張 鋒

（寶雞文理學院化學化工學院，陜西省植物化學重點實驗室，陜西寶雞721013）

納米金剛石固載酶降解甲基橙研究*

張 鋒

（寶雞文理學院化學化工學院，陜西省植物化學重點實驗室，陜西寶雞721013）

本文以納米金剛石材料為固載基底材料，對辣根過氧化物酶進行了固定化實驗，并將其用于甲基橙溶液進行降解脫色處理。結(jié)果表明，納米金剛石對HRP固載效果良好，飽和固載量接近100mg·g-1。同等條件下，固載酶、游離酶對15mg·L-1甲基橙降解效率分別為38.6%，51.9%。增大固載酶用量后，能夠?qū)崿F(xiàn)100%降解。

固定化酶；納米金剛石；甲基橙；降解

我國工業(yè)生產(chǎn)中所排放的廢水總量中有大約35%來自印染廢水,這類廢水色度大，有機含量高，處理難度大，因此，相關處理技術受到研究人員的廣泛關注[1]?；瘜W氧化法是去除水體有機污染的有效技術手段。其中基于OH·氧化的Fenton技術反應條件溫和簡單，氧化能力強，無次生污染物，廣大研究者對其進行了深入研究[2，3]。但在實際應用過程中，也發(fā)現(xiàn)該反應對體系pH值要求苛刻，反應后處理困難；H2O2利用率低，處理成本高等問題[4，5]。雖然大量研究人員對此進行了針對性改進，如將O3、O2、紫外光等輔助手段引入Fenton技術，但該類方法仍以Fenton反應引發(fā)的OH·氧化為主，未從根本上改變上述問題，因此，對于該類染料廢水降解技術仍有待繼續(xù)改進。

辣根過氧化物酶（Horseradishperoxidase,HRP）能有效催化H2O2分解產(chǎn)生OH·，對芳香族化合物進行氧化[6]。因此，以HRP取代Fenton技術中的Fe2+能夠有效提高H2O2利用率，避免Fe3+水解從而影響處理效果。但游離酶價格較高，而將其固定化處理之后能夠重復使用，有利于降低處理成本。因此，選擇合適載體構(gòu)建固載催化體系，對于擴大HRP在染料廢水降解領域應用意義深遠。本課題組前期研究證明[7，8]表面有豐富羧基、羥基官能團的納米材料可作為HRP的有效載體,并保持固載酶較高催化活性和一定重復利用性。因此，本文選擇比表面積大、官能團豐富的納米金剛石為固定化載體，構(gòu)建固定化酶并用于降解甲基橙溶液。研究納米金剛石固載酶對甲基橙降解的催化降解效率，為開發(fā)新型染料廢水降解方法提供一定研究支持。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

辣根過氧化物酶（比活力大于200U·mg-1上海雪滿生物科技有限公司）；納米金剛石材料（南京先豐納米材料有限公司）；甲基橙、苯酚、30%（質(zhì)量分數(shù)）H2O2溶液、Na2HPO4、NaH2PO4均為AR，國藥集團化學試劑公司。

Cary-50型紫外可見分光光度計（Varian公司）；BS224S電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；791型磁力攪拌器（中西遠大科技有限公司）；TGL-16C型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 甲基橙標準曲線的測定以去離子水配制5、10、15、20、25mg·L-1甲基橙溶液，分別測量465 nm處吸光度值。以濃度為橫坐標，吸收值為縱坐標建立標準曲線。

1.2.2 納米金剛石固定化酶的制備在分析天平上準確稱量5.00mg納米金剛石材料加到5mL圓形試管中，依次加入1mg·mL-1HRP溶液（以0.1mol· L-1，pH值為7磷酸鹽緩沖溶液配制）500μL、磷酸緩沖溶液（0.1mol·L-1，pH值為7）2500μL，冰浴條件下固定在搖床上震蕩2h，促進載體材料和HRP充分結(jié)合。結(jié)束后將離心管置于高速離心機中，設置轉(zhuǎn)速12000r·min-1，離心10min，將上清液與載體分離，保存在-4℃冰箱中備用。

1.2.3 固定化酶含量與活性測定首先按照文獻[9]方法建立HRP濃度標準曲線，隨后取1.2.2中保留上清液適量在前述標準曲線測定體系反應并測定最大吸收值。根據(jù)吸收值和標準曲線計算固載量?；钚詼y定則將上清液換成一定量固定化酶，其余條件不變，測定最大吸收值。根據(jù)吸光度值與反應時間計算吸光度變化率k，將其轉(zhuǎn)化成為酶活性單位U[10]。1U定義為每分鐘催化1μmol苯酚轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的固定化酶量。游離HRP酶活性參考上述步驟進行。

