張鵬 吳蘭華 左曼 馬龍 王彥茹 蔣萍 林素蘭

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院；3.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

肝素鈉對氟尿嘧啶誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響探討

張鵬1吳蘭華2左曼1馬龍1王彥茹1蔣萍3林素蘭1

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院；3.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

目的 通過觀察不同濃度肝素鈉對氟尿嘧啶誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)損傷的影響，探討不同濃度肝素鈉稀釋液及不同作用時(shí)相點(diǎn)對氟尿嘧啶致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響及可能的作用機(jī)制。方法將體外培養(yǎng)的2～3代HUVECs隨機(jī)分為對照組、氟尿嘧啶組、肝素鈉組，其中對照組只用培養(yǎng)基培養(yǎng)；氟尿嘧啶組用終濃度為25 mg/L的氟尿嘧啶為刺激物；肝素鈉組分別以終濃度為12.5 U/mL、25 U/mL、50 U/mL肝素鈉稀釋液聯(lián)合終濃度為25 mg/L的氟尿嘧啶為刺激物。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測細(xì)胞白介素-6(IL-6)、白介素-1(IL-1)及組織纖維溶酶原激活物(t-PA)含量。結(jié)果氟尿嘧啶組IL-6、IL-1及t-PA蛋白表達(dá)較對照組升高(P<0.05)；與氟尿嘧啶組相比，肝素鈉組可抑制氟尿嘧啶誘導(dǎo)的HUVECs 釋放 IL-6、IL-1及t-PA(P<0.05)，以50U/ mL肝素鈉組作用最為顯著，但I(xiàn)L-6、IL-1及t-PA蛋白表達(dá)仍高于對照組(P<0.05)。不同濃度肝素鈉組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同一藥物濃度組，與藥物作用1 d后相比，第4天、第7天、第14天均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其中IL-6蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性升高。結(jié)論肝素鈉可抑制內(nèi)皮細(xì)胞釋放IL-1、IL-6及t-PA蛋白，對內(nèi)皮細(xì)胞具有一定保護(hù)作用。

肝素鈉； 氟尿嘧啶； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； 護(hù)理

經(jīng)外周靜脈置入中心靜脈導(dǎo)管(Peripherally inserted central catheter，PICC)是惡性腫瘤患者化療的理想輸液通路。然而，留置針刺激可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，且隨著留置時(shí)間延長，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)目逐漸增多，血管損傷加重，加之化療藥物刺激，更易導(dǎo)致靜脈炎。有文獻(xiàn)報(bào)道，留置時(shí)間、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、血管損傷三者呈正相關(guān)[1]。大量臨床研究[2]表明，正確選擇封管液是減少中心靜脈置管后血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血栓形成和靜脈炎發(fā)生的關(guān)鍵。肝素鈉稀釋液是臨床最常用的封管液，但是最佳肝素鈉稀釋液濃度及不同時(shí)相點(diǎn)對血管內(nèi)皮細(xì)胞化學(xué)性損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制尚不明確。本課題通過體外實(shí)驗(yàn)，探討不同濃度肝素鈉稀釋液及作用時(shí)相點(diǎn)對氟尿嘧啶致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響及可能的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、藥物及試劑 HUVECs細(xì)胞株購自江陰齊氏生物科技有限公司。胎牛血清購自美國Gibco公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗均購自美國Hyclone。IL-1、IL-6及t-PA蛋白測定試劑盒均購自USCN。6孔板、96孔板購自美國康寧公司。氟尿嘧啶購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司。肝素鈉購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 儀器 HF212UV二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo生物安全柜，Leica CTR6000倒置顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞用含10%胎牛血清、5%青霉素/鏈霉素溶液(雙抗溶液)的M199培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%～90%融合時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，2～3代用于實(shí)驗(yàn)。選擇對數(shù)期生長的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×105cells/mL,接種于96孔板中，每孔200 μL,每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞生長至80%融合后，貼壁細(xì)胞隨機(jī)分為3組，倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并攝片。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

