習(xí)彥花， 崔冠慧， 張麗萍， 李 欣， 張根偉， 程輝彩

(河北省科學(xué)院 生物研究所，河北 石家莊 050081)

耐低溫淀粉酶產(chǎn)生菌Y89微波誘變及發(fā)酵工藝

習(xí)彥花， 崔冠慧， 張麗萍， 李 欣， 張根偉， 程輝彩*

(河北省科學(xué)院 生物研究所，河北 石家莊 050081)

為進一步提高耐低溫淀粉酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵生產(chǎn)水平，以前期篩選得到的1株耐低溫兼性厭氧淀粉酶產(chǎn)生菌Y89為出發(fā)菌株，對其進行微波誘變處理，通過酶產(chǎn)量及遺傳性能穩(wěn)定檢測篩選高活力突變株，并采取單因素優(yōu)化法對菌株的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。獲得1株遺傳穩(wěn)定的高活力突變株Y89-11，淀粉酶產(chǎn)量達750.2 U/mL，是原出發(fā)菌株的1.94倍。采用單因素實驗確定該突變株的最佳發(fā)酵條件：最適生長及產(chǎn)酶溫度為16 ℃，最佳產(chǎn)酶時間60 h，最優(yōu)碳源為可溶性淀粉，氮源為酵母膏，培養(yǎng)基中添加Ca2+可顯著提高產(chǎn)酶量。經(jīng)誘變選育出的突變株Y89-11與原菌株相比產(chǎn)酶量提高了94%，所產(chǎn)淀粉酶為中低溫酶，最適反應(yīng)溫度30 ℃，耐低溫效果較好，應(yīng)用前景廣闊。

耐低溫；淀粉酶；微波誘變；多粘類芽胞桿菌；發(fā)酵工藝

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的統(tǒng)稱，用途廣、產(chǎn)量大，目前生產(chǎn)的淀粉酶商品大多為中高溫淀粉酶。隨著研究的深入和生產(chǎn)需求的提高，能夠在低溫、高鹽等逆境下仍保持較高活力的酶產(chǎn)品近年來受到越來越廣泛的關(guān)注。低溫淀粉酶由于具有反應(yīng)溫度低、對熱敏感等特點，有著中、高溫淀粉酶無法取代的優(yōu)越性，尤其是在洗滌產(chǎn)品、食品制造和環(huán)境工程等領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價值巨大。國內(nèi)外學(xué)者對產(chǎn)低溫淀粉酶微生物的篩選和研究報道也越來越多[1-3]。張剛等[4]、王曉紅等[5]分別從黃海海域、福建沿海及新疆高海拔地區(qū)分離出產(chǎn)低溫淀粉酶的微生物，并對其進行了研究?，F(xiàn)階段所篩選得到產(chǎn)耐低溫淀粉酶的菌株主要為芽胞桿菌和曲霉，最適溫度30～60 ℃，但初始酶活力均不高，很難滿足實際生產(chǎn)的需要[6-8]。因此，通過誘變選育、基因改造等手段進一步提高相關(guān)菌株發(fā)酵生產(chǎn)具有耐受低溫、高鹽等特性淀粉酶的能力成為淀粉酶的研究熱點[9-12]。本研究以前期篩選得到的1株耐低溫兼性厭氧淀粉酶產(chǎn)生菌Y89為出發(fā)菌株，采用微波法進行誘變處理，獲得穩(wěn)定性良好的高活力突變株Y89-11，并對其產(chǎn)酶條件進行考察和優(yōu)化，進一步提高其產(chǎn)酶能力，為使其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 多粘類芽胞桿菌(Paenibacilluspolymyxa)Y89，由實驗室自行分離并保存，耐低溫兼性厭氧菌，淀粉酶初始酶活為386.13 U/mL。

1.1.2 培養(yǎng)基 曲麗苯藍篩選培養(yǎng)基：氯化鈉5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，可溶性淀粉10 g，曲麗苯藍適量，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2；半固體種子培養(yǎng)基：氯化鈉5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，蒸餾水定容至1 000 mL，瓊脂粉6 g，pH 7.2～7.4；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：氯化鈉5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，可溶性淀粉10 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2；水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂粉12 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 自然。

