■李軍德 馬池方 張婷婷 宋吉英*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學校醫(yī)院，山東青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學化學與藥學院，山東青島 266109）

恩諾沙星又名乙基環(huán)丙沙星、恩氟沙星，屬于氟喹諾酮類化學合成抑菌劑，具有廣譜抗菌性和高效的殺菌作用，對金黃色葡萄球菌以及大多數(shù)革蘭氏陰性菌均具有較強殺傷作用[1]，又因為恩諾沙星與其他抗菌藥物交叉耐藥性小，因此作為獸用藥經(jīng)常與飼料混用，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應用。但如果恩諾沙星在飼料中長期添加使用，也會蓄集到動物體內(nèi)造成藥物殘留，食用后會給人體健康帶來不利影響，其對生長發(fā)育中的兒童影響尤其不利，細菌耐藥性和過敏、溢血及腎衰等不良反應也會相繼發(fā)生，此外還有可能誘發(fā)精神病及癲癇患者發(fā)病以及增加胎兒畸形的風險，從而影響人類的食品安全和健康安全[2-3]。所以，飼料中恩諾沙星含量的分析檢測與控制，對食品安全有著重要的作用。

目前，文獻報道檢測飼料中的恩諾沙星含量的方法主要有高效液相色譜法[4]、流動注射-化學發(fā)光法[5]、酶聯(lián)免疫吸附快速測定法[6]和熒光法[7]。因飼料中的恩諾沙星用量少，常規(guī)方法很難準確檢測其含量，本實驗中利用釔離子對恩諾沙星的增敏作用，將氧化釔配成溶液中加入到飼料中，增強了恩諾沙星的熒光強度，使分析檢測更加易行。本文采用釔-恩諾沙星增敏分子熒光光譜法檢測市售仔豬飼料中的恩諾沙星含量，和以往的文獻方法比較，樣品的前處理操作簡單易行，所需溶劑用量少，操作環(huán)境友好，樣品處理結束后直接進行分析檢測，方法穩(wěn)定可靠，分析結果良好。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：F-2500熒光分光光度計（Hitachi公司）；PB-10 pH計（北京賽多利斯科學儀器北京有限公司）；95-2型電動磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；LXJ-802醫(yī)用低速離心機（金壇市恒豐儀器廠）；CHA-S氣浴恒溫振蕩器（江蘇金怡儀器科技有限公司）；電子分析天平（美特勒-托利多儀器上海有限公司）；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-B88型循環(huán)式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

試劑：恩諾沙星標準品、氧化釔、Tris-HCl均由北京索萊寶科技有限公司提供；乙腈、鹽酸、氫氧化鈉等均為優(yōu)級純；市售仔豬飼料樣品。

0.1 g/l恩諾沙星標準溶液配制：稱取0.010 0 g恩諾沙星標準品，用2 ml 0.1 mol/l NaOH溶液溶解后用超純水定容至100 ml棕色容量瓶，作為母液使用。

2 g/l Y3+溶液配制：稱取Y2O3(M=225.81)0.254 0 g，用5 ml濃鹽酸溶解，加熱蒸發(fā)至近干，用超純水定容至100 ml，作為母液待用。

0.1 mol/l Tris-HCl溶液配制：稱取7.882 5 g Tris-HCl（M=157.64）用超純水溶解，定容至 500 ml，需低濃度溶液用超純水稀釋即可。

1.2 光譜分析參數(shù)和分析測定方法

EX：277 nm，EM：441 nm，掃描范圍 EX：200～500 nm，EM：300～600 nm，狹縫寬度EX：5 nm，EM：5 nm，掃描速度為300 nm/min，延遲時間0 s，重復次數(shù)1次。

取一定濃度的恩諾沙星標準溶液，加入適量的Y3+標準溶液，調(diào)整溶液的pH=6，定容，使溶液體系中Y3+濃度為0.02 g/l，將溶液在氣浴恒溫震蕩器上室溫條件下振搖反應30 min，待測。

1.3 樣品中目標物的提取和測定方法

準確稱取仔豬飼料樣品2.000 0 g于100 ml碘量瓶中，加入20 ml乙腈，用封口膜封口以防止提取過程中溶劑揮發(fā)，磁力攪拌30 min后以4 000 r/min的速度離心30 min，將離心后得到的上清液轉移至圓底燒瓶中，在旋轉蒸發(fā)儀上旋蒸至干，然后加入1 ml 0.1 g/l Y3+溶液，調(diào)整混合溶液的pH=6，用 0.1 mol/l Tris-HCl溶液定容至5 ml，在室溫下振搖反應30 min，將所得溶液用一次性有機濾膜過濾以除去溶液中的固體顆粒，過濾后的溶液按照1.2節(jié)的分析測定方法待測。

