秦 鵬，劉秉焱，韓翠英，劉虎岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

水分脅迫下不同抗旱性小麥品種葉片轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)差異研究

秦 鵬，劉秉焱，韓翠英，劉虎岐*

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

通過(guò)研究不同抗旱性小麥品種中轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的差異，為闡明小麥抗旱機(jī)制奠定基礎(chǔ)。依據(jù)候選基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，以干旱脅迫后0、3、6、9、12和24 h的小麥葉片為實(shí)驗(yàn)材料，以26S rRNA為內(nèi)參，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)Wdreb2、Wlip19基因在干旱敏感性和干旱耐受性小麥葉片中的相對(duì)表達(dá)量。定量PCR結(jié)果顯示：干旱脅迫后，Wdreb2、Wlip19基因在干旱敏感性小麥葉片中的表達(dá)明顯低于干旱耐受性小麥，在不同品種葉片中的響應(yīng)時(shí)間和表達(dá)趨勢(shì)存在差異。研究認(rèn)為，Wdreb2、Wlip19基因在不同品種小麥?zhǔn)艿礁珊得{迫后的表達(dá)差異，與該品種小麥的抗旱能力具有一定的相關(guān)性。

小麥；干旱脅迫；轉(zhuǎn)錄因子；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

干旱是影響西北地區(qū)作物產(chǎn)量的重要因素之一。植物在受到干旱脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)被誘導(dǎo)產(chǎn)生多種調(diào)控因子和功能蛋白來(lái)對(duì)抗干旱脅迫[1,2]。轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)控因子，它可以激活一系列脅迫耐受應(yīng)答基因表達(dá),產(chǎn)物包括相溶性溶質(zhì)、胚胎晚期豐富蛋白、活性氧清道夫和熱激蛋白等等,從而綜合提高植物的脅迫耐受能力?，F(xiàn)已有多種調(diào)控干旱相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因被克隆出來(lái)。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，已經(jīng)有超過(guò)50個(gè)家族至少1 700個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因被克隆出來(lái)[3-7]，其中有相當(dāng)一部分與干旱脅迫應(yīng)答相關(guān)[8-9]。例如：bZIP家族的AREB/ABF基因可對(duì)干旱產(chǎn)生響應(yīng)[10]，AP2/ERF基因家族的DREB1亞家族轉(zhuǎn)錄因子受脫水和冷誘導(dǎo)[11],NAC家族的ANACO19、ANACO55和ANACO72則被干旱、高鹽和ABA誘導(dǎo)表達(dá)[12]。大量研究表明，在植物對(duì)抗干旱脅迫過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子起著非常重要的作用[13-16]。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，DREB和bZIP這兩類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在小麥對(duì)抗干旱過(guò)程中扮演著重要角色[17-19]。在前人的研究當(dāng)中，Wdreb2、Wlip19被證實(shí)是能夠明顯提高小麥抗旱能力的2個(gè)基因[20-21]。本研究通過(guò)SYBR Green染料實(shí)時(shí)定量PCR，以小麥基因26S rRNA為內(nèi)參，采用相對(duì)定量方法，從mRNA轉(zhuǎn)錄水平定量檢測(cè)Wdreb2和Wlip19這2個(gè)基因在西北地區(qū)常見(jiàn)的10種不同品種小麥(5種干旱敏感性，5種干旱耐受性)受到干旱脅迫后葉片中的表達(dá)差異，試圖發(fā)現(xiàn)不同抗旱轉(zhuǎn)錄因子在小麥抗旱機(jī)理中發(fā)揮的作用程度，進(jìn)一步為小麥抗旱機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料與處理

植物材料為10個(gè)品種的小麥幼苗，分為干旱敏感性:西農(nóng)979、西農(nóng)165、中麥895、小偃22、周麥18；干旱耐受性:晉麥47、運(yùn)旱805、普冰9946、普冰143、普冰151。

采用水培法，種子用蒸餾水清洗2次，然后用10 %次氯酸鈉消毒10 min，再用蒸餾水清洗干凈。在培養(yǎng)皿底部鋪2層濾紙，將種子均勻鋪上，加入蒸餾水，暗室催芽12 h～24 h，出芽后置于光照恒溫培養(yǎng)箱(32 ℃、光照12 h)中培養(yǎng)。在小麥生長(zhǎng)至6～7 d時(shí)，采用20% PEG 6000模擬干旱脅迫，并相應(yīng)設(shè)置水處理對(duì)照。取經(jīng)干旱脅迫處理0、3、6、9、12和24 h及對(duì)照植株的葉片，用液氮速凍，置-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 候選基因與引物

