■牛東澤 鄭明利 左颯颯 江 迪 徐春城

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083)

苜蓿(Medicago sativa)富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，而且適口性好、消化率高，是奶牛日糧中不可或缺的組成部分。近年來，國(guó)家高度重視苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，2012年中央“一號(hào)文件”發(fā)起“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動(dòng)”，隨后，在2015年中央“一號(hào)文件”又明確提出：加快發(fā)展草牧業(yè)，支持青貯玉米和苜蓿等飼草料的種植。目前，苜蓿生產(chǎn)的主要產(chǎn)品是干草，但是由于氣候、管理等原因，我國(guó)許多地方苜蓿干草的調(diào)制過程中都存在雨淋、落葉等損失，一般損失率達(dá)30%左右。將新鮮苜蓿進(jìn)行青貯，不僅可以減少苜蓿的營(yíng)養(yǎng)損失，最大限度保持苜蓿營(yíng)養(yǎng)成分，還可以改善苜蓿的適口性，提高消化率，延長(zhǎng)供應(yīng)周期，對(duì)苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

由于新鮮苜蓿中干物質(zhì)(DM)和可溶性碳水化合物(WSC)含量較低，緩沖能(BC)較高，采用常規(guī)青貯技術(shù)很難調(diào)制出優(yōu)質(zhì)青貯飼料。為了抑制發(fā)酵過程中不良微生物的生長(zhǎng)繁殖，在生產(chǎn)中常常采用與禾本科牧草混貯、萎蔫和添加劑處理等方式，以調(diào)制出發(fā)酵品質(zhì)和適口性更好的青貯飼料。乳酸菌是最常用的青貯添加劑之一，添加乳酸菌后可以改善原料中微生物的組成，提高發(fā)酵速度，抑制有害微生物的生長(zhǎng)，顯著改善發(fā)酵品質(zhì)。然而，接種乳酸菌添加劑并非制備優(yōu)質(zhì)青貯飼料的充分條件，Weinberg等認(rèn)為，較高的DM和WSC含量是乳酸菌接種劑提高青貯發(fā)酵品質(zhì)的必要條件，因此在青貯實(shí)踐中，乳酸菌添加劑常與蔗糖、糖蜜等富含WSC的物質(zhì)混合使用。玉米粉，作為一種常規(guī)精飼料，具有來源廣泛、成本低、易保藏等優(yōu)點(diǎn)。研究證明，玉米粉與苜蓿、巴納草(Pennisetum purpureum)等牧草混合青貯，能顯著提高牧草的發(fā)酵品質(zhì)。Jones研究認(rèn)為，多數(shù)乳酸菌不能利用谷物中的淀粉，谷物類添加劑對(duì)發(fā)酵品質(zhì)的改善，主要是由谷物中約3%～4%的WSC或β-葡聚糖等低聚糖水解引起的。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中若要達(dá)到較好的青貯品質(zhì)，往往需要較大的添加量。

近年來，一些關(guān)于能夠分解淀粉的乳酸菌的研究受到人們的重視。Nakamura從牛場(chǎng)廢料和玉米的混合發(fā)酵物中分離出一株具有分解淀粉能力的乳酸菌新種，并定名為食淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorus)。此后Fitzsimons等進(jìn)行了食淀粉乳桿菌(L.amylovorus)、嗜淀粉乳桿菌(L.amylophilus)和植物乳桿菌(L.plantarum)的生理特性對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果表明，L.amylovorus不僅具有與L.plantarum相似的生長(zhǎng)特點(diǎn)，而且能分泌在青貯pH值范圍內(nèi)具有最佳活性的淀粉酶，但L.amylophilus分泌的淀粉酶在該條件下活性很低。雖然L.amylovorus具有上述優(yōu)良特性，但目前對(duì)于該菌的報(bào)道僅限于小麥青貯和食品副產(chǎn)物的乳酸發(fā)酵中，而在苜蓿青貯中的應(yīng)用，尤其是與淀粉類添加劑混合使用的研究未見報(bào)道。