2 結果與討論

2.1 恩諾沙星的激發(fā)波長和發(fā)射波長的確定

取1.1節(jié)中的恩諾沙星母液1 ml，調(diào)整溶液的pH=6并定容至10 ml，得0.01 g/l的恩諾沙星標準溶液，在1.2的最佳光譜條件下掃描其激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，所得譜圖見圖1和圖2。

圖1 恩諾沙星激發(fā)光譜圖

圖2 恩諾沙星發(fā)射光譜圖

通過圖1和圖2可知，恩諾沙星的激發(fā)波長為277 nm，發(fā)射波長為441 nm。因為恩諾沙星屬于喹諾酮類藥物，其分子中本身含有α-酮酸結構和一個哌嗪基，由此造成恩諾沙星的平面性結構比較穩(wěn)定，因此其具有內(nèi)源熒光，自身可以顯示出熒光強度。

2.2 釔-恩諾沙星體系的熒光光譜

取2個10 ml容量瓶中，其中一個加入1 ml 0.1 g/l恩諾沙星標準溶液，另外一個加入1 ml 0.1 g/l恩諾沙星標準溶液和1 ml 0.1 g/l Y3+溶液，調(diào)整溶液的pH=6并用0.1 mol/l Tris-HCl緩沖溶液定容。將兩份溶液在1.2節(jié)的實驗條件下進行譜圖掃描，比較恩諾沙星溶液和釔-恩諾沙星溶液體系的熒光強度的大小，以確定釔離子對恩諾沙星的熒光增敏效果，得激發(fā)光譜圖3和發(fā)射光譜圖4。

圖3 恩諾沙星激發(fā)光譜圖

圖4 恩諾沙星發(fā)射光譜圖

通過圖3和圖4可以發(fā)現(xiàn)，在恩諾沙星標準溶液中加入釔離子后，釔-恩諾沙星體系溶液的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的熒光強度均有明顯增強，且二者的激發(fā)和發(fā)射波長并沒有發(fā)生改變。因此，Y3+與恩諾沙星形成配合物的熒光強度較恩諾沙星單體明顯增強，可以確定釔離子對恩諾沙星具有明顯的增敏作用。這主要是因為恩諾沙星分子結構中含有α-酮酸，而Y3+具有一個充滿的次外電子層，能與恩諾沙星的羰基和羧酸基團結合形成一個六元環(huán)，且在釔離子存在下，哌嗪基氮原子的質(zhì)子化作用可以使平面剛性結構更加穩(wěn)定，所以加入釔離子對恩諾沙星有明顯的增敏作用[8]。

2.3 不同因素對釔-恩諾沙星體系熒光強度的影響

2.3.1 溶液的pH值對釔-恩諾沙星體系熒光強度的影響

在7個50 ml的容量瓶中分別加入1 ml 0.001 0 g/l恩諾沙星標準溶液，1 ml 0.2 g/l Y3+溶液，調(diào)整溶液的pH值分別為4、5、6、7、8、9、10，然后將溶液用0.1 mol/l Tris-HCl定容。在1.2的實驗條件下測量溶液的熒光強度，以pH值為橫坐標，溶液的熒光強度為縱坐標做曲線，所得曲線如圖5所示。

圖5 pH值對釔-恩諾沙星體系熒光強度的影響

由圖5可知，在酸性環(huán)境下，釔-恩諾沙星體系的熒光強度逐漸增強，在pH=6時熒光強度最大，之后隨著溶液pH值的增大，體系熒光強度迅速減弱。這是因為恩諾沙星分子結構中有3-羧基-4-氧喹諾酮環(huán)系，在7位有一個哌嗪取代基團，分子里的N原子和O原子在不同的pH值環(huán)境里的質(zhì)子化的程度將直接影響著體系的電子性質(zhì)以及電子云分布，所以不同的pH值會對體系的熒光強度產(chǎn)生很大的影響[8]。同時恩諾沙星分子結構中還有一個羧基，當pH值較高時，稀土元素如釔離子可能會形成稀土氫氧化物而影響其配位平衡，并以沉淀的形式析出，因此實驗中釔-恩諾沙星溶液體系的pH值選擇6。

