范 超，王 欣，劉 偉，高德玉，蘇小紅，秦國輝，劉旭丹，王玉鵬

(黑龍江省科學(xué)院科技孵化中心，哈爾濱 150090；黑龍江省能源環(huán)境研究院，哈爾濱 150090)

抗生素對(duì)雞糞厭氧發(fā)酵過程影響的實(shí)驗(yàn)研究

范 超，王 欣，劉 偉，高德玉，蘇小紅，秦國輝，劉旭丹，王玉鵬

(黑龍江省科學(xué)院科技孵化中心，哈爾濱 150090；黑龍江省能源環(huán)境研究院，哈爾濱 150090)

采用實(shí)驗(yàn)室批式厭氧發(fā)酵裝置，在新鮮雞糞中添加不同含量的抗生素后進(jìn)行高溫厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究抗生素對(duì)雞糞厭氧發(fā)酵過程的影響。結(jié)果表明:進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，低濃度抗生素的添加對(duì)發(fā)酵無明顯抑制，總產(chǎn)氣率變化不大；當(dāng)土霉素和金霉素含量大于5mg·kg-1、阿莫西林大于10mg·kg-1，總產(chǎn)氣率下降。進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)研究抗生素的聯(lián)合抑制時(shí)，土霉素與金霉素對(duì)厭氧發(fā)酵的影響更為顯著，最佳的因素水平組合為土霉素含量5mg·kg-1、金霉素含量5mg·kg-1、阿莫西林含量10mg·kg-1，此時(shí)抗生素對(duì)發(fā)酵影響最低。

厭氧發(fā)酵；抗生素；顯著性

隨著規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，畜禽糞便帶來的有機(jī)固體廢棄物和高濃度有機(jī)廢水造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，成為制約我國畜禽生產(chǎn)的重要因素之一[1-2]。畜禽糞便是一種環(huán)境污染物，同時(shí)也是一種可利用的資源，因其含有大量有機(jī)物質(zhì)及N、P、K等多種營養(yǎng)成分，經(jīng)過適當(dāng)處理后不僅能減少其對(duì)環(huán)境的污染，得到的副產(chǎn)物還增加了其經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。畜禽糞便無害化處理和資源化利用的主要途徑有發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)肥及厭氧發(fā)酵制取沼氣[4]。厭氧發(fā)酵不受含水率影響，還能產(chǎn)生清潔能源，是一種畜禽糞便處理和利用的有效途徑。

近年來，在現(xiàn)代畜禽養(yǎng)殖場中，抗生素被廣泛用來抑制有害細(xì)菌的生長、預(yù)防和治療畜禽疾病、促進(jìn)生長等[5]。但由于消化系統(tǒng)的問題，大部分不能被畜禽完全吸收利用，高達(dá)60%～90%的抗生素以原樣排泄或排泄之后轉(zhuǎn)化為母體，在環(huán)境中殘留[6]?？股夭粌H是一種難降解的有機(jī)物，它的存在還在一定程度上抑制了禽畜糞便的生物處理過程[7]。在畜禽養(yǎng)殖使用的抗生素中，四環(huán)素類占的比重較大，可達(dá)40%左右，在常見的抗生素藥物中毒性最強(qiáng)，并具有生物累積性。常用的四環(huán)素類抗生素有四環(huán)素、金霉素、土霉素等[8]。阿莫西林屬于β-內(nèi)酰胺藥物抗生素，其殺菌機(jī)制是抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成[9]。這些抗生素經(jīng)畜禽消化后以糞便排出，而采用含有抗生素的畜禽糞便為原料進(jìn)行厭氧發(fā)酵，將關(guān)系到厭氧發(fā)酵的效率。

本實(shí)驗(yàn)采用養(yǎng)雞場常用的土霉素、金霉素和阿莫西林，研究了這3種抗生素的不同含量對(duì)雞糞厭氧發(fā)酵過程的影響。研究結(jié)果將有助于排除抗生素對(duì)厭氧發(fā)酵處理的障礙，避免和消除抗生素在厭氧發(fā)酵中的抑制作用，保證以雞糞為原料的沼氣工程正常運(yùn)行。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)選用的發(fā)酵原料是新鮮雞糞便，取自哈爾濱周邊養(yǎng)殖場。接種物為上一次發(fā)酵后的消化液。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 試驗(yàn)裝置設(shè)計(jì)和藥品

實(shí)驗(yàn)裝置采用1 000mL 錐形瓶作為厭氧發(fā)酵反應(yīng)容器，發(fā)酵有效容積500mL，置于恒溫水浴鍋中，溫度控制在55±1℃。發(fā)酵過程中產(chǎn)生氣體通過導(dǎo)氣管進(jìn)入裝有水的集氣瓶中，以排水法收集。

