楊 勇

大黃素甲醚對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞的殺傷作用及其機(jī)制

楊 勇*

目的 觀察大黃素甲醚對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。方法 Western印跡檢測(cè)不同濃度大黃素甲醚干預(yù)后PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白水平，MTT檢測(cè)不同濃度、時(shí)間下，大黃素甲醚對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大黃素甲醚對(duì)SW1990周期及凋亡的影響。結(jié)果 與NC組比較，Physcion組mTOR及p-Akt表達(dá)水平呈劑量依賴(lài)性下降，Akt表達(dá)呈劑量依賴(lài)性上升，其中5、50 μmol/L組與NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Physcion組細(xì)胞存活率呈時(shí)間依賴(lài)性下降，在48、72、96 h時(shí),與NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Physcion組SW1990存活率呈劑量依賴(lài)性下降，其中0.5、5、50 μmol/L組與NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與NC組比較，Physcion組停留在G1、G2期細(xì)胞比例減少，S期細(xì)胞比例升高(P<0.05)；Physcion組凋亡率高于NC組(P<0.01)。結(jié)論 大黃素甲醚通過(guò)抑制Akt磷酸化，調(diào)控PI3K/Akt通路，降低胰腺癌細(xì)胞存活率，促進(jìn)其凋亡。

胰腺癌；大黃素甲醚；凋亡

0 引言

胰腺癌的發(fā)病率在全球呈現(xiàn)逐年上升及年輕化的趨勢(shì)，是消化系統(tǒng)惡性腫瘤中預(yù)后最差的腫瘤之一，5年生存率低于5%，大部分胰腺癌發(fā)現(xiàn)時(shí)均失去手術(shù)機(jī)會(huì)[1]。目前的化療藥物及靶向藥物對(duì)于不能手術(shù)的胰腺癌及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的胰腺癌治療效果較差，而且較容易發(fā)生耐藥，中藥治療胰腺癌從以往的復(fù)方用藥發(fā)展到現(xiàn)在的單藥治療，取得了一定的研究進(jìn)展[2]。PI3K/Akt信號(hào)通路是腫瘤細(xì)胞內(nèi)重要傳導(dǎo)通路之一，該通路被激活后，會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。中藥大黃在前列腺癌、結(jié)腸癌及乳腺癌等惡性腫瘤中應(yīng)用的研究表明，大黃中的成分如大黃素及蒽醌類(lèi)可以抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，具有一定的抗腫瘤作用[4]。對(duì)大黃含有的單劑成分的研究是抗癌中藥的研究方向。大黃素乙醚是近期在掌科大黃根中提取出來(lái)的，具有對(duì)人體低毒低反應(yīng)的特點(diǎn)。有研究顯示，其對(duì)結(jié)直腸癌及乳腺癌具有抑癌作用[5]，但其在胰腺癌中的作用尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究采用大黃素乙醚干預(yù)胰腺癌細(xì)胞，觀察細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期變化，目的在于觀察大黃素乙醚單劑對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺傷作用，探討其機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺癌細(xì)胞株SW1990購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，采用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法，加入含100 U/mL的青霉素及鏈霉素，在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。大黃素甲醚(CAS No：521-61-9)購(gòu)自南京景竹生物科技有限公司，DAB顯色試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒及BCA定量試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司，mTOR多克隆抗體、p-Akt多克隆抗體及Akt多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司，MTT試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為給予大黃素甲醚干預(yù)的Physcion組及不給予干預(yù)的正常對(duì)照組(NC組)。

1.2 方法

1.2.1 Western印跡 Physcion組以5、10、15、20、25 μmol/L濃度梯度的大黃素甲醚分別作用48 h，NC組不給予干預(yù)培養(yǎng)48 h，按照蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行不同濃度梯度大黃素甲醚細(xì)胞及NC組細(xì)胞的蛋白提取，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫下封閉90 min后分別加入不同一抗，孵育過(guò)夜加入相應(yīng)二抗，再次孵育后采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，以β-actin作為內(nèi)參照。應(yīng)用BioRad圖像分析系統(tǒng)測(cè)定蛋白條帶吸光度，目標(biāo)蛋白吸光度/內(nèi)參照蛋白吸光度=蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 MTT法檢測(cè)不同濃度、不同時(shí)間大黃素甲醚干預(yù)后的細(xì)胞存活率 兩組細(xì)胞以6×104/mL加入96孔板，培養(yǎng)6 h。細(xì)胞貼壁后，Physcion組加入0.05、0.5、5、50 μmol/L濃度梯度的大黃素甲醚，作用48 h；NC組給予DMSO干預(yù)，培養(yǎng)48 h，作為加藥組，進(jìn)行平行對(duì)照，每個(gè)濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。48 h后，于每孔內(nèi)加入5 mg/L的10% MTT液，于37 ℃溫箱中孵育4 h，棄上清，加入150 μL DMSO，震蕩20 min后測(cè)定光密度值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞存活率。另取細(xì)胞，待貼壁后，Physcion組加入5 μmol/L大黃素甲醚，NC組給予DMSO作為平行對(duì)照，分別在細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h后進(jìn)行MTT檢測(cè)，測(cè)定細(xì)胞在不同時(shí)點(diǎn)的存活率。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡 Physcion組(5 μmol/L大黃素甲醚干預(yù)24 h)及NC組SW1990培養(yǎng)48 h，移至EP管，1 mL預(yù)冷后PBS洗滌，加1 mL預(yù)冷70%乙醇，4 ℃條件下固定24 h。1 100 g離心5 min后棄上清。每個(gè)樣品PBS重懸，加0.5% PI 30 μL、15 μL RNase A (10 mg/mL)，4 ℃避光溫浴30 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。另取培養(yǎng)48 h的Physcion干預(yù)細(xì)胞及NC組細(xì)胞，依照Annexin V-FITC/PI試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)細(xì)胞凋亡，應(yīng)用軟件Cell Quest分析，計(jì)算早期凋亡陽(yáng)性細(xì)胞比例。

