■宋云皓 滿都拉 郜晉楠 段開(kāi)紅 田瑞華

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

內(nèi)蒙古自治區(qū)是我國(guó)玉米種植大省，占全國(guó)玉米生產(chǎn)的10%。2015年，內(nèi)蒙古自治區(qū)玉米種植總面積約為5 111萬(wàn)畝。一般粒用玉米畝產(chǎn)秸稈3～5 t，按此計(jì)算，2015年內(nèi)蒙古自治區(qū)玉米秸稈產(chǎn)量約為1.5～2.6億噸[1]。由于地理及氣候特點(diǎn)，內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)業(yè)和牧業(yè)生產(chǎn)具有明顯的地域性差異。玉米種植區(qū)主要集中在通遼市、興安盟、赤峰市及烏蘭察布盟等地區(qū)，而牧區(qū)主要集中在呼倫貝爾盟、錫林郭勒盟及阿拉善盟。一方面，由于氣候的變化，天然草地的退化及過(guò)度放牧，牧業(yè)區(qū)對(duì)飼草料的需求逐年增加。另一方面，可作為飼料的秸稈在農(nóng)業(yè)區(qū)的主要利用方式為生活能源燃料，沒(méi)有做到物盡其用。因此，對(duì)于內(nèi)蒙古地區(qū)的玉米秸稈的利用方式應(yīng)以飼用為主。但是，由于玉米秸稈的組成大部分為纖維素類物質(zhì)，其中含約37%的纖維素、17%的半纖維素及28%的木質(zhì)素（占干物質(zhì)重）[2]，導(dǎo)致直接飼用后大部分未被吸收而直接排出，利用率較低[3]。大量研究表明，對(duì)秸稈進(jìn)行預(yù)處理能夠疏松其結(jié)構(gòu)，增加采食量，提高秸稈飼用效率[4-5]。

目前，玉米秸稈的處理方式有酸堿化學(xué)處理法[6-8]，粉碎物理處理法[9]以及生物處理法[10-14]等。其中，由于生物處理法具有使秸稈纖維素含量下降、提升蛋白含量、操作簡(jiǎn)便及環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，在研究秸稈飼用領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[15]。生物處理法是利用微生物產(chǎn)生的纖維素降解酶作用于纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素，從而達(dá)到使玉米秸稈結(jié)構(gòu)疏松的目的。且相關(guān)微生物之間復(fù)配能顯著提高秸稈降解能力[16-18]，軟化秸稈[19]，提高牛羊的進(jìn)食率[20]。

基于內(nèi)蒙古自治區(qū)秸稈利用方式及氣候特點(diǎn)，本研究從內(nèi)蒙古自治區(qū)東部（通遼和赤峰）篩選纖維素降解菌，并對(duì)其進(jìn)行復(fù)配，構(gòu)建復(fù)合菌系，為進(jìn)一步提高玉米秸稈飼用推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣品采自內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市及通遼市郊區(qū)的腐爛玉米秸稈、牛羊圈土壤。土樣品過(guò)20目篩，與秸稈樣品分別裝入無(wú)菌袋帶回并保存于4℃冰箱中。

富集培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）5.0 g、秸稈粉 5.0 g、K2HPO41.0 g、MgSO40.5 g、(NH4)2SO42.0 g、NaCl 0.5 g、牛肉膏0.5 g、胰蛋白胨1.0 g、蒸餾水1 000 ml，pH值自然。

篩選培養(yǎng)基：K2HPO41.0 g、MgSO40.5 g、NaCl 0.5 g、(NH4)2SO42.0 g、蒸餾水1 000 ml，取10 ml裝入50 ml試管中，再向試管中加入濾紙條（剪為5×0.7 cm），紙條貼在內(nèi)壁上，一半浸入培養(yǎng)基液面以下。

分離培養(yǎng)基：CMC-Na 5.0 g、K2HPO41.0 g、MgSO40.5 g、(NH4)2SO42.0 g、NaCl 0.5 g、剛果紅0.5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 ml，pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 10.0 g、K2HPO41.0 g、Mg-SO40.5 g、(NH4)2SO42.0 g、NaCl 2.5 g、牛肉膏 2.5 g、胰蛋白胨 5.0 g、蒸餾水 1 000 ml，pH值自然。

1.2 秸稈中兼性厭氧菌的篩選及分離純化

將樣品裝入250 ml三角瓶中，加滿水至瓶口，封口膜封口，30℃靜置培養(yǎng)3 d。吸取10 ml培養(yǎng)液加入富集培養(yǎng)基中（250 ml三角瓶加200 ml），30℃下富集培養(yǎng)3 d。