2.3.2 Y3+濃度對釔-恩諾沙星體系熒光強度的影響

在7個50 ml的容量瓶中分別加入1 ml 0.001 g/l恩諾沙星標準溶液，加入不同體積的0.2 g/l Y3+溶液，調(diào)整溶液的pH=6并用0.1 mol/l Tris-HCl定容，使7份溶液中釔離子的濃度分別為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.040 g/l，在1.2節(jié)的實驗條件下測量溶液的熒光強度，以釔離子的濃度為橫坐標，溶液的熒光強度為縱坐標做曲線，所得曲線如圖6所示。

圖6 Y3+濃度對釔-恩諾沙星體系熒光強度的影響

由圖6可知，溶液中Y3+濃度在0.005～0.020 g/l的范圍時，隨著Y3+濃度的增加，釔-恩諾沙星體系的熒光強度逐漸增強，當Y3+濃度為0.020 g/l時熒光強度最大，之后隨著Y3+濃度的增加，熒光強度逐漸趨于穩(wěn)定。這主要是因為隨著Y3+濃度的增加，Y3+和恩諾沙星形成配合物的濃度越來越高，當Y3+濃度達到一定值時，Y3+和恩諾沙星絡合的程度趨于飽和狀態(tài)，其熒光強度也隨之趨于穩(wěn)定。所以實驗中選擇Y3+的濃度為0.02 g/l。

2.3.3 反應時間對釔-恩諾沙星體系熒光強度的影響

在6個50 ml容量瓶中加入1 ml 0.001 0 g/l恩諾沙星標準溶液、1 ml 1 g/l Y3+溶液，調(diào)整溶液的pH=6并用Tris-HCl溶液定容，使體系中恩諾沙星標的濃度為0.020 mg/l，Y3+的濃度為 0.020 g/l。將容量瓶在室溫條件下振蕩反應10、20、30、40、50、60 min，反應結束后在1.2節(jié)的實驗條件下測量溶液的熒光強度，以反應時間為橫坐標，溶液的熒光強度為縱坐標做曲線，所得曲線如圖7所示。

圖7 反應時間對釔-恩諾沙星體系熒光強度的影響

由圖7可知，隨著反應時間的增加，溶液的熒光強度逐漸增強，且熒光強度在30 min時達到最大。這主要是因為Y3+和恩諾沙星絡合形成配合物需要一定的反應時間，所以隨著時間的增加，絡合程度越來越大，配合物濃度逐漸增加，熒光強度也隨之增大，在一定的時間后絡合反應達到平衡，熒光強度達到最大。再隨著反應時間的增加，有可能是配合物的穩(wěn)定性減弱，熒光強度也有所降低，因此實驗中選擇的反應時間是30 min。

2.3.4 反應溫度對釔-恩諾沙星體系熒光強度的影響

在4個50 ml的容量瓶中分別加入1 ml 0.001 0 g/l恩諾沙星標準溶液和1 ml 0.2 g/lY3+溶液，調(diào)整溶液的pH=6，溶液用0.1 mol/l Tris-HCl定容，然后將溶液分別放置在20、30、40、50℃不同溫度條件下的氣浴恒溫振蕩器中振蕩反應30 min，反應結束后在1.2的條件下測量溶液的熒光強度，以釔-恩諾沙星溶液體系的反應溫度為橫坐標，溶液的熒光強度為縱坐標做曲線，所得曲線如圖8所示。

圖8 反應溫度對釔-恩諾沙星體系熒光強度的影響

由圖8可知，隨著溫度的升高，溶液體系的熒光強度逐漸減弱，但其減弱程度不明顯。在20℃時的溫度條件下反應，溶液體系的熒光強度最大，為12.17；在溫度為50℃時的環(huán)境下反應，溶液的熒光強度最小，為9.85，因此，溫度的改變對于熒光強度的影響相對較小。且從圖8中也可以發(fā)現(xiàn)，在20～30℃的溫度范圍內(nèi)，釔-恩諾沙星體系的熒光強度變化不大。這主要是因為恩諾沙星與釔離子反應后，其體系的平面剛性結構更加穩(wěn)定，溫度的改變對釔-恩諾沙星體系的結構和性質(zhì)幾乎沒有影響，溫度改變以后，體系的熒光強度變化不大，因此實驗選擇的反應溫度在室溫下進行即可。

2.4 正交實驗

為了確定影響釔-恩諾沙星溶液體系熒光強度因素的主次，設計正交實驗對其進行驗證。正交實驗取四個主要影響因素（溶液體系的pH值、Y3+的濃度、反應時間、反應溫度），每個因素確定三個水平，設計四因素三水平正交實驗，對實驗條件進行更系統(tǒng)的優(yōu)化分析。對于四因素三水平的實驗，可選擇L9(34)正交實驗表格，正交試驗的因素和水平設計見表1，正交實驗結果見表2。