本研究通過向苜蓿中添加玉米粉和具有淀粉分解能力的L.amylovorus，研究不同玉米粉添加量和3株L.amylovorus對(duì)苜蓿發(fā)酵品質(zhì)的影響，以及二者混合添加的交互作用，以期為苜蓿的青貯實(shí)踐提供理論指導(dǎo)和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 青貯原料

青貯原料來源于北京市農(nóng)林科學(xué)院(北京市昌平區(qū))種植的第3茬苜蓿(中苜1號(hào))，初花期刈割，原料的化學(xué)成分及微生物組成如表1所示。

1.1.2 添加劑

乳酸菌：本課題組自優(yōu)質(zhì)青貯中分離純化的3株L.amylovorus，分別為L(zhǎng).amylovorusKM112088(L1)、L.amylovorusKM112091(L2)和L.amylovorusKM112089(L3)。

玉米粉：市售玉米粉，粉碎后過500 μm篩。

表1 苜蓿原料的化學(xué)成分和微生物組成

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用析因設(shè)計(jì)(Factorial design)，選取玉米粉添加量和乳酸菌菌株兩個(gè)因素，其中玉米粉添加量為：0%、3%、6%、9%(鮮重)；乳酸菌菌株為：對(duì)照組(蒸餾水)、L1、L2、L3，共16個(gè)處理(4×4)，每個(gè)處理 3 個(gè)重復(fù)，共計(jì)48袋，青貯35 d后開封。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 青貯飼料的調(diào)制

將原料切碎至1～2 cm，分成4等份，每份2 400 g，分別按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)量添加玉米粉，充分混勻后，再平均分成4等份，分別添加106cfu/g的乳酸菌L1、L2、L3和等量的蒸餾水(對(duì)照)，混勻后，裝入青貯專用真空包裝袋中，每袋200 g，抽真空密封，26～32℃條件下室內(nèi)保存。

1.3.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱取10 g原料或青貯飼料，裝入滅菌自封袋中，加入90 ml滅菌水，充分震蕩、浸提，將提取液用滅菌水進(jìn)行10倍梯度稀釋后進(jìn)行微生物分析。剩余樣品過濾，制得浸提液，測(cè)定pH值后，置于-20℃冰箱中，冷凍存放，用于測(cè)定有機(jī)酸和氨態(tài)氮(NH3-N)。另準(zhǔn)確稱取3份切碎的原料或青貯飼料約150 g(精確到0.01 g)，在65℃條件下，烘干48 h，測(cè)定水分含量。樣品粉碎后過1 mm篩，用于測(cè)定粗蛋白質(zhì)(CP)、NDF、ADF、WSC等物質(zhì)含量。

1.3.3 微生物、發(fā)酵品質(zhì)及化學(xué)成分分析

乳酸菌采用MRS培養(yǎng)基(Difco，美國(guó))，在厭氧培養(yǎng)箱中，37℃條件下，培養(yǎng)48 h進(jìn)行計(jì)數(shù)；酵母菌采用添加酒石酸的馬鈴薯葡糖瓊脂培養(yǎng)基(Nissui，日本)，在28℃條件下培養(yǎng)48 h進(jìn)行計(jì)數(shù)；好氧細(xì)菌和腸細(xì)菌分別采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Nissui，日本)和BLB培養(yǎng)基(Nissui，日本)在37℃條件下，培養(yǎng)24 h進(jìn)行計(jì)數(shù)。pH值用Mettler toledo S20pH測(cè)定儀測(cè)定；WSC采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定；淀粉含量的測(cè)定參照J(rèn)ones的方法，糊化后，用高氯酸(HClO4)水解提取測(cè)定；NH3-N采用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定；有機(jī)酸含量采用高效液相色譜儀(日本島津LC-20A型，色譜柱：Shodex KC-811，流動(dòng)相：3 mmol/l高氯酸溶液，流速：1 ml/min，進(jìn)樣量：5 μl，柱溫：50 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm)進(jìn)行測(cè)定；DM采用烘干法測(cè)定；CP由KDY-9830型凱氏定氮儀測(cè)定；NDF、ADF采用范式纖維法，在ANKOM 2000i纖維測(cè)定儀中進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，根據(jù)析因設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)分析原理，采用SPSS 20.0的一般線性模型(GLM)對(duì)玉米粉、乳酸菌及二者交互作用進(jìn)行分析，并用Duncan's方法對(duì)處理間平均數(shù)進(jìn)行多重比較(P＜0.05)，選取交互作用顯著的指標(biāo)進(jìn)行精細(xì)比較，并在Sigma-Plot 12.5中作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加玉米粉對(duì)苜蓿青貯品質(zhì)及化學(xué)成分的影響

