanmai679.71652BcγPBW34388.48652Caγ

-表示沒有檢測(cè)到相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。

- indicated no specific products were detected.

3 討 論

穗發(fā)芽的抗性是一個(gè)受多因素影響的復(fù)雜性狀，與種子自身因素和環(huán)境因素均有密切關(guān)系，種子在萌發(fā)時(shí)α-淀粉酶活力、ABA含量、GA含量等也與穗發(fā)芽和種子休眠特性密切相關(guān)[17]。基因水平上受微效多基因和主基因的共同作用，抗性機(jī)理十分復(fù)雜。

目前雖然已經(jīng)開發(fā)出很多與抗穗發(fā)芽或種子休眠相關(guān)的分子標(biāo)記，但能應(yīng)用到實(shí)際育種環(huán)節(jié)中的分子標(biāo)記很少，一方面因?yàn)槟承?biāo)記在篩選過程中應(yīng)用了特定遺傳背景的品種或品系，且大多數(shù)標(biāo)記是基于某個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)開發(fā)[6-7]，而穗發(fā)芽抗性受多基因控制，在其他遺傳背景品種中這些標(biāo)記的有效性有待進(jìn)一步驗(yàn)證；另一方面，許多標(biāo)記基于材料的非休眠特性開發(fā)[10]，如種皮顏色、穗部形態(tài)等，在其他背景的材料中對(duì)種子休眠特性或穗發(fā)芽抗性做有效驗(yàn)證的結(jié)果并不可靠。如本研究中采用的wmc104標(biāo)記，是通過感穗發(fā)芽的白皮小麥和抗穗發(fā)芽的紅皮小麥品種雜交所構(gòu)建的重組自交系中篩選出的，Roy等[10]認(rèn)為其與穗發(fā)芽抗性有顯著相關(guān)性。張兆萍等[18]對(duì)309份小麥品種進(jìn)行分析后表明，wmc104標(biāo)記與穗發(fā)芽抗性有相關(guān)性，可以用于穗發(fā)芽抗性篩選，但楊 燕等[19]認(rèn)為其與穗發(fā)芽抗性無(wú)關(guān)。本研結(jié)究中該標(biāo)記與穗發(fā)芽抗性沒有顯著相關(guān)性，可能由于標(biāo)記開發(fā)所用材料與驗(yàn)證材料遺傳背景差異較大，或者因?yàn)樗氚l(fā)芽抗性的表達(dá)是多基因間互作的結(jié)果，單一位點(diǎn)的分子標(biāo)記檢測(cè)無(wú)法解釋表型變異?？赏ㄟ^增加不同位點(diǎn)的其他分子標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，即綜合多位點(diǎn)分子標(biāo)記驗(yàn)證對(duì)品種穗發(fā)芽抗性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，需要做進(jìn)一步研究。

Xbarc170標(biāo)記經(jīng)驗(yàn)證與穗發(fā)芽抗性無(wú)關(guān)，可能因?yàn)殚_發(fā)標(biāo)記所用材料穗發(fā)芽抗性的表達(dá)是相應(yīng)的QTL與其他基因間互作的結(jié)果，不適合對(duì)基因型差異較大的其他品種進(jìn)行篩選。此外，各品種的田間生育期不完全一致，在蠟熟期取穗時(shí)所處生育期不能做到完全相同，對(duì)于種子休眠特性的影響需要做進(jìn)一步的研究。

Xgwm155標(biāo)記是由Kulwal等[12]發(fā)現(xiàn)的與1個(gè)抗穗發(fā)芽主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，并且在6個(gè)不同環(huán)境條件下得到有效性驗(yàn)證，但在本研究中其與穗發(fā)芽抗性相關(guān)性不顯著，其有效性還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