表1 正交試驗設計

表2 L9(34)正交試驗結果

正交實驗的優(yōu)選方案是指在所做的實驗范圍內(nèi)，各因素較優(yōu)的水平組合。各因素優(yōu)水平的確定與實驗指標有關，本實驗的指標為溶液的熒光強度F，熒光強度越大表示該因素的水平越好，即各列K值中最大值對應的水平。i表示任一列水平號（實驗中i=1，2，3）時，Ki表示相應水平所對應的實驗結果之和。R為極差，在任一列上，極差R=max(Ki)-min(Ki)。一般來說，各列的極差是不相等的，這說明各因素的水平改變對實驗結果的影響是不相同的，極差越大，就是對實驗結果影響最大的因素，也是最主要的因素。

據(jù)表2可知，根據(jù)各因素的K值，溶液體系應選擇的最佳水平為pH=6，Y3+溶液的濃度為0.020 g/l，反應時間30 min，反應溫度在室溫條件下即可，該結論與單因素實驗是一致的。根據(jù) RA＞RC＞RB＞RD可知，pH值為最主要影響因素，反應溫度對結果的影響最小。

2.5 線性關系和檢出限

將濃度為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/l釔-恩諾沙星標準溶液，按照1.2的分析測定方法進行分析，以熒光強度（F）對濃度（c）作線性回歸，線性方程式、線性相關系數(shù)R2、相對標準偏差、檢出限、加標回收率等見表3。

表3 精密度試驗數(shù)據(jù)

2.6 樣品中目標物的提取和分析測定

準確稱取市售仔豬飼料2.000 0 g于100 ml碘量瓶中，加入20 ml乙腈，用封口膜封口以防止提取過程中溶劑揮發(fā)，磁力攪拌30 min以將目標物充分提取，將攪拌后的混合物放入15 ml離心管中，以4 000 r/min的速度離心30 min，將離心后得到的上清液轉移至圓底燒瓶中旋蒸至干。因市售樣品中的恩諾沙星含量較低，為了檢測到其具體的含量，在圓底燒瓶中加入1 ml 0.1 g/l Y3+溶液，使其和恩諾沙星形成絡合物以增強熒光強度，調(diào)整混合溶液的pH=6，用0.1 mol/l Tris-HCl溶液定容至5 ml，室溫下震蕩反應30 min，所得溶液用一次性有機濾膜過濾以除去溶液中的固體顆粒，過濾后的溶液按照1.2的分析測定方法待測。

為了確定市售仔豬飼料樣品中是否含有恩諾沙星，將過濾后的溶液按照1.2的光譜條件和測定方法進行發(fā)射光譜掃描，將得到的譜圖和恩諾沙星標準溶液的譜圖進行對比，所得對比譜圖見圖9。

圖9 飼料樣品和標準溶液的熒光光譜圖

由圖9可知，市售仔豬飼料樣品和釔-恩諾沙星標準溶液的熒光光譜，在波長441 nm處有一個相同的發(fā)射峰，說明此飼料樣品中含有恩諾沙星。將過濾后的溶液在1.2節(jié)的條件下分析檢測，根據(jù)線性方程進行樣品中恩諾沙星含量的計算，得此市售仔豬飼料樣品中恩諾沙星的含量是0.295 mg/kg。

3 結論

本實驗主要研究了釔離子對恩諾沙星熒光強度的增敏效果，探討了溶液的pH值，釔離子濃度，反應時間和反應溫度等因素對釔-恩諾沙星溶液體系熒光強度的影響。實驗結果表明，在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為277 nm和441 nm下對釔-恩諾沙星溶液體系進行熒光分析檢測，溶液的pH值為最主要影響因素，確定了溶液體系的最佳實驗條件為溶液的pH=6，Y3+溶液濃度為0.02 g/l，反應時間為30 min，反應溫度室溫即可。在以上條件下，釔離子對恩諾沙星的熒光強度有非常明顯的增敏效果。該方法在0～0.25 mg/l的濃度范圍內(nèi)線性良好，其線性相關系數(shù)R2為0.998 9，相對標準偏差RSD為5.6%(n=11)，方法的檢測限為1.02 μg/l，平均加標回收率為103.1%。用該方法對市售飼料樣品中的恩諾沙星進行分析檢測，穩(wěn)定可靠，分析結果良好。