1.2.2.1 對照組 每孔加入200 μL的培養(yǎng)基。

1.2.2.2 氟尿嘧啶組 每孔加入200 μL氟尿嘧啶濃度為25 mg/L的培養(yǎng)基。

1.2.2.3 肝素鈉組 以肝素鈉與氟尿嘧啶共同孵育。(1)低濃度組：每孔加入200 μL肝素鈉濃度為12.5 U/mL，氟尿嘧啶濃度為25 mg/L的培養(yǎng)基。(2)中濃度組：每孔加入200 μL肝素鈉濃度為25 U/mL，氟尿嘧啶濃度為25 mg/L的培養(yǎng)基。(3)高濃度組：每孔加入200 μL肝素鈉濃度為50 U/mL，氟尿嘧啶濃度為25 mg/L的培養(yǎng)基。每組均孵育14 d，每隔24 h更換新鮮培養(yǎng)液，分別于第1天、第4天、第7天、第14天鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變并拍照，收集每個(gè)孔孵育了24 h的培養(yǎng)液，-80 ℃保存。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法 分別將IL-1、IL-6及t-PA標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確復(fù)溶，用稀釋液做1.25次倍比稀釋，IL-1標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為120 ng/L、80 ng/L、40 ng/L、20 ng/L、10 ng/L，IL-6標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為6 ng/L、4 ng/L、2 ng/L、1 ng/L、0.5 ng/L，t-PA標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為12 ng/L、8 ng/L、4 ng/L、2、1 ng/L。實(shí)驗(yàn)其余步驟嚴(yán)格按IL-1、IL-6及t-PA蛋白測定試劑盒說明書操作。以450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的濃度。

2 結(jié)果

2.1 HUVECs形態(tài)觀察 (1)對照組：倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈不規(guī)則形，細(xì)胞單層融合時(shí)呈典型的“鋪路石”樣外觀，隨著培養(yǎng)時(shí)間增長，細(xì)胞數(shù)目成“S”形曲線生長。(2)氟尿嘧啶組：細(xì)胞培養(yǎng)初期可觀察到細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞培養(yǎng)至第10天時(shí)，倒置顯微鏡下可見多數(shù)細(xì)胞死亡，培養(yǎng)至第14天時(shí)，細(xì)胞全部死亡。(3)肝素鈉組：細(xì)胞數(shù)目增長較慢，細(xì)胞不出現(xiàn)融合，50 U/mL肝素鈉加25 mg/L氟尿嘧啶組細(xì)胞生長相對較好，與其他濃度組相比，細(xì)胞數(shù)目較多且細(xì)胞形態(tài)相對完整。

2.2 不同濃度肝素鈉對氟尿嘧啶誘導(dǎo)HUVECs分泌IL-1、t-PA及IL-6的影響 對照組HUVECs釋放少量IL-1、IL-6及t-PA，氟尿嘧啶25 mg/L刺激后，其IL-1、IL-6及t-PA蛋白表達(dá)明顯增加，經(jīng)不同濃度肝素鈉干預(yù)后，其上清液IL-1、IL-6及t-PA蛋白含量下降，以高濃度肝素鈉組(50 U/mL肝素鈉稀釋液加25 mg/L氟尿嘧啶)作用為著，但仍高于對照組。五組間IL-1含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=41.055，P<0.01);五組間t-PA含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=64.516，P<0.01);五組間IL-6含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.091，P<0.01)。見表1。

表1 不同組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)IL-1、IL-6及t-PA的含量比較 (ng/L)

注：與對照組相比，*P<0.05;與氟尿嘧啶組相比，#P<0.05。

3.3 肝素鈉在不同時(shí)相點(diǎn)對HUVECs釋放IL-1、IL-6及t-PA蛋白的影響 以50 U/mL肝素鈉稀釋液與25 mg/L氟尿嘧啶共同孵育14 d，分別于第1天、第4天、第7天、第14天取24 h培養(yǎng)液，可見隨著時(shí)間的延長，上清液的IL-1、IL-6及t-PA增高， 14 d達(dá)到高峰，且在4、7、14 d各時(shí)相點(diǎn)均高于對照組，IL-1、t-PA在第7天與第4天無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),第14天與第7天有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);IL-6四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=142.518，P<0.05)。見表2～4。

ng/L

注：與1 d相比，*P<0.01；與4 d相比，#P<0.01；與7 d相比，△P<0.01。

ng/L

注：與1 d相比，*P<0.01；與4 d相比，#P<0.01；與7 d相比，△P<0.01。

ng/L

注：與1 d相比，*P<0.01；與4 d相比，#P<0.01；與7 d相比，△P<0.01。

3 討論

PICC已經(jīng)成為腫瘤患者治療的重要用藥通路。然而PICC置管后可導(dǎo)致導(dǎo)管脫出、導(dǎo)管阻塞、血管壁機(jī)械性損傷，加之化療藥物的應(yīng)用，可使血管上皮細(xì)胞壞死[3]，更易導(dǎo)致靜脈炎。一項(xiàng)臨床的隨機(jī)整群對照研究結(jié)果顯示：使用3 mL的100 U/mL的肝素溶液沖管比生理鹽水沖洗外周靜脈套管更有效，原因在于它減少了外周靜脈置管后發(fā)生靜脈炎、堵管、更換置管位置的次數(shù)[4]。但是，也有學(xué)者認(rèn)為，低分子肝素具有保護(hù)血管內(nèi)皮的作用，從而在某種程度上可以減輕高凝狀態(tài)及炎癥播散[5]。目前大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明肝素也具有抗炎活性[6]。多項(xiàng)研究表明[7]，肝素抑制促炎因子的釋放,包括IL-1β、IL-6、TNF-α、抑制缺血再灌注損傷中NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),并通過增加一氧化氮和前列環(huán)素的生成減少了內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。本次研究通過檢測促炎因子IL-6、IL-1及t-PA的含量，探討不同濃度肝素鈉稀釋液及作用時(shí)相點(diǎn)對氟尿嘧啶致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響。

