曹宇彤，任皓威，劉寧

（1.國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱150028；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析人乳中的3種雌激素

曹宇彤1,2，任皓威1,2，劉寧1,2

（1.國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱150028；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)的方法對(duì)我國(guó)人乳中雌激素含量進(jìn)行分析測(cè)定。樣品經(jīng)酶解，提取，固相萃取柱凈化和濃縮后，采用Waters UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)分離，以MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式檢測(cè)，外標(biāo)法定量分析。在0.5～20 ng/mL范圍內(nèi)，校準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好的線性，相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.99。結(jié)果表明，該方法具有良好靈敏度、準(zhǔn)確度。該方法已成功應(yīng)用于人乳中3種雌激素的定性和定量分析。

人乳；雌激素；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；固相萃取

0 引言

人乳是嬰兒的安全、天然營(yíng)養(yǎng)食品，在提供營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、健全神經(jīng)系統(tǒng)、增強(qiáng)免疫力等方面起重要作用[1-5]。人乳中含有雌激素，主要包括雌二醇（estradiol，E2）、雌三醇（estriol，E3）和雌酮（Estrone，E1）等。這些激素對(duì)嬰兒的代謝平衡、生長(zhǎng)發(fā)育、性別的開發(fā)和促進(jìn)等起重要的調(diào)節(jié)作用[6-9]。由于它們?cè)诘蜐舛认聦?duì)生物也有很強(qiáng)的生物活性[10]，低濃度的激素?cái)z入是否會(huì)對(duì)嬰兒健康造成影響已備受人們關(guān)注。中國(guó)約有一半以上的嬰兒家庭采取嬰兒配方奶粉喂養(yǎng)的方式對(duì)嬰兒喂養(yǎng)。因此，使嬰兒配方奶粉更加接近母乳成分尤為重要。本研究建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測(cè)定中國(guó)人乳中雌激素的方法，通過(guò)對(duì)人乳中雌激素分析，為雌激素在嬰兒配方奶粉中的安全殘留量的檢測(cè)提供可靠的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1材料與儀器

人乳樣品采自年齡在23～35歲（平均孕期為40周）的中國(guó)漢族乳母。乳母身體指標(biāo)正常，無(wú)妊娠高血壓、糖尿病及其他影響脂質(zhì)代謝的疾病。初乳（1～ 5 d）樣品10個(gè)，過(guò)渡乳（6～21 d）樣品13個(gè)，成熟乳（21 d以后）樣品16個(gè)，每個(gè)階段分別采集50 mL供實(shí)驗(yàn)用。標(biāo)準(zhǔn)品為雌酮、雌二醇、雌三醇，β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶。甲醇、乙腈均為色譜純，正己烷、乙酸乙酯和丙酮均為分析純。超高效液相色譜儀，QTRAP?6500質(zhì)譜儀。MTN-2800D氮吹儀，純水發(fā)生器，AL204精密電子天平，ZHWY-100B臺(tái)式振蕩器，PK-98-1型電子恒溫水浴鍋，超速離心機(jī)。

1.2方法

1.2.1 人乳的采集

對(duì)哈爾濱地區(qū)不同泌乳階段的健康女性隨機(jī)采集，使用自動(dòng)采乳器采集不同泌乳期的中國(guó)人乳各50 mL左右，將獲得的人乳收集到無(wú)菌奶瓶中，蓋上瓶蓋，搖勻。把乳樣分裝到5個(gè)10 mL的無(wú)菌離心管中，粘貼上統(tǒng)一的標(biāo)簽（包括乳母姓名、采集時(shí)間和樣品量），放到離心管泡沫架上，置于-20℃冰箱中，待采集完畢后，將乳樣統(tǒng)一存放至-80℃冰箱中，待分析。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取3種雌激素的標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備溶液，于-20℃貯存，用時(shí)稀釋。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液中的每一種都用甲醇分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。在實(shí)驗(yàn)色譜條件下，分別取2 μL進(jìn)樣，測(cè)定保留時(shí)間和峰面積，以測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)品峰面積對(duì)質(zhì)量濃度（μg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 人乳中雌激素的提取