Yang等[9]開發(fā)的Vp-1B3標(biāo)記可以檢測(cè)出含有 Vp-1B基因等位變異的 Vp-1Ba、 Vp-1Bb、 Vp-1Bc三種基因型，其中 Vp-1Bb基因型對(duì)穗發(fā)芽有較高抗性。 Vp-1基因是調(diào)控種子成熟、休眠的重要基因[20]。三種基因型表現(xiàn)出不同的穗發(fā)芽抗性可能與Vp-1蛋白轉(zhuǎn)錄本的量有關(guān)。本研究的結(jié)果表明，Vp-1B3標(biāo)記的有效性得到驗(yàn)證，并篩選出煙農(nóng)23、蘭考181、陜農(nóng)33、西農(nóng)585、美105、美231、PBW550、DL788-2等8個(gè)品種，均為具有 Vp-1Bb基因型的高抗穗發(fā)芽品種，可作為穗發(fā)芽抗性育種中的重要種質(zhì)資源。

[1] 原亞萍,陳 孝,肖世和.小麥穗發(fā)芽的研究進(jìn)展[J].麥類作物學(xué)報(bào),2003,23(3):136.

YUAN Y P,CHEN X,XIAO S H.Advances in the study on wheat pre-harvest sprouting [J].JournalofTriticeaeCrops,2003,23(3):136.

[2]XIAO S H,ZHANG X Y,YAN C S,etal.Germplasm improvement for preharvest sprouting resistance in Chinese white-grained wheat:An overview of the current strategy [J].Euphytica,2002,126(1):35.

[3]KING R,RICHARDS R.Water uptake in relation to pre-harvest sprouting damage in wheat:ear characteristics [J].AustralianJournalofAgriculturalResearch,1984,35(3):327.

[4]DETJE H.Effects of varying nitrgen rates on pre-harvest sprouting and alpha-amylase activity in cereals [J].JournalofAgronomyandCropScience,1992,169:38.

[5]MARES D J,MRVA K.Mapping quantitative trait loci associated with variation in grain dormancy in Australian wheat [J].AustralianJournalofAgriculturalResearch,2001,52(12):1257.

[6]GROOS C,GAY G,PERRETANT M R,etal.Study of the relationship between pre-harvest sprouting and grain color by quantitative trait loci analysis in a white×red grain bread-wheat cross [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2002,104(1):39.

[7]FLINTHAM J,ADLAM R,BASSOI M,etal.Mapping genes for resistance to sprouting damage in wheat [J].Euphytica,2002,126(1):39.

[8]CHAO S,XU S S,ELIAS E M,etal.Identification of chromosome locations of genes affecting preharvest sprouting and seed dormancy using chromosome substitution lines in tetraploid wheat(TriticumturgidumL.) [J].CropScience,2010,50(4):1180.

[9]YANG Y,ZHAO X L,XIA L Q,etal.Development and validation of a Viviparous-1 STS marker for pre-harvest sprouting tolerance in Chinese wheats [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2007,115(7):971.

[10]ROY J K,PRASAD M,VARSHNEY R K,etal.Identification of a microsatellite on chromosomes 6B and a STS on 7D of bread wheat showing an association with preharvest sprouting tolerance [J].TheoreticalandAppliedGenetics,1999,99(1):336.

[11]MARES D,MRVA K,CHEONG J,etal.A QTL located on chromosome 4A associated with dormancy in white- and red-grained wheats of diverse origin [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2005,111(7):1357.

[12]KULWAL P L,KUMAR N,GAUR A,etal.Mapping of a major QTL for pre-harvest sprouting tolerance on chromosome 3A in bread wheat [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2005,111(6):1052.

[13] 王鳳寶,董立峰,付金鋒.小麥抗穗發(fā)芽酶反應(yīng)生化標(biāo)記選擇法[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2007,15(3):482.

WANG F B,DONG L F,FU J F.New selecting method of polyphenol oxidase pigmentation to improve wheat breeding process for pre-harvest sprouting resistance [J].JournalofAgriculturalBiotechnology,2007,15(3):482.

[14]MARES D.Temperature dependence of germinability of wheat(TriticumaestivumL.) grain in relation to pre-harvest sprouting [J].AustralianJournalofAgriculturalResearch,1984,35(2):115.

[15]SPRINGER N M.Isolation of plant DNA for PCR and genotyping using organic extraction and CTAB [J].ColdSpringHarborProtocols,2010,doi:10.1101/pdb.prot5515.