吸取富集培養(yǎng)物1 ml加入篩選培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2周。選擇濾紙崩解程度較高的試管稀釋至10-6、10-7、10-8梯度，將菌液涂布在分離培養(yǎng)基上，再倒一層瓊脂，30℃培養(yǎng)3 d。待雙層平板長(zhǎng)出單菌落后，用接種針挑取產(chǎn)生剛果紅透明圈的菌株，接種到分離培養(yǎng)基后30℃培養(yǎng)3 d。在菌落周圍能產(chǎn)生透明圈的證明該菌株具有分解纖維素能力。

1.3 指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1 酶活的測(cè)定

將篩得菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)5 d，將發(fā)酵液在4℃、6 000 r/min、10 min后收集上清液即為粗酶液，利用3，5二硝基水楊酸法（DNS法）測(cè)定發(fā)酵液的酶活[21]。

1.3.2 秸稈中粗纖維含量的測(cè)定

按照國(guó)標(biāo)（GB/T 6434-2006）中的方法測(cè)定秸稈中粗纖維的含量。

1.4 菌種鑒定與構(gòu)建復(fù)合菌系

利用平板劃線法分離單菌落后觀察其菌落形態(tài)特征。利用引物27F和1492R擴(kuò)增所篩微生物16S rDNA，送測(cè)序公司測(cè)序后，將序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果及形態(tài)特征確定所篩菌株的種屬。

將兩種不同的菌株采用兩兩相交劃線的方法接種于拮抗培養(yǎng)基中，得到菌株間拮抗關(guān)系后，結(jié)合酶活結(jié)果構(gòu)建復(fù)合菌系。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，視為處理之間差異顯著。數(shù)據(jù)分析及繪圖利用Office Excel 2015完成。進(jìn)化樹(shù)利用MAGA 6.0完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素分解菌的篩選

通過(guò)對(duì)樣品富集培養(yǎng)后，分離純化出具有纖維素分解能力菌57株，并根據(jù)酶活初步篩選出14株有CMC酶活的菌株，觀察菌落形態(tài)（如表1所示）。由表1可以看出，無(wú)色透明菌落的檢出率較高，形態(tài)特征多樣。菌株8-2的CMC酶活較高，但沒(méi)有透明圈產(chǎn)生。菌株9、菌株6-4的CMC酶活很低，但有透明圈產(chǎn)生，可見(jiàn)透明圈大小只能初步反映出菌株的酶活高低。通過(guò)酶活大小的比較得出，直接從干玉米樣品中篩菌所得到的菌株CMC酶活均不高，這可能是由于干樣品中缺少水分，不利于菌株的存活。CMC酶活較高的菌株大多為在田地中有腐爛根莖的土樣中所篩得。這與吳文韜[22]和李波[23]等人的結(jié)果類似。由于菌株6-4、菌株9、菌株12、菌株14-5這4株菌較其他菌株酶活較低，因此不對(duì)此4株菌進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

表1 所篩菌株的酶活、透明圈直徑及形態(tài)

2.2 16S rDNA序列分析

通過(guò)NCBI在線比對(duì)，株菌3-4、14-1、2-4和菌株6-9屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），Blast比對(duì)相似度均為99%，酶活相對(duì)較高，這與張斯童等人的結(jié)果類似[24]。1-3、8-2和6-2屬于腸桿菌屬（Enterobacter），Blast比對(duì)相似度為98%、99%和99%。菌株5-2、11-2和菌株10分別屬于非脫羧勒克菌屬（Leclercia adecarboxylata）、泛菌屬（Pantoea）及檸檬酸菌屬（Citrobacter），Blast比對(duì)相似度均為99%。各菌株進(jìn)化關(guān)系如圖1所示。

由于真菌和放線菌有較高的纖維素酶活[25]，如魏亞琴等[26]篩選出來(lái)的菌株CMC-Na酶活可高達(dá)1 181 U。但是，真菌及放線菌的生長(zhǎng)較細(xì)菌緩慢且副產(chǎn)物多，且對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化改造較難。因此本研究針對(duì)性的篩選降解纖維素細(xì)菌。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出（圖1），具有較高CMC-Na酶活的菌株大部分為芽孢桿菌屬。有研究表明[27]，芽孢桿菌在作為飼料添加劑時(shí)，可以產(chǎn)生較多的生物熱，具有耐酸、耐高溫能力，在進(jìn)入動(dòng)物腸道后可以成為營(yíng)養(yǎng)性細(xì)菌、提高飼用率、增強(qiáng)動(dòng)物免疫力。因此，在下一步構(gòu)建復(fù)合菌系時(shí)，以芽孢桿菌屬菌株為主，配以其他菌屬細(xì)菌，從而達(dá)到提高酶活的目的。