向樣品中加入40 μL的β-葡萄糖醛酸甙酶渦旋混合于37℃振蕩酶解12 h。取出后冷卻至室溫，加入10 mL乙腈，渦旋2 min，室溫下超聲提取15 min，于4℃，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min下離心10 min，有機(jī)相轉(zhuǎn)入玻璃管中，殘?jiān)?0 mL乙腈重復(fù)提取1次，合并有機(jī)相于玻璃管中。有機(jī)相于40℃氮?dú)獯抵两?，? mL體積分?jǐn)?shù)為30%甲醇水溶液溶解，將此溶液過(guò)HLB柱（柱子先用5 mL甲醇和5 mL水依次活化），用5 mL體積分?jǐn)?shù)為30%甲醇水溶液淋洗，真空抽干，然后用5 mL甲醇洗脫柱子，洗脫液在40℃氮?dú)獯抵两?，用甲醇溶液溶解濃縮物并定容至1.0 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待檢測(cè)。

1.2.4 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Acquity UPLC XDB C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；負(fù)離子模式下流動(dòng)相為乙腈溶液，梯度洗脫，0 min，20%乙腈；0～1 min，20%～50%乙腈；1～5 min，50%乙腈；流速為0.5 mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為2 μL。

質(zhì)譜檢測(cè)在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（multiple reaction monitoring，MRM）下完成。雌激素在負(fù)離子（ESI-）模式下檢測(cè)。ESI-界面操作條件為：碰撞氣壓（colli?sion gas，CAD）0.04 MPa；氣簾氣壓（curtain gas，CUR）0.24 MPa；霧化氣壓（ion source gas 1，GS 1）0.27 MPa；去溶劑氣壓（ion source gas 2，GS 2）0.48 MPa；離子噴霧電壓（ion spray voltage，IS）-4500 V；離子源溫度（ion source temperature，TEM）500℃。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

分析結(jié)果采用AB質(zhì)譜analyst工作站軟件所采集提供的數(shù)據(jù)。采用Excel電子表格軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用平均值表示并用采用t檢驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行比較。使用Sigma Plot 11.0軟件進(jìn)行作圖。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均做平行實(shí)驗(yàn)，以求得準(zhǔn)確性好、穩(wěn)定性高的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1人乳雌激素前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 雌激素的酶解

人乳中游離態(tài)的雌酮（E1）僅占雌酮總量的4.35%，其主要的雌激素代謝產(chǎn)物表現(xiàn)形式為葡萄糖醛酸結(jié)合物（estrone glucosiduronaes，E1G），占雌酮總量的33%～55%，其余以硫酸酯形式存在；人乳中游離態(tài)的雌二醇（E2）占總量的20%左右，以葡糖酸苷酯和硫酸酯形式存在的雌二醇各占總量的40%；人乳中游離態(tài)的雌三醇（E3）僅占總量的3.1%左右，以葡糖酸苷酯和硫酸酯形式存在的分別占近50%和47%?？傊?，在人乳中結(jié)合態(tài)雌激素占總量90%以上，而人初乳中非結(jié)合態(tài)雌激素僅占總量的4.8%左右[11]。人乳內(nèi)的結(jié)合態(tài)的雌激素可能直接來(lái)源于血液或者是乳腺細(xì)胞內(nèi)甾醇前體的代謝產(chǎn)物。人乳中的雌激素主要以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式存在，僅檢測(cè)游離部分不能得到3種雌激素的總體含量，因此需要對(duì)雌激素進(jìn)行酶解，而檢測(cè)雌激素總量時(shí)則需要用β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶水解樣品后再進(jìn)行測(cè)定。本研究在樣本預(yù)處理中，先用β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶水解釋放雌激素，再進(jìn)行固相萃取。