實(shí)驗(yàn)藥品：金霉素、土霉素和阿莫西林的純度大于99%；甲醇、Na2HPO4、Na2EDTA、檸檬酸、三氯乙酸、草酸甲醇等。

1.2.2 試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)設(shè)定發(fā)酵料液的TS為8%，發(fā)酵溫度為55℃，接種物添加量為有效容積的30%。

抗生素含量測定采用高效液相色譜法(HPLC)：選用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以濃度(x)為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)峰面積(y)為縱坐標(biāo)做回歸分析，得到3種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)。將待測樣品的峰面積的平均值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得出待測樣品的含量。

單因素實(shí)驗(yàn)：根據(jù)原料固含量加水調(diào)節(jié)至發(fā)酵料液總固體含量為 8%，發(fā)酵溫度為55±1℃，發(fā)酵周期20d，分別研究不同劑量的土霉素、金霉素和阿莫西林與產(chǎn)氣率之間的變化關(guān)系，加量梯度為：0、2 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg。

正交實(shí)驗(yàn)：根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定各因素的水平，對(duì)加土霉素、金霉素、阿莫西林三因素選用L9(34)表，研究抗生素聯(lián)合作用的正交實(shí)驗(yàn)，正交因素水平見表1。

表1 正交因素實(shí)驗(yàn)水平表
Tab.1 Effect factors and their level on orthogonal test

水平因 素A土霉素含量mg·kg-1B土霉素含量mg·kg-1C土霉素含量mg·kg-11225255103101020

1.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測定

酸堿度通過pH計(jì)測得，氨氮指標(biāo)采用納氏試劑分光光度法測定，具體方法參照國標(biāo)法[10]。

2 結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)所采用的雞糞的基本理化性質(zhì)見表2。

表2 雞糞基本理化性質(zhì)
Tab.2 Physical and chemical properties of chicken manure

項(xiàng)目TS/%VS/%TOC/%TN/%C/NS/%P(P2O5)/%NH+4-N/mg·L-1雞糞29.0219.8610.41.089.650.10.22530

添加抗生素后經(jīng)HPLC測得抗生素終濃度見表3。

表3 抗生素終濃度
Tab.3 Antibiotics final concentration

土霉素含量mg·kg-1土霉素含量mg·kg-1土霉素含量mg·kg-1000222555101010202020

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

A．土霉素含量對(duì)總產(chǎn)氣量的影響結(jié)果。

圖1 土霉素含量對(duì)總產(chǎn)氣率的影響Fig.1 Accumulated methane production with the treatment of oxytetracycline

由上圖可知，土霉素含量在0～5mg·kg-1，總產(chǎn)氣量呈穩(wěn)步升高趨勢(shì)，土霉素含量達(dá)到5mg·kg-1時(shí)，得到最大產(chǎn)氣量15.32L·kg-1。土霉素含量在5～20mg·kg-1時(shí)，總產(chǎn)氣量下降，pH值也明顯下降，土霉素含量達(dá)到20mg·kg-1時(shí)，pH值為6.3，這時(shí)反應(yīng)器偏酸。

B.金霉素含量對(duì)總產(chǎn)氣量的影響結(jié)果。

圖2 金霉素含量對(duì)總產(chǎn)氣量的影響Fig.2 Accumulated methane production with the treatment of chlortetracycline

由圖2可知，金霉素含量在0～5mg·kg-1，總產(chǎn)氣量平穩(wěn)微有上升，金霉素含量達(dá)到5mg·kg-1時(shí)，得到最大產(chǎn)氣量15.06L·kg-1。金霉素含量在5～20mg·kg-1時(shí)，總產(chǎn)氣量下降，pH值也明顯下降，土霉素含量達(dá)到20mg·kg-1時(shí)，pH值為6.2，反應(yīng)器偏酸。

C.阿莫西林含量對(duì)總產(chǎn)氣量的影響結(jié)果。

圖3 阿莫西林含量對(duì)總產(chǎn)氣量的影響Fig.3 Accumulated methane production with the treatment of amoxicillin

由圖3可知，阿莫西林含量在0～10mg·kg-1，總產(chǎn)氣量平穩(wěn)微有上升趨勢(shì)，阿莫西林含量達(dá)到10mg·kg-1時(shí)，得到最大產(chǎn)氣量15.35L·kg-1。金霉素含量在10～20mg·kg-1時(shí)，總產(chǎn)氣量下降，pH值也明顯下降，土霉素含量達(dá)到20mg·kg-1時(shí)，pH值為6.3，偏酸。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)中抗生素濃度較低時(shí)，不會(huì)對(duì)微生物的活性有抑制，甚至低劑量的抗生素會(huì)促進(jìn)一些酶類的產(chǎn)生從而促進(jìn)產(chǎn)氣；但是隨著抗生素濃度的增加，過量的抗生素就會(huì)抑制產(chǎn)甲烷菌的活性從而使產(chǎn)氣量下降。這和微生物自身性質(zhì)、抗生素的濃度、與抗生素的接觸時(shí)間等有關(guān)。而雞糞中含有大量的碳水化合物為產(chǎn)酸菌提供了充足的并可以直接利用的營養(yǎng)，所以產(chǎn)酸菌大量繁殖，導(dǎo)致pH值偏低。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