本研究結(jié)果表明：以不同濃度肝素鈉干預(yù)氟尿嘧啶作用后的HUVECs，各濃度肝素鈉組IL-1、IL-6及t-PA蛋白表達(dá)與氟尿嘧啶組比較有顯著差異；不同濃度肝素鈉組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中濃度為50 U/mL為主，說明不同濃度肝素鈉對氟尿嘧啶誘導(dǎo)HUVECs損傷均具有保護(hù)作用，但不同濃度對其影響甚微。同時(shí)也印證了夏瑾[8]不同劑量肝素鈉無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且對無肝素鈉使用禁忌的患者用50 U/mL肝素鈉封管效果最好的觀點(diǎn)。同一藥物濃度組，與藥物作用1 d后相比，第4天、第7天、第14天均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中IL-6蛋白表達(dá)在一定范圍內(nèi)呈時(shí)間依賴性升高，在第14天時(shí)，肝素鈉組IL-6、IL-1及t-PA的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于氟尿嘧啶組，提示肝素鈉在第14天時(shí)仍具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，相對延長置管時(shí)間。但由于體外實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞存活時(shí)間有限，研究至14 d后細(xì)胞幾乎全部死亡，后期將通過在體實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究。

綜上所述，肝素鈉對氟尿嘧啶誘導(dǎo)HUVECs損傷具有一定保護(hù)作用，其機(jī)制可能是肝素鈉抑制氟尿嘧啶誘導(dǎo)HUVECs分泌IL-1、IL-6等炎性因子。在離體實(shí)驗(yàn)中，不同濃度肝素鈉均有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，以50 U/mL肝素鈉為著，其相對延長了置管時(shí)間。本研究結(jié)果為臨床上肝素鈉封管液濃度的選擇及封管時(shí)間提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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The influence of heparin sodium for fluorouracil-based induction of human umbilical vein endothelial cells damage

Zhang Peng1, Wu Lanhua2, Zuo Man1,Ma long，Wang Yanru1, Jiang Ping3, Lin Sulan1

(1.CollegeofNursingofXinjiangMedicalUniversity; 2.TheFirstClinicalMedicalCollegeofXinjiangMedicalUniversity;3.SchoolofBasicMedicalSciencesofXinjiangMedicalUniversity,UrumqiXinjiang830000 )

Objective To detect the mechanism on the effects of different level of heparin sodium on fluorouracil induced expression of interleukin 6 (IL-6) and interleukin 1 (IL-1), tissue fiber dissolving enzyme activators (t-PA), in induction of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).Methods Cultured HUVECs at passage 3 to 6 was randomly divided into control group, fluorouracil group and heparin sodium group, with a final concentration of fluorouracil group is 25 mg/L of fluorouracil for stimulus, heparin sodium group on final concentration of 12.5, 25, 50 μ/ml sodium heparin dilution and the final concentration of 25 mg/L of fluorouracil for stimulus. The protein level of IL-6, IL-1 and t-PA in the cultured medium were measured by enzyme-linked immunosorbent (ELISA).Results Compared to control group, the expression of IL-6, IL-1, t-PA protein increased in fluorouracil group (allP<0.05). Compared to fluorouracil group，heparin can inhibit HUVECs induced by fluorouracil release IL-6, IL-1 and t-PA (P<0.05), with 50 u/ml role for the heparin group, but IL-6, IL-1 and t-PA protein expression is still higher than that of the control group (P<0.05). There was no statistical difference between different concentrations of sodium heparin group (P>0.05). The same drug concentration group, compared with the drug effect after 1 days, 4 days, 7 days, 14 days are statistically significant difference (P<0.05). IL-6 protein expression in time dependence.Conclusion Heparin group inhibits endothelial cells release, IL-6 and IL-1 t-PA protein, possesses certain protective effects on endothelial cells.

Heparin sodium; Fluorouracil; HUVECs； Nursing

2014年新疆維吾爾族自治區(qū)級大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(編號：CX2014032)

張鵬(1993-)，女，河北，本科，研究方向：腫瘤護(hù)理

林素蘭，E-mail：linsulan@163.com

R471

A

10.16821/j.cnki.hsjx.2016.03.005

2015-09-31)