2.1.2 提取溶劑的優(yōu)化

選擇合適的提取試劑和提取方法，對(duì)雌激素回收效率至關(guān)重要。本研究采取有機(jī)溶劑提取，結(jié)合振蕩和超聲方式以促進(jìn)分析物進(jìn)入有機(jī)溶劑中。人乳樣品中蛋白質(zhì)和脂肪是主要成分，同時(shí)也是干擾物的主要來(lái)源，因此樣品中蛋白質(zhì)和脂肪的去除以及待測(cè)組分的提取是樣品前處理過(guò)程的關(guān)鍵。雌激素在非極性溶劑中溶解度低，提取試劑的極性應(yīng)與分析物的極性匹配。實(shí)驗(yàn)中3種雌激素較易溶解于極性溶劑中，因此，考察了正己烷、甲醇、乙腈及乙酸乙酯4種不同提取溶劑對(duì)回收率的影響。4種提取溶劑的影響結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，甲醇和乙腈由于極性較強(qiáng)對(duì)樣品的穿透力強(qiáng)于乙酸乙酯和正己烷；但是，樣品中脂肪等基質(zhì)干擾物易溶于甲醇，增加了后續(xù)SPE柱凈化難度；并且乙酸乙酯萃取后溶液呈深土黃色，雜質(zhì)干擾較大，不易凈化，平均回收率僅為49.72%；正己烷和甲醇的提取效果較差，3種激素的平均回收率在57.16%和61.15%左右；而乙腈作為提取溶劑得到的平均回收率為82.53%，乙腈提取效率最高，并具有沉淀蛋白作用，乙腈提取溶液最干凈。故選取乙腈作為提取溶液，能夠獲得3種雌激素較好的提取效果。

圖1 提取溶劑對(duì)回收率的影響

2.1.3 固相萃取柱的優(yōu)化

由于人乳中的雌激素含量很低，并且甘油三酯等干擾雜質(zhì)較多，含量較大，因此本研究采用固相萃取柱進(jìn)行樣品的凈化。雌激素含有甾族結(jié)構(gòu)，極性大多為中等或者偏弱，用親水親脂平衡（Hydrophobic-li?pophilic balance，HLB）柱[12]、C18柱[13]和MCX柱[14]凈化。不同固相萃取柱對(duì)類固醇的凈化效果的影響見圖2。結(jié)果表明，C18對(duì)雌三醇、雌二醇回收率只有HLB柱的一半。HLB柱對(duì)于雌二醇、雌三醇的回收率很高，能夠達(dá)到82.60%和83.18%。而MCX柱對(duì)于雌激素的回收率處于C18柱和HLB柱兩者回收率之間。HLB柱、C18柱和MCX柱對(duì)雌激素的平均回收率分別為81.38%、57.57%和71.74%。并且三個(gè)柱子中HLB柱最能保持優(yōu)良的潤(rùn)濕性，可以避免由于意外干涸所導(dǎo)致的穩(wěn)定性差和回收率低的問(wèn)題，因此本研究中應(yīng)用HLB柱進(jìn)行雌激素的萃取和凈化。

圖2 固相萃取柱對(duì)回收率的影響

2.1.4 固相萃取洗脫溶液的優(yōu)化

常用的固相萃取洗脫溶液有丙酮、甲醇、乙腈等。本研究考查了丙酮、甲醇、乙腈、甲醇-乙腈（1/1，體積比）混合液對(duì)雌激素的洗脫能力。四種洗脫液的洗脫效果見表3。結(jié)果顯示，丙酮洗脫時(shí)，平均回收率為66.15%，甲醇洗脫時(shí)，其平均回收率為65.34%，乙腈洗脫時(shí)，其平均回收率為72.07%，甲醇-乙腈（1/1，體積比）洗脫時(shí)，平均回收率為85.53%。由此可看出，甲醇-乙腈（1/1，體積比）混合液的洗脫能力最強(qiáng)，故選取甲醇-乙腈（1/1，體積比）作為洗脫溶劑。