1.2 方法

1.2.1 誘變育種 ① 菌懸液的制備：取5 mL對數(shù)生長期的Y89菌株發(fā)酵液于10 mL離心管中，3 000 r/min離心10 min，棄上清液。加入無菌水9 mL，振蕩洗滌，離心10 min，棄上清液。加入無菌水調(diào)節(jié)菌液濃度約1.0×107個/mL，振蕩均勻。② 微波誘變：取1 mL對數(shù)生長期菌懸液用乙酸緩沖液(pH 7.0～7.5)稀釋至10-3；分別在微波中(800 W，2 450 MHz)處理5、10、15、20、25 s；菌懸液適當(dāng)稀釋后，置于16 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)雙層培養(yǎng)，計算致死率分別為50%、60%、70%、80%、90%時的誘變時間。③ 突變菌株篩選：取0.5 mL菌液涂布平板，倒曲麗苯藍篩選培養(yǎng)基，上層倒水瓊脂培養(yǎng)基，16 ℃培養(yǎng)。挑起透明圈直徑和菌落直徑比大于對照的進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，通過酶活測定進行復(fù)篩。④ 遺傳穩(wěn)定性測定：選取的菌株連續(xù)傳代8次，將每代菌株進行發(fā)酵，測酶活。

1.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化 測定突變菌株Y89-11的生長曲線，分別采用單因素試驗方法考察菌株生長時間、生長溫度、碳氮源、鹽濃度、初始pH、微量金屬離子等發(fā)酵參數(shù)對產(chǎn)酶的影響，初步研究酶液最適反應(yīng)溫度、熱穩(wěn)定性等性質(zhì)。

1.2.3 淀粉酶酶活力測定方法 反應(yīng)時間為30 min，以1 mL酶液每分鐘分解可溶性淀粉所生成的麥芽糖的量表示一個酶活單位，用“U/mL”表示。酶活力計算公式：

淀粉酶活力=

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變選育結(jié)果

2.1.1 微波誘變 由圖1可知隨著誘變時間延長致死率增大，到25 s時致死率達到100%，不同微波誘變時間對菌株Y89的誘變效果不同，誘變時間在15 s時致死率為75.1%，正突變率較高，所以選取15 s作為微波誘變的最佳時間。

圖1 微波對菌株Y89的誘變效應(yīng)Fig.1 Mutagenic effect of microwave on strain Y89

2.1.2 高活力突變株選育 從添加有曲麗苯藍的平板上，選出透明圈直徑與菌落直徑之比相差較大的菌株，每輪挑選10～15個效果好的突變株進行復(fù)篩，通過連續(xù)6輪微波誘變，得到誘變株Y89-11，菌株酶活由初始的(386.1±3.2) U/mL提高到(750.2±5.8) U/mL，結(jié)果見表1。

表1 各突變株的透明圈與菌落直徑之比Table 1 The ratio of the diameter of the transparent circle and colony diameter of the mutant strain

注：“-”代表對照(初始酶活未增加)

2.1.3 突變株遺傳穩(wěn)定性 連續(xù)傳代8次，將8代同時活化后接種到半固體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～36 h，再接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵液的酶活，結(jié)果表明突變株Y89-11產(chǎn)酶活力沒有顯著變化，P>0.05，可見該突變株遺傳性能穩(wěn)定。

表2 Y89突變株各代系的產(chǎn)酶活力Table 2 The activity of the Y89 mutant strains of the generation system

2.2 突變株發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 生長曲線的測定 突變株Y89-11生長曲線的測定結(jié)果見圖2。12 h前該菌株處于延緩期，12～48 h處于對數(shù)生長期，48～108 h處于穩(wěn)定期，108 h后OD值下降，處于衰落期。

圖2 突變株Y89-11生長曲線圖Fig.2 Growth curve of Mutant Y89-11

2.2.2 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響 在其他條件不變的情況下，根據(jù)生長曲線選取不同培養(yǎng)時間的發(fā)酵液進行酶活力測定，結(jié)果見圖3。菌株Y89-11接種后隨培養(yǎng)時間延長酶活力逐漸升高，在穩(wěn)定中期60 h時淀粉酶活性達到最高738.2 U/mL。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，酶活力顯著下降，這可能是在發(fā)酵后期由于發(fā)酵液中可利用的營養(yǎng)物質(zhì)減少、產(chǎn)物及有害代謝物的形成不利于產(chǎn)酶所造成的，因此選擇60 h為產(chǎn)酶最佳發(fā)酵時間。

圖3 發(fā)酵時間對突變株Y89-11產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the amylase production of Y89-11

2.2.3 生長溫度對產(chǎn)酶的影響 將突變株Y89-11分別置于10、16、25、30、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 h，測定其酶活，結(jié)果見圖4。Y89-11培養(yǎng)溫度為16 ℃時酶活最高達到803.85 U/mL，25、30 ℃培養(yǎng)時無顯著性差異，相對酶活分別為85.17%、84.12%，37 ℃培養(yǎng)相對酶活較低，為34.38%。說明該菌適宜在偏低溫條件下產(chǎn)酶。