[16] 韓永亮,常金華.聚丙烯酰胺凝膠電泳的兩種染色方法對(duì)SSR標(biāo)記的影響[J].雜糧作物,2006,26(3):176.

HAN Y L,CHANG J H.Comparative analysis of two kinds of methods to detect SSRs on polyacrylamide gel electrophoresis systems [J].RainFedCrops,2006,26(3):176.

[17]DERERA N F,BHATT G M,MCMASTER G J.On the problem of pre-harvest sprouting of wheat [J].Euphytica,1977,26(2):299.

[18] 張兆萍,周麗敏,宋曉朋,等.小麥穗發(fā)芽抗性鑒定及相關(guān)分子標(biāo)記的有效性驗(yàn)證[J].麥類作物學(xué)報(bào),2015,35(3):300.

ZHANG Z P,ZHOU L M,SONG X P,etal.Identification of PHS tolerance in wheat varieties and validation of molecular markers associated with PHS tolerance [J].JournalofTriticeaeCrops,2015,35(3):300.

[19] 楊 燕,趙獻(xiàn)林,張 勇,等.四個(gè)小麥抗穗發(fā)芽分子抗性標(biāo)記有效性的驗(yàn)證與評(píng)價(jià)[J].作物學(xué)報(bào),2008,34(1):17.

YANG Y,ZHAO X L,ZHANG Y,etal.Evaluation and validation of four molecular markers associated with pre-harvest sprouting tolerance in Chinese wheats [J].ActaAgronomicaSinica,2008,34(1):17.

[20]GIRAUDAT J,HAUGE B M,VALON C,etal.Isolation of the Arabidopsis ABI3 gene by positional cloning [J].ThePlantCell,1992,4(10):1251.

[21]HIMI E,MAEKAWA M,MIURA H,etal.Development of PCR markers for Tamyb10 related to R-1,red grain color gene in wheat [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2011,122(8):1561.

Validation of Molecular Markers Associated with Pre-harvest Sprouting Tolerance in 73 Wheat Cultivars

BAI Yuhao1,2，CHEN Zhenzhen1，TAN Hongbin3,DIAO Huishan1，LIANG Bangping1，LI Jiachuang1，LIU Yang1，WU Jun1，ZHAO Jixin1，YANG Qunhui1，CHEN Xinhong1

(1.College of Agronomy,Northwest A&F University/Shaanxi Key Laboratory of Plant Genetic Engineering Breeding,Yangling,Shaanxi 712100,China; 2.Maize Research Institute,Shanxi Academy of Agricultrue Sciences,Xinzhou,Shanxi 034000,China;3.Shaanxi Seed Industry Group Co.,Ltd.,Yangling,Shaanxi 712100,China)

In order to select germplasms with pre-harvest sprouting (PHS) tolerance in wheat and validate the effectiveness of correlated markers,73 domestic and overseas wheat varieties including eight American varieties,14 Indian varieties and 51 Chinese varieties were evaluated by seed germination index (GI) and four molecular markers (Vp-1B3,wmc104,Xbarc170,Xgwm155) associated with PHS tolerance. The correlation between the PCR amplification results and GI among 73 varieties was analyzed by one-way ANOVA test and the result showed that significant difference in seed GI was found among these varieties mentioned above,with a range between 0.29% and 88.48%. Thirteen varieties have GI lower than 10%,which can be categorized as high resistant varieties. STS marker Vp-1B3 was significantly correlated with PHS tolerance. Other three markers were not related to PHS resistant in this study. Eight wheat varieties (Yannong 23,Lankao 181,Shannong 33,Xinong 585,Mei 105,Mei 231,PBW550 and DL788-2) have GI lower than 10% and were detected as high resistant varieties with Vp-1Bb gene by using PCR amplification method. The effectiveness of STS marker Vp-1B3 was validated and can be used to select PHS resistant varieties.

Wheat;Pre-harvest sprouting;Germination index (GI);Molecular marker

時(shí)間：2016-11-04

2016-05-08

2016-10-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31571650)；西北農(nóng)林科技大學(xué)唐仲英育種基金項(xiàng)目

E-mail:byh@nwsuaf.edu.cn

陳新宏(E-mail:cxh2089@126.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)11-1449-07

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