根據(jù)Wdreb2(GenBank登記號(hào)為AB193608)、Wlip19(GenBank登記號(hào)為AB193552)基因在NCBI上公布的序列，使用Primer Premier 5.0軟件，分別設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，上游引物Wdreb2-F：(5′-AGATGTTGCTTCTTCCTTGCC-3′)；Wlip19-F：(5′-CAGCCTCGTTTCTTCCACTTT-3′)，下游引物Wdreb2-R：(5′-GATGTGCTCCTTGAAATGCTTG-3′)；Wlip19-R：(5′-GACATGGTCGGTCGGGTTC-3′)。內(nèi)參根據(jù)小麥26S rRNA(GenBank登記號(hào)為NC022714)基因的序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，上游引物26S-F：(5′-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3′)，下游引物26S-R：(5′-TCTCCCTTTAACACCAACGG-3′)。引物由華大基因公司合成。通過(guò)梯度PCR確定最佳退火溫度，作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的退火溫度，20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定引物的正確性。

1.3 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol試劑(TaKaRa公司)，按其說(shuō)明書(shū)的方法提取小麥幼葉總RNA。經(jīng)超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，計(jì)算OD260/OD280、OD260/OD230，確定RNA的純度，再利用瓊脂凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。選取較完整、純度高且沒(méi)有降解的RNA進(jìn)行cDNA合成，cDNA第1鏈合成參照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(TaKaRa公司)操作方法。

1.4 PCR條件的優(yōu)化

對(duì)設(shè)計(jì)出的引物按照退火溫度55～65 ℃、引物濃度0.2～0.6 mol/L、循環(huán)數(shù)30～35分別進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，以得到擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果沒(méi)有非特異性條件，并且目的條帶清晰的最佳PCR條件，并按照該條件進(jìn)行下一步的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用TaKaRa公司SYBR Premix EXTaqTM(Perfect Real Time)試劑盒，10 μL體系里包含5 μL SYBR?Premix EXTaqTM、上下游引物各0.2 μL 、0.8 μL cDNA模板、3.8 μL 滅菌超純水。使用CFX96型號(hào)PCR儀(Bio-Rad公司)進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。PCR反應(yīng)采用2步法：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，Tm ℃退火及延伸30 s，循環(huán)35次，延伸階段收集熒光信號(hào)；反應(yīng)結(jié)束后65 ℃ 5 s，并以0.5 ℃/s的速度升至95 ℃進(jìn)行溶解曲線分析。

1.6 數(shù)據(jù)的分析

實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量PCR相對(duì)定量方法，選擇2-ΔΔCt方法[22]計(jì)算脅迫處理的樣品和對(duì)照組樣品中目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥葉片總RNA質(zhì)量的檢測(cè)

不同處理時(shí)間和不同品種小麥葉片樣品的總RNA經(jīng)超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)表明，OD260/OD280均在1.8～2.1，OD260/OD230在1.9～2.2，說(shuō)明提取的RNA純度較高；經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得知，各組織總RNA均有較清晰的3條帶，分別為5S、18S和28S rRNA，且無(wú)嚴(yán)重彌散現(xiàn)象(圖1)。說(shuō)明提取樣品的總RNA無(wú)明顯降解現(xiàn)象，完全能夠滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2 Wdreb2、Wlip19與26S rRNA的反轉(zhuǎn)錄檢測(cè)

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖2)顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一，無(wú)非特異性擴(kuò)增及引物二聚體出現(xiàn)，Wdreb2、Wlip19與26S rRNA均與預(yù)期片段大小一致，說(shuō)明引物可以正確擴(kuò)增出響應(yīng)片段，可用于實(shí)時(shí)定量PCR分析。

圖1 小麥葉片總RNA的電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Agarose gel analysis of total RNA of wheat leaves

2.3 Wdreb2與Wlip19表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

按照公式相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt，以26S rRNA為內(nèi)參基因，以水培養(yǎng)的小麥葉片組織的Wdreb2，Wlip19基因?yàn)閰⒄找蜃?，設(shè)為1，分別得到受到干旱脅迫處理3、6、9、12和24 h的葉片組織中Wdreb2，Wlip19基因的表達(dá)數(shù)據(jù)曲線(圖3，圖4)。

2.3.1Wdreb2在不同小麥品種中的表達(dá) 與水培對(duì)照組相比，5個(gè)敏感性小麥(西農(nóng)979、西農(nóng)165、小偃22、周麥18、中麥895)在處理組中Wdreb2基因的表達(dá)均呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)且趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，表達(dá)量到達(dá)峰值的時(shí)間大部分集中在6 h處，其中，小偃22集中在9 h處，較其他2個(gè)品種慢。