1.2.4 甲基橙降解實驗取5U固定化酶放入5mL圓形試管中，依次加入30%H2O2500μL、PBS溶液1500μL，濃度為10mg·L-1的甲基橙溶液5mL。固定在搖床上充分反應后離心，取上清液測定464nm處吸光度值，并按照1.2.1建立標準曲線計算殘留甲基橙濃度，根據(jù)下式計算甲基橙降解效率。取等活力游離酶按同樣步驟進行試驗對照。

其中η：降解效率；C0：甲基橙初始濃度，mg·L-1；C1：反應后甲基橙濃度，mg·L-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 HRP固定化

不同體積游離HRP溶液按照1.2.2方法固定化處理后上清液紫外分析見圖1A。分析可知，當固載體系中游離酶濃度小于0.17mg·mL-1（既加入體積小于500μL），上清液按標準曲線測定方法在510 nm處吸收如圖1A紅色虛線所示，表明其中基本不含HRP。而3條實線吸收值則代表不同濃度游離酶加入后，對應載體上酶的活性。該吸收隨游離酶濃度增加而增大。圖1B表示當固載體系中游離酶濃度大于0.17mg·mL-1（既加入體積大于500μL），對應固載酶相同體系中測定的吸收值。如圖1B虛線所示，該值基本不變，表明載體上的酶量接近飽和。而實線則表示當體系中初始加入的游離酶體積超過500μL時，上清液在510nm處吸收值。該值隨濃度增加逐漸遞增，這同樣說明此時載體固載能力基本達到飽和，多余游離酶均存在于上清液中。

圖1 固定化后上清液和固載酶紫外吸收變化曲線Fig.1 Absorption curve of supematant and immobilizedenzyme after immobilization

根據(jù)1.2.2方法建立的HRP標準曲線見圖2。

分析圖1、2可以得出，該載體對HRP的最大固載量接近100mg·g-1。與文獻報道已有載體相比，納米金剛石固載量高，且固定化過程中不需要額外交聯(lián)劑。操作過程簡便，對酶活性影響較小，能夠滿足后續(xù)實驗需要。

圖2HRP標準曲線Fig.2 Standard curve of HRP

2.2 甲基橙降解

將上步所得固載酶用于甲基橙降解。結(jié)果見圖3。

圖3 甲基橙降解過程示意圖Fig.3 Schematic diagram for the degradation process of methyl orange

圖3A表明，同樣反應體系下，利用固載酶降解后，上清液的紫外吸收要低于游離酶處理后。根據(jù)圖3B甲基橙標準曲線計算可知此時游離酶、固載酶對甲基橙降解效率分別為38.6%，51.9%。固載酶比游離酶處理效率高34.5%。這與固載過程中未使用化學交聯(lián)劑，從而降低其對酶分子空間構(gòu)象影響有關，同時固載在納米載體上增大了待降解底物與酶分子接觸的表面積。在一定程度上也有利于加快反應速率。圖3C則是固載酶用量增大2倍后反應上清液紫外吸收圖。此時甲基橙溶液的紫外特征吸收峰完全消失，表明此時溶液中不含甲基橙分子，即對濃度約15mg·L-1甲基橙溶液降解率接近100%。圖3D為降解后甲基橙溶液照片。不難看出，此時管底有明顯黃色沉淀，而溶液則逐漸變?yōu)闊o色透明狀。這與圖3C結(jié)果相一致。因為HRP催化H2O2產(chǎn)生自由基，并借助鏈反應對芳環(huán)有機化合物進行氧化，將其轉(zhuǎn)變?yōu)榫酆衔锍恋韽亩ァ?/p>

3 結(jié)論

（1）利用納米金剛石材料進行了HRP固定化實驗。實驗結(jié)果顯示納米金剛石為一種很好的載體，對HRP的最大固載量約為100mg·g-1。

（2）制備的固定化酶對甲基橙有較好的降解效果。同等條件下，固載酶降解效果比游離酶高34.5%。增大固載酶用量后，對15mg·L-1甲基橙降解率接近100%。

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Research on degradation of methyl orange by the enzyme immobilized on nano diamond*

ZHANG Feng
（Dept.of Chemistry and Chemical Engineering,Shaanxi Key Laboratory ofPhytochemistry，Baoji University of Arts and Science,Baoji 721013,China）

In this paper,horseradish peroxidase immobilized on nano diamond was utilized to degrade methyl orange solution.The experiment results showed that nano diamond have good ability on enzyme immobilization and the saturation load is close to 100mg·g-1.The degradation efficiency to 15mg·L-1methyl orange were 38.6%and 51.9%respectively when free enzyme or immobilized enzyme was used.If enzyme consumption increased,methyl Orange solution can be degraded thoroughly.

immobilized enzyme；nano diamond；methyl orange；degradation

X703.1

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20161212

2016-10-13

陜西省科技廳工業(yè)攻關項目（2014K08-36）；陜西省植物化學重點實驗室項目（14JS005、12JS008）；寶雞文理學院重點項目（ZK12033）

張鋒（1982-），男，碩士，講師，2010年畢業(yè)于華東理工大學生物化學專業(yè)，主要從事生物催化研究。