圖4 生長溫度對突變株Y89-11產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of growth temperature on the amylase production of Y89-11

2.2.4 碳源的選擇 考慮到發(fā)酵成本問題，選用幾種常見碳源進行優(yōu)化，將液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的可溶性淀粉分別用10 g的糊精、葡萄糖、麥芽糖、玉米粉、蔗糖、乳糖替代，16 ℃靜置培養(yǎng)，采用DNS法測定酶活，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示突變株Y89-11的碳源為可溶性淀粉時產(chǎn)生的酶活最高，達706.96 U/mL；其次為乳糖、玉米粉；麥芽糖最低，相對酶活僅為14.27%。淀粉酶作為一種外分泌型的胞外酶，其產(chǎn)生可能也需要一定的誘導(dǎo)作用，雖然其他幾種糖容易被微生物利用，有利于微生物的生長，但對于產(chǎn)生淀粉酶卻不是最佳碳源。

表3 碳源對突變株Y89-11產(chǎn)酶的影響Table 3 Effect of fermentation time on the amylase production of Y89-11

2.2.5 氮源的選擇 為考察有機氮源和無機氮源對菌株產(chǎn)酶的影響，分別選取蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、硫酸銨、氯化銨作為氮源，碳源為2%的可溶性淀粉，其他條件相同，16 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 h，采用DNS法測定酶活，結(jié)果見表4。有機氮源比無機氮源更有利于菌株產(chǎn)酶，其中酵母膏為最優(yōu)氮源，突變株Y89-11酶活最高可達723.62 U/mL；其次為牛肉膏、豆餅粉；硫酸銨和氯化銨為氮源時，相對酶活僅為16.87%、23.42%。

表4 氮源對突變株Y89-11產(chǎn)酶的影響Table 4 Effect of fermentation time on the amylase production of Y89-11

2.2.6 最適NaCl濃度 將液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的NaCl質(zhì)量分數(shù)范圍分別調(diào)至0～10%，測定酶活結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，突變株Y89-11在設(shè)定NaCl質(zhì)量分數(shù)范圍均能生長。當(dāng)NaCl質(zhì)量分數(shù)為2%時，酶活達到最高為658.43 U/mL，其次分別為4%、5%。

2.2.7 最適培養(yǎng)初始pH 結(jié)果見圖6，突變株Y89-11在pH為5.0～9.5的范圍內(nèi)均生長，在pH范圍6.5～7.5之間酶活較高。pH為7.0時酶活達到最高，其次為7.5、6.5，相對酶活分別為95.15%、85.84%。

2.2.8 金屬離子對突變株Y89-11產(chǎn)酶的影響 在培養(yǎng)基中分別添加1 mmol/L的Mg2+、Al3+、Ca2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、K+，測定發(fā)酵液酶活，結(jié)果見圖7。Fe2+、Mn2+、Zn2+、K+對菌株突變株Y89-11無顯著影響，Mg2+、Al3+抑制淀粉酶的產(chǎn)生，其中Al3+的抑制作用最明顯(相對酶活為18.4%)，Ca2+起促進作用(相對酶活為117.47%)。

圖5 NaCl對突變株Y89-11產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of salt concentration on the amylase production of Y89-11

圖6 初始pH對突變株Y89-11產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of initial pH on the amylase production of Y89-11

圖7 金屬離子對突變株Y89-11酶活的影響Fig.7 Effect of metal ion on the amylase production of Y89-11

2.3 酶學(xué)性質(zhì)的初步研究

2.3.1 酶反應(yīng)最適溫度 粗酶液稀釋一定倍數(shù)，與底物在不同溫度下進行反應(yīng)，溫度梯度設(shè)置為10、20、30、40、50、60、70、80 ℃，在這些條件下測定酶活，測得淀粉酶活性最大值為100%。圖8表明該酶反應(yīng)的最適溫度為30 ℃，20～50 ℃間相對酶活80%以上，屬于中低溫酶。

2.3.2 酶的熱穩(wěn)定性 將酶液分別置于10、20、30、40、50、60、70、80 ℃水浴鍋保溫預(yù)處理60 min，30 ℃測其剩余酶活，以不保溫酶液為對照，對照相對酶活值為100%，結(jié)果見圖9。突變株Y89-11酶液20 ℃保溫預(yù)處理60 min，酶活性基本沒有損失，30 ℃保溫預(yù)處理60 min，對酶活性有一定刺激作用，相對酶活達137.5%。20～40 ℃間能保持90%以上的酶活，50 ℃保溫預(yù)處理60 min相對酶活62.3%，溫度大于60℃酶活下降為零，說明該酶為中低溫酶，耐低溫效果較好。