M．DNA marker D2000；1.26S rRNA；2.Wdreb2；3.Wlip19圖2 Wdreb2、Wlip19和內(nèi)參基因26S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR amplification product of Wdreb2,Wlip19 and reference gene 26S rRNA

圖3 10種小麥品種中Wdreb2基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.3 Relative expression levels of Wdreb2 in leaves of ten wheat varieties

圖4 10種小麥品種中Wlip19基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.4 Relative expression levels of Wlip19 in leaves of ten wheat varieties

5個(gè)耐受性小麥(晉麥47、運(yùn)旱805、普冰9946、普冰143、普冰151)經(jīng)處理后，5個(gè)處理組中的表達(dá)均呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)再上調(diào)的趨勢(shì)，具有兩個(gè)表達(dá)峰值，主要集中在6 h處和24 h處(晉麥47集中在3 h和24 h處)。雖然Wdreb2基因在各個(gè)品種中的相對(duì)表達(dá)量不一樣，但具有大體一致的表達(dá)趨勢(shì)，進(jìn)一步說(shuō)明Wdreb2基因參與干旱應(yīng)答過(guò)程。

2.3.2Wlip19在不同小麥品種中的表達(dá) 與水培對(duì)照組相比，敏感性小麥(西農(nóng)979、小偃22、周麥18、西農(nóng)165和中麥895)經(jīng)處理后，5個(gè)敏感性品種處理組中Wlip19的表達(dá)均呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)再上調(diào)的趨勢(shì)，均具有兩個(gè)表達(dá)峰值，且均集中在6 h處和24 h處，這兩個(gè)峰值與對(duì)照組均呈現(xiàn)顯著性差異；同時(shí)所有處理組的表達(dá)均無(wú)下調(diào)現(xiàn)象。其中西農(nóng)979和小偃22在3 h處表達(dá)明顯高于對(duì)照組，均在2倍以上，說(shuō)明Wlip19基因在這2個(gè)品種中對(duì)干旱響應(yīng)較其他3個(gè)品種早。

5個(gè)耐受性小麥(晉麥47、運(yùn)旱805、普冰9946、普冰143、普冰151)經(jīng)處理后，所有品種處理組中的表達(dá)量與對(duì)照組相比均有顯著性差異，其中在3 h處表達(dá)量最高，為對(duì)照組的6～10倍，隨后逐漸下降且趨于穩(wěn)定。

3 討 論

Wdreb2、Wlip19在小麥?zhǔn)艿礁珊得{迫后作為正調(diào)控因子對(duì)小麥干旱脅迫起調(diào)控作用。Wdreb2、Wlip19在干旱耐受性小麥與干旱敏感性小麥葉片中的表達(dá)都受干旱脅迫影響呈上調(diào)趨勢(shì)，這與已報(bào)道的研究結(jié)論基本一致[23-26]。這表明Wdreb2、Wlip19在小麥對(duì)抗干旱過(guò)程中起著比較重要的調(diào)控作用。

Wdreb2、Wlip19在不同品種小麥葉片中呈現(xiàn)差異性表達(dá)。從結(jié)果中可以看出，Wdreb2、Wlip19在干旱耐受性小麥葉片中表達(dá)量明顯比在干旱敏感性小麥葉片中高。說(shuō)明Wdreb2、Wlip19存在基因型表達(dá)特異性。在小麥?zhǔn)艿礁珊得{迫后，Wdreb2、Wlip19在干旱誘導(dǎo)下表達(dá)量開(kāi)始上調(diào)，從而合成更多的轉(zhuǎn)錄因子，與順式作用元件結(jié)合，調(diào)控不同的抗旱基因的表達(dá)，對(duì)干旱脅迫做出響應(yīng)。

Wdreb2、Wlip19在不同品種小麥葉片中脅迫響應(yīng)時(shí)間存在差異。Wdreb2基因在干旱耐受性小麥與干旱敏感性小麥葉片中對(duì)于PEG脅迫的響應(yīng)時(shí)間都集中在6 h，而Wlip19基因在干旱耐受性小麥葉片中對(duì)于PEG脅迫的響應(yīng)時(shí)間要比干旱敏感性小麥葉片中早，前者集中在3 h，后者集中在6 h。原因分析可能是由于Wlip19的表達(dá)受ABA的誘導(dǎo)，在不同品種小麥中，ABA的含量變化不同，在干旱耐受性小麥?zhǔn)艿礁珊得{迫后，ABA含量增加的速度快，所以Wlip19在干旱耐受性小麥葉片中對(duì)干旱脅迫響應(yīng)的時(shí)間要比敏感性小麥早。