2.3 復(fù)合菌系的構(gòu)建及秸稈發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將所篩菌株兩兩劃線接種于無(wú)剛果紅的分離培養(yǎng)基中，觀察線跡有無(wú)萎縮斷開(kāi)現(xiàn)象（結(jié)果如表2所示）。根據(jù)各菌株之間的拮抗結(jié)果利用無(wú)拮抗作用的菌株構(gòu)建復(fù)合菌系。

微生物的拮抗作用是指一種微生物在其生命活動(dòng)中產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物或改變環(huán)境條件，從而對(duì)其他微生物產(chǎn)生抑制或毒害作用[28]，而芽孢桿菌本身就有較強(qiáng)的抑菌活力[29]，所以本實(shí)驗(yàn)中與芽孢桿菌出現(xiàn)的拮抗作用的菌株較多。

根據(jù)拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果，構(gòu)建5組復(fù)合菌系A(chǔ):1-3、5-2、6-2和11-2；B:3-4、6-9、5-2和8-2；C:2-4、5-2、8-2和11-2；D:10、2-4和8-2；E:14-1、3-4和8-2。在李靜等[30]的研究中，通過(guò)對(duì)Paenibacillus、Bacillus、Acinetobacter來(lái)進(jìn)行復(fù)配，得到的結(jié)果為復(fù)合菌系比單菌株對(duì)秸稈的降解率相比提高了50.71%。由此可見(jiàn)利用構(gòu)建復(fù)合菌系的方法可以在提高秸稈降解率的過(guò)程中起到十分關(guān)鍵的作用。

利用DNS法分別測(cè)定5組菌系酶活（見(jiàn)圖2）后發(fā)現(xiàn)，菌系B的酶活最高。大量的研究表明[31-34]，Bacillus是高效的纖維素分解菌，Shrinivas[35]和Kumar等[36]指出，Bacillus可以分泌出降解纖維素的酶，促進(jìn)纖維素降解。從結(jié)果來(lái)看，雖然Enterobacter構(gòu)成的菌系酶活較低，但在由Bacillus和Enterobacter構(gòu)成的菌系中酶活的提升較為明顯。因此，在菌系的構(gòu)成時(shí)，酶活較低的Enterobacter也起到了顯著的作用。

圖1 所篩纖維素降解菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表2 所篩纖維素降解菌的拮抗性

圖2 復(fù)合菌系的酶活

以1%接種量將復(fù)合菌系接入含水率為70%的玉米秸稈后，真空密封，置于30℃發(fā)酵。7 d后測(cè)得秸稈中的粗纖維降解率達(dá)到了48.6%。

目前內(nèi)蒙古自治區(qū)對(duì)玉米秸稈的處理方式主要以就地焚燒為主，這不僅會(huì)污染空氣、浪費(fèi)資源，而且由于在焚燒的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生高溫破壞土壤內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)，為來(lái)年的生產(chǎn)造成困難，所以如何科學(xué)地利用玉米秸稈是本研究的核心。本研究針對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)的特點(diǎn)提出了秸稈飼用的觀點(diǎn)并分離與純化玉米秸稈纖維素降解菌、構(gòu)建復(fù)合菌系，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)內(nèi)蒙古自治區(qū)玉米秸稈飼用資源奠定基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

以內(nèi)蒙古東部地區(qū)為研究區(qū)域，分離純化出10株具有較高CMC酶活的纖維素降解菌1-3、2-4、3-4、5-2、6-2、6-9、8-2、10、11-2和14-1。并進(jìn)一步構(gòu)建了復(fù)合菌系A(chǔ):1-3、5-2、6-2、11-2；B:3-4、6-9、5-2、8-2；C:2-4、5-2、8-2、11-2；D:10、2-4、8-2和E:14-1、3-4、8-2。其中菌系B的CMC酶活較菌株3-4（所篩菌株中酶活最高）提高了105.07%，可見(jiàn)，復(fù)合菌系能夠顯著提高酶活力。玉米秸稈發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，復(fù)合菌系B處理過(guò)的秸稈粗纖維降解率達(dá)到了48.6%。