2 結(jié)果

2.1 大黃素甲醚干預(yù)后相關(guān)蛋白的表達(dá) Western blot檢測(cè)不同濃度大黃素甲醚干預(yù)前后PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白變化，與NC組對(duì)比，Physcion組mTOR、p-Akt表達(dá)水平呈劑量依賴(lài)性下降，在5、50 μmol/L時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；Akt表達(dá)呈劑量依賴(lài)性上升，在5、50 μmol/L時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

2.2 大黃素甲醚干預(yù)后SW1990細(xì)胞的存活率 MTT顯示，在不給予干預(yù)條件下，Physcion組(5 μmol/L)及NC組SW1990細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h后，Physcion組細(xì)胞存活率呈時(shí)間依賴(lài)性下降趨勢(shì)，與NC組比較，在48、72、96 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)圖2。Physcion組加入0.05、0.5、5、50 μmol/L的大黃素甲醚作用48 h后，與NC組(Physcion濃度為0)對(duì)比，SW1990存活率呈劑量依賴(lài)性下降，在濃度0.5、5、50 μmol/L時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)圖3。

2.3 大黃素甲醚干預(yù)后SW1990細(xì)胞周期變化 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Physcion組(5 μmol/L)及NC組培養(yǎng)48 h后SW1990細(xì)胞周期變化。與NC組比較，Physcion組停留在G1及G2期的比例減少，在S期的比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

圖2 不同時(shí)間大黃素甲醚(5 μmol/L)處理后細(xì)胞存活率

圖3 不同濃度大黃素甲醚處理后(培養(yǎng)48 h)細(xì)胞存活率

組別G1期(%)G2期(%)S期(%)NC組80．64±1．958．26±1．5711．62±1．06Physcion組68．14±1．95?3．98±0．92?28．85±2．97?

注：*與NC組比較，P<0.05

2.4 大黃素甲醚干預(yù)后SW1990細(xì)胞凋亡變化 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Physcion組(5 μmol/L)及NC組培養(yǎng)48 h后SW1990細(xì)胞凋亡變化，結(jié)果顯示，Physcion組凋亡率高于NC組(42.65% vs.24.81%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SW1990凋亡

3 討論

胰腺癌在確診時(shí)，大部分患者已失去手術(shù)時(shí)機(jī)，以手術(shù)為基礎(chǔ)的綜合治療在70%的患者中不能實(shí)現(xiàn)[6]?；熂鞍邢蛑委熕幬飳?duì)胰腺癌的敏感性差，易發(fā)生耐藥，中藥在胰腺癌的治療中取得了一定進(jìn)展，由復(fù)方制劑轉(zhuǎn)為單劑治療是中西醫(yī)結(jié)合治療的方向[7]。大黃對(duì)惡性腫瘤的抑制作用已經(jīng)在多項(xiàng)研究中證實(shí)，但是其成分中起主要抗癌作用的單劑，目前還不清楚。Chen等[8]研究表明，大黃中的大黃素甲醚可以通過(guò)下調(diào)EMMPRIN表達(dá)誘發(fā)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，降低存活率，且此作用呈劑量、時(shí)間依賴(lài)性。EMMPRIN是PI3K/Akt信號(hào)通路下游靶基因之一，與多種腫瘤相關(guān)，如肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌及子宮內(nèi)膜癌等[9]。