Wdreb2、Wlip19在不同品種小麥葉片中表達(dá)趨勢(shì)存在差異。在干旱耐受性小麥葉片的實(shí)時(shí)定量結(jié)果中，Wdreb2出現(xiàn)了兩個(gè)表達(dá)峰，在第一次表達(dá)量上調(diào)到峰值后，其表達(dá)量開(kāi)始出現(xiàn)下調(diào)，待下調(diào)到一定程度后，表達(dá)量又會(huì)上調(diào)，即表現(xiàn)出 “上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)”的趨勢(shì)；Wlip19出現(xiàn)了一個(gè)表達(dá)峰，在上調(diào)到峰值后，開(kāi)始逐漸下調(diào)，并趨于穩(wěn)定。在敏感性小麥葉片中，Wdreb2只出現(xiàn)了一個(gè)表達(dá)峰，在表達(dá)量上調(diào)到峰值后，其表達(dá)量開(kāi)始下調(diào)，到達(dá)一定程度后趨于穩(wěn)定；Wlip19出現(xiàn)了兩個(gè)表達(dá)峰，表現(xiàn)出一個(gè)“上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)”的趨勢(shì)。分析原因，我們認(rèn)為這是由于品系間差異性所致，調(diào)控抗旱基因表達(dá)的途徑和轉(zhuǎn)錄因子太多，其表達(dá)在不同品系中具有選擇性。

在干旱脅迫下，各品種小麥均有多個(gè)信號(hào)途徑協(xié)同作用，且發(fā)揮的作用不同，響應(yīng)時(shí)間也各不相同[17]，這從本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果中得到了驗(yàn)證。從當(dāng)前我們研究的這兩個(gè)基因來(lái)看，不同品種間也是存在一定共性的，如：這兩個(gè)基因均在敏感品種“西農(nóng)165中”表達(dá)量最低、在抗旱品種“普冰151”中表達(dá)量最高、抗旱品種中的表達(dá)均明顯高于敏感品種，等等。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，Wdreb2、Wlip19作為正調(diào)控因子對(duì)小麥干旱脅迫起調(diào)控作用，在小麥對(duì)抗干旱的分子機(jī)制中起著重要作用，并與該品種小麥抗旱能力正相關(guān)。對(duì)于Wdreb2、Wlip19與其他抗旱基因相比較，作用于小麥對(duì)抗干旱過(guò)程中的重要程度，還有待于進(jìn)一步的研究。

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(編輯:宋亞珍)

Comparative Expression of Two Function-known Transcription Genes in Different Drought Tolerance Wheat Cultivars under Water Deficit Stress

QIN Peng, LIU Bingyan,HAN Cuiying,LIU Huqi*

(College of Life Science,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China)

This study aimed to investigate the expression ofWdreb2 andWlip19 in ten different varieties of wheat leaves under drought stress, and lay a foundation for wheat drought resistance mechanism. Primers were designed according to gene sequences, using wheat leaves under different degrees of drought stress (including 0,3,6,9,12 and 24 h) as experimental materials, and 26S rRNA as the internal control. The florescent real-time quantitative PCR was used to detect relative expression levels ofWdreb2 andWlip19 in different varieties of wheat. RT-PCR results showed that, the expression ofWdreb2 andWlip19 gene in drought sensitivity wheat leaf significantly lower than that in drought tolerant wheat under drought stress. There are some differences in response time and express trends in different varieties. These results indicated that the different expression levels ofWdreb2 andWlip19 in different varieties of wheat under drought stress were related to the drought resistant ability.

wheat;drought stress;transcription factor;real-time quantitative PCR

1000-4025(2016)11-2267-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.11.2267

2016-04-16;修改稿收到日期:2016-11-15

西北農(nóng)林科技大學(xué)青年學(xué)術(shù)骨干研究基金(01140302)

秦 鵬(1988-)，男，在讀碩士研究生，主要從事植物抗逆分子生物學(xué)研究。E-mail：77824518@qq.com

*通信作者:劉虎岐，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物分子遺傳學(xué)、昆蟲(chóng)殺蟲(chóng)劑抗性分子機(jī)理和腦缺氧損傷分子機(jī)理研究。E-mail: liuhuqi@yahoo.com.cn

Q786

A