圖8 反應(yīng)溫度對酶活性的影響Fig.8 Effect of reaction temperature on enzyme activity

圖9 突變株Y89-11產(chǎn)酶熱穩(wěn)定性Fig.9 Thermal stabilization of the amylase produced by Y89-11

3 討 論

微波誘變是微生物育種中較為常用的方法，本研究首次對篩選的野生型耐低溫淀粉酶產(chǎn)生菌多粘類芽胞桿菌Y89進行微波誘變處理，篩選得到高活力突變株Y89-11，淀粉酶產(chǎn)量達750.2 U/mL，酶活是出發(fā)菌株的1.94倍。通過對突變株Y89-11最佳發(fā)酵條件和酶學(xué)特性的初步研究，結(jié)果表明該菌株是一株耐低溫產(chǎn)淀粉酶菌株，生長pH范圍較寬，所產(chǎn)淀粉酶為中低溫酶。

本研究建立了耐低溫淀粉酶產(chǎn)生菌種微波誘變選育的系統(tǒng)方法，經(jīng)過培養(yǎng)基配方優(yōu)化篩選及發(fā)酵工藝參數(shù)控制，確立了該突變株生產(chǎn)低溫淀粉酶的最佳工藝條件。該菌株發(fā)酵生產(chǎn)出的低溫淀粉酶具有較好的低溫活性、酶活高。這些特性決定了該菌株可應(yīng)用于紡織、食品、洗滌劑、環(huán)境工程等領(lǐng)域，在開發(fā)適用于工業(yè)生產(chǎn)的新型酶制劑，甚至在不同pH值的污水處理中也可發(fā)揮相應(yīng)作用，在減少對環(huán)境的污染，保護人類生態(tài)環(huán)境安全等方面有較大的應(yīng)用價值[13-15]。此外本研究主要進行了耐低溫淀粉酶單純的微波誘變及選育工作，后續(xù)將結(jié)合紫外線、激光、等離子等方法進行復(fù)合誘變。另外，該突變株的遺傳穩(wěn)定性還需在今后的實際生產(chǎn)應(yīng)用過程中做進一步探討和研究。

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Microwave Mutagenesis and Fermentation Technology of Cryo-Resisting Amylase Producing Stain Y89

XI Yan-hua, CUI Guan-hui, ZHANG Li-ping, LI Xin, ZHANG Gen-wei, CHENG Hui-cai

(Biol.Inst.,HebeiAcad.ofSci.,Shijiazhuang050081)

In order to improve the fermentation and production level further of cryo-resisting amylase producing strain, to provide premium strain seed germplasm resources for the production of cryophilic amylase, a previously screened cryophilic anaerobic amylase producing strain Y89 was taken as starting strain, and waged microwave mutagenetic treatment. And the highly active mutant strain with high amylase output and performance genetically stable was screened through test and determination, and the medium and culture conditions were optimized adopting single factor optimization. The results showed that a genetically stable and highly active mutant strain Y89-11 was obtained, the amylase output was as high as 750.2 U/mL. 1.94 times of the starting strain. The optimal fermentation conditions for the strain was optimized adopting single factor experiment, the most suitable temperature for growth was at 16 ℃, the best enzyme producing time was 60 h, the best carbon source was soluble starch, nitrogen source was yeast extract, the addition of Ca2+could significantly increase the output of the enzyme. Therefore, as compared with the original strain, the mutant strain Y89-11 bred by mutagenesis the amylase production increased by 94%, and the amylase it produced was a medium-low temperature enzyme with optimal reaction temperature at 30 ℃, the resistant effect to low temperature is good, and the application prospect is wide.

cryo-resistant； amylase； microwave mutation；Paenibacilluspolymyxa； fermentation technology

河北省科技支撐項目(14222901D，14273801D)；河北省財政預(yù)算項目(15302)

習(xí)彥花 女，助理研究員，碩士。主要從事應(yīng)用微生物方面的研究。Tel：0311-83014879，E-mail：xiyanhua86@163.com

* 通訊作者。女，副研究員，博士。主要從事生物質(zhì)能源方面的研究。Tel：0311-83014879，E-mail：huicaicheng@163.com

2015-12-02；

2016-01-16

Q556+.2

A

1005-7021(2016)05-0021-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.004