圖3 固相萃取洗脫溶劑對(duì)回收率的影響

2.1.5 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)首先選擇甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相來(lái)同時(shí)分析3種雌激素的分離效果，發(fā)現(xiàn)甲醇-水不能將電離模式為負(fù)的3種雌激素全部出峰，而乙腈-水可以使電離模式為負(fù)的雌激素出峰分離。為了有利于雌激素化合物的離子化，在負(fù)離子模式下流動(dòng)相水相中加入體積分?jǐn)?shù)0.1%氨水，各激素的峰形和靈敏度沒(méi)有多大改善。因此采用乙腈-水作為流動(dòng)相分析3種雌激素。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品分別進(jìn)行全掃描，再調(diào)節(jié)碰撞能量，分別選取經(jīng)碰撞后所得豐度較高、碎片結(jié)構(gòu)合理的兩個(gè)子離子作為定量和定性離子，并優(yōu)化其最佳去簇電壓和碰撞能量。最終確定的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 3種雌激素的質(zhì)譜參數(shù)

2.2超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性關(guān)系

用甲醇配制3種雌激素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制范圍為0.5～20 ng/mL，以激素定量離子色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線。3種雌激素具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，結(jié)果如表2所示。

表2 3種雌激素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、LOD和LOQ

儀器基線3倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的樣品中雌激素濃度作為方法檢出限（LOD），因此3種雌激素檢出限在0.19～0.25 ng/mL范圍內(nèi)；儀器基線10倍信噪比（S/ N）對(duì)應(yīng)的樣品中雌激素濃度為方法定量限（LOQ），因此定量限在0.69～0.85 ng/mL范圍內(nèi)。

2.2.2 回收率和精密度

按照1.0，5.0，10.0 ng/mL質(zhì)量濃度水平對(duì)人乳樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。分別在3段泌乳期的樣品中添加3種不同水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行預(yù)處理，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定5次，分別計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，方法結(jié)果滿意，具體數(shù)值參如表3所示。

表3 3種雌激素加標(biāo)的回收率和精密度（n=5） %

2.3人乳雌激素超高效液相色譜-質(zhì)譜法分析

應(yīng)用本研究建立的方法對(duì)三個(gè)階段泌乳期的10個(gè)初乳樣品、13個(gè)過(guò)渡乳樣品和16個(gè)成熟乳樣品進(jìn)行分析，在上述色譜條件下，保留時(shí)間分別為：雌酮3.34 min，雌二醇2.88 min和雌三醇1.27 min，如圖4所示。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)應(yīng)在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇兩個(gè)以上的子離子，表明方法專一性良好。具體各雌激素在三段泌乳期中的含量及變化情況參見表4。由表4可知，初乳中雌激素含量很高，雌酮平均質(zhì)量濃度3.78 ng/mL，雌二醇平均質(zhì)量濃度最高，達(dá)到7.4 ng/mL，雌三醇平均質(zhì)量濃度達(dá)到4.05 ng/mL。三種雌激素質(zhì)量濃度都隨著泌乳期的延長(zhǎng)而降低。

圖4 3種雌激素色譜

圖4中，cps全稱為count per second，其物理意義是每秒檢測(cè)到的離子個(gè)數(shù)”。

表4 各泌乳期中國(guó)人乳3種雌激素質(zhì)量濃度 ng/mL

3 結(jié)論

建立了提取和檢測(cè)人乳中3種雌激素的超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）分析方法。優(yōu)化了樣品前處理技術(shù)和色譜質(zhì)譜條件。該法線性關(guān)系良好（R2=0.99）、準(zhǔn)確度和精密度良好，RSD在2.07%～ 3.92%之間，方法的檢出限LOD在0.19～0.25 ng/mL之間，同其他方法相比一致或更低。所建方法已成功應(yīng)用于實(shí)際人乳樣品的檢測(cè)。由于人乳被認(rèn)為是嬰兒完美的食物，其雌激素的質(zhì)量濃度可以作為食品和營(yíng)養(yǎng)專家為嬰兒的膳食調(diào)配的一個(gè)參考，同時(shí)采集的數(shù)據(jù)也可以作為嬰兒配方奶粉中雌激素安全的殘留質(zhì)量濃度的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。

[1]ORGANIZATION W H，F(xiàn)UND U N C.Global strategy for infant and young child feeding[J].Global Strategy for Infant&Young Child Feeding，2003，83（March-April）：32-45.