表4 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果
Tab.4 The orthogonal test layout and results

實(shí)驗(yàn)號(hào)A土霉素/mg·kg-1B金霉素/mg·kg-1C阿莫西林/mg·kg-1e1總產(chǎn)氣率/L·kg-111(2)1(2)1(5)18.62212(5)2(10)214.33313(10)3(20)312.9142(5)12313.765223115.776231213.7873(10)13212.378321314.069332114.71K135.85934.74936.45939.099K243.31144.16042.80140.479K341.13941.40041.04940.731k111.95311.58312.15313.033k214.43714.72014.26713.493k313.71313.80013.68313.577R2.4843.1372.1140.544優(yōu)水平A2B2C2

由表4的極差分析可知，各因素對(duì)總產(chǎn)氣率影響的大小順序?yàn)锽>A>C，即金霉素>土霉素>阿莫西林。最佳的因素水平組合為A2B2C3，即土霉素含量5mg·kg-1、金霉素含量5mg·kg-1、阿莫西林含量10mg·kg-1。由表5的顯著性分析可知，土霉素和金霉素對(duì)厭氧發(fā)酵的影響顯著高于阿莫西林。這3種抗生素的按比例配合使用具有協(xié)同效果，在抑制畜禽體內(nèi)有害微生物生長繁殖的同時(shí)不會(huì)降低產(chǎn)氣量。金霉素和土霉素對(duì)細(xì)菌有著更強(qiáng)的作用，因此對(duì)發(fā)酵的影響也比較顯著。

表5 正交實(shí)驗(yàn)顯著性分析
Tab.5 Significance analysis of orthogonal test

因素偏差平方哈自由度F比F臨界值顯著性土霉素9.788219.04319.000*金霉素15.599230.34819.000*阿莫西林7.147213.90519.000誤差0.512

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選取了兩類抗生素，即四環(huán)素類的土霉素和金霉素及β-內(nèi)酰胺藥物阿莫西林，通過HPLC測定這兩類抗生素的不同濃度，通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了正交試驗(yàn)的合理范圍，進(jìn)行以四環(huán)素類抗生素含量為2 mg·kg-1、5 mg·kg-1、10mg·kg-1，阿莫西林含量為5 mg·kg-1、10 mg·kg-1、20mg·kg-1的正交實(shí)驗(yàn)，確定了在抗生素存在下厭氧發(fā)酵的最優(yōu)因素水平為土霉素、金霉素含量分別為5mg·kg-1和阿莫西林含量為10mg·kg-1，這種組合不會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)氣產(chǎn)生抑制。

綜上所述，研究抗生素對(duì)厭氧發(fā)酵的影響對(duì)進(jìn)一步提高我國的畜禽糞便綜合處理效率，實(shí)現(xiàn)沼氣工程的工業(yè)化生產(chǎn)，必將帶來明顯的環(huán)境效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，以期能為以畜禽糞便作為發(fā)酵原料的大型沼氣工程提供一定的基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)。

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Study on the impact of the antibiotics on fowl manure anaerobic fermentation

FAN Chao, WANG Xin, LIU Wei, GAO De-yu, SU Xiao-hong, QIN Guo-hui, LIU Xu-dan, WANG Yu-peng

(Science and Technology Incubation Center, Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin 150090, China;Heilongjiang Energy and Environment Research Institute, Harbin 150090, China)

Anaerobic fermentation device is used for high-temperature anaerobic fermentation experiments under different type of antibiotics with fresh fowl manure, and the impact of the antibiotics on anaerobic fermentation to produce biogas is studied in this paper. The results showed that the addition of low concentration of antibiotic has no obvious inhibition on fermentation and the total air rate changes little under the single factor experiments; when the content of oxytetracycline and chlorotetracycline for more than 5mg·kg-1, at the same time, the content of amoxicillin for 10mg·kg-1, the total air rate decrease. Batch tests based on orthogonal test were adopted. Oxytetracycline, chlorotetracycline, amoxicillin which were the mostly common antibiotocs used in the treatment of chicken disease were chosen in the experiment. The results showed that the menthane production rate was affected mostly by the combination of 5mg·kg-1of oxytetracycline, 5mg·kg-1of chlorotetracycline 10mg·kg-1of amoxicillin.

Anaerobic fermentation; Antibiotics; Significance

2016-10-08

范超(1990-)，女，碩士，研究實(shí)習(xí)員。

S216.4；X713

A

1674-8646(2016)22-0001-04