本研究顯示，大黃素甲醚干預(yù)后，mTOR及p-Akt表達(dá)呈劑量依賴(lài)性下降，Akt表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性上升，說(shuō)明大黃素甲醚對(duì)Akt磷酸化具有抑制作用。有研究認(rèn)為，mTOR活性與Akt Ser473位點(diǎn)磷酸化有關(guān)，Akt磷酸化會(huì)影響mTOR表達(dá)，調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路，決定惡性腫瘤細(xì)胞的生物行為[10]。本研究顯示，大黃素甲醚對(duì)胰腺癌細(xì)胞存活率具有時(shí)間及劑量依賴(lài)性抑制作用，隨著大黃素甲醚作用時(shí)間的延長(zhǎng)或劑量的增加，胰腺癌細(xì)胞存活率會(huì)下降，表明大黃素甲醚能夠抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，降低存活率。大黃素甲醚干預(yù)的胰腺癌細(xì)胞停留在G1期及G2期比例降低，在S期比例升高，細(xì)胞凋亡率也明顯增高，表明大黃素甲醚對(duì)細(xì)胞周期具有調(diào)控作用，能夠促進(jìn)更多腫瘤細(xì)胞停止分裂增殖，進(jìn)入程序化死亡過(guò)程。Yu等[10]研究認(rèn)為，mTOR過(guò)表達(dá)會(huì)通過(guò)改變蛋白合成、異常調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及抑制細(xì)胞凋亡等途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。而大黃素甲醚通過(guò)抑制Akt磷酸化，導(dǎo)致mTOR的過(guò)表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)更多細(xì)胞停留在G1期，進(jìn)入程序化死亡。Xie等[11]通過(guò)對(duì)大黃素甲醚對(duì)肺癌A549細(xì)胞作用的研究也顯示，大黃素甲醚能夠誘導(dǎo)細(xì)胞增殖停頓，凋亡增加。劉素華等[12]研究認(rèn)為，大黃的另一種蒽醌類(lèi)提取物大黃素葡萄糖苷通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2水平誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡，Bcl-2也是PI3K/Akt信號(hào)通路的主要下游靶基因之一，該通路迅速短暫被激活后，通過(guò)多種途徑減少腫瘤細(xì)胞受損，維持細(xì)胞存活，促進(jìn)DNA損傷修復(fù)。Hong等[13]在乳腺癌細(xì)胞中的研究也顯示，大黃素甲醚可以通過(guò)下調(diào)Cyclin D1、Cyclin A、CDK4、CDK2及c-Myc表達(dá)，抑制Rb蛋白磷酸化，從而使乳腺癌細(xì)胞增殖停滯，細(xì)胞更容易受損，存活率降低，VEGF釋放降低，腫瘤血管減少，血管內(nèi)皮細(xì)胞更容易被破壞，促進(jìn)腫瘤組織中微血管血栓形成，從而導(dǎo)致腫瘤壞死，發(fā)揮抗腫瘤活性。

目前，聯(lián)合放療、化療及中藥治療是胰腺癌綜合治療的探索方向[14]，而大部分中藥提取物單劑的藥理作用目前尚不明確，但是為了發(fā)揮中藥的藥效，減少毒副作用，單劑是目前中藥研究的熱點(diǎn)課題。本研究顯示，在體外試驗(yàn)中，大黃素甲醚能夠通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，對(duì)胰腺癌細(xì)胞具有殺傷作用，可能作為胰腺癌治療的中藥單劑之一，其抗腫瘤作用需進(jìn)一步在體試驗(yàn)論證。

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Mechanism and inhibitory effect of physcion on pancreatic cancer cell SW1990

YANG Yong*

(Department of Emergency,Benxi Central Hospital,Benxi 117022,China)

Objective To observe the effect of physcion on proliferation and apoptosis of pancreatic cancer cell SW1990 and discuss the mechanism.Methods The PI3K-Akt-mTOR signaling pathway was detected by western blot;the proliferation of SW1990 interfered with different concentration of physcion at different time points was observed by MTT assay;the cell cycle and apoptosis affected by physcion was detected by flow cytometry.Results Compared with NC group,the expression of mTOR and p-Akt in physcion groups was dose-dependently decreased,while the expression of Akt was dose-dependently increased;there were significant differences at 5 μmol/L and 50 μmol/L (P<0.05).The cell viability in physcion groups was decreased in a time-dependent or dose-dependent manner,the differences being significant at 48,72 and 96 h (P<0.05) or 0.5,5 and 50 μmol/L(P<0.05).Physcion group has fewer cells staying in phase G1and G2and more cells staying in phase S than NC group (P<0.05) with higher apoptosis rate (P<0.01).Conclusion Physcion decreases the cell viability of pancreatic cancer and promotes the apoptosis by inhibiting the phosphorylation of Akt and controlling the PI3K/Akt pathway.

Pancreatic cancer;Physcion;Apoptosis

2016-04-02

本溪市中心醫(yī)院急診科，遼寧 本溪 117022

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201612007