[2]周曉彬，紀(jì)霞，葛云潔，等.成人哮喘影響因素的病例對(duì)照研究[J]．中國(guó)公共衛(wèi)生，2006，22（9）：1093-1094．

[3]王小春，孫長(zhǎng)顥.母乳喂養(yǎng)與兒童、青少年及成年肥胖的關(guān)系[J]．中國(guó)公共衛(wèi)生，2005，21（5）：634-635．

[4]方芳，李婷，安穎.乳中核苷酸的分析及其對(duì)嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)功能的研究[J].食品研究與開發(fā)，2015（8）：135-139.

[5]DUFFY L C.Exclusive breastfeeding protects against bacterial coloni?zation and day care exposure to otitis media[J].Pediatries，1997，100（4）：7.

[6]PURDOM C E，HARDIMAN P A，BYE V V J，et al.Estrogenic ef?fects of effluents from sewage treatment works[J].Chemistry&Ecolo?gy，1994，8（4）：275-285.

[7]POPE G S，SWINBURNE J K.Hormones in milk：their physiologi?cal significance and value as diagnostic aids[J].Journal of Dairy Re?search，1980，47（03）：427-449.

[8]COURANT F，ANTIGNAC J P，LAILLE J，et al.Exposure assess?ment of prepubertal children to steroid endocrine disruptors.2.Deter?mination of steroid hormones in milk，egg，and meat samples[J].Jour?nal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（9）：3176-3184.

[9]曹勁松，李意.初乳.常乳及其制品中的雌性激素[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2005，33（9）：4-8.

[10]JOHN W F，PATRICK F.F，PAUL L H M.Encyclopedia of Dairy Sciences[M].Second Edition.London.Elsevier，2011.

[11]BR ITT-LOUISE S，MAGNUS A.Identification and quantitation of free and conjugated steroids in milk from lactation women[J].J Steroid Biochem，1986，25（3）：379-391.

[12]廖濤，吳曉翠，王少華，等.固相萃取-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)檢測(cè)水體中9種環(huán)境雌激素[J].分析化學(xué)，2013，41（3）：422-426.

[13]郁倩，王洪新，安可.水中5種雌激素的固相萃取高效液相色譜測(cè)定法[J].環(huán)境與健康雜志，2008，25（5）：438-441.

[14]陳君慧，路勇，馮楠，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物肌肉組織中的14種激素[J].食品工業(yè)科技，2013（8）：74-79.

Analysis of three estrogens in Chinese human milk using UPLC/MS/MS

CAO Yu-tong1,2，REN Hao-wei1,2，LIU Ning1,2
（1.National Dairy Engineering&Technical Research Center，Harbin 150028，China;2.Northeast Agricultural Univer?sity，College of Food Science，Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Harbin 150030，China）

An effective method was established with an ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC/MS/ MS）method for determination of steroid hormones in Chinese human milk.Samples were treated with enzymatic hydrolysis，extraction，pu?rification with solid phase extraction（SPE）column and concentration，separation by a Waters UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）chromatographic column，and reaction monitoring for MS/MS scan pattern detection，and the quantification was performed with standard method.Calibration curve showed a good linear correlation coefficient（R2）that was above 0.99.The results showed that this method has good sensitivity and accuracy.The method has been successfully applied to qualitative and quantitative analysis for 3 estrogens in human milk.

human milk；estrogen；UPLC/MS/MS；SPE

TS252.1

A

1001-2230（2016）09-0052-04

2016-03-28

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAD09B03）

曹宇彤（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與乳制品加工技術(shù)。

劉寧