經(jīng)過35 d青貯后，苜蓿單獨(dú)青貯的pH值、丁酸和NH3-N含量均較高，而乳酸含量與乳酸和乙酸比例均較低，青貯品質(zhì)較差(見圖1)。單獨(dú)添加玉米粉后，乳酸含量顯著(P＜0.05)升高，pH值、NH3-N含量顯著(P＜0.05)降低，青貯品質(zhì)得到明顯改善。根據(jù)析因設(shè)計(jì)的分析原理，將玉米粉添加量作為主效應(yīng)進(jìn)行分析(見表2)。結(jié)果表明，玉米粉添加對(duì)各項(xiàng)發(fā)酵指標(biāo)均有極顯著影響(P＜0.001)，隨著玉米粉添加量的增加，乙酸含量顯著降低(P＜0.05)，乳酸與乙酸顯著升高(P＜0.05)，6%和9%玉米粉處理組NH3-N含量顯著低于3%玉米粉處理組(P＜0.05)，但不同玉米粉添加量對(duì)乳酸、丁酸含量沒有顯著(P＜0.05)影響。添加玉米粉顯著提高了苜蓿青貯中DM、WSC、淀粉的含量(P＜0.05)，且隨著添加量的增加而升高（WSC除外）(表3)；相反，CP、NDF、ADF的含量隨著添加量增加而顯著減少(P＜0.05)。

2.2 添加食淀粉乳桿菌對(duì)苜蓿青貯品質(zhì)及化學(xué)成分的影響

圖1 玉米粉和食淀粉乳桿菌處理對(duì)苜蓿青貯35 d后發(fā)酵品質(zhì)的影響

表2 玉米粉和食淀粉乳桿菌處理對(duì)苜蓿青貯35 d后發(fā)酵品質(zhì)的影響

在單獨(dú)添加L.amylovorus的苜蓿青貯中，L2處理組的pH值、NH3-N的含量分別為4.69、7.99%，顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，乳酸含量、乳酸和乙比酸例與其它處理組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）(見圖1)；而L1和L3處理組的pH值、乳酸和NH3-N含量與對(duì)照組相比，均無(wú)明顯改善。根據(jù)析因設(shè)計(jì)的分析原理，將不同乳酸菌菌株作為主效應(yīng)進(jìn)行分析(見表2)。結(jié)果表明，L1、L2處理組，pH值、乙酸、丁酸和NH3-N含量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，乳酸含量和乳酸與乙酸比例顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，其中L2處理組pH值、乳酸、乙酸和氨態(tài)氮含量均顯著低于L1處理組(P＜0.05)，乳酸與乙酸的比例顯著(P＜0.05)高于L1處理組。L3處理組除丁酸含量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，NH3-N與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異外(P＞0.05)，其他各項(xiàng)發(fā)酵指標(biāo)均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。在添加不同乳酸菌后，L2處理組，DM、WSC、NDF、ADF的含量顯著(P＜0.05)高于其他乳酸菌處理組(P＜0.05)，淀粉和CP的含量顯著低于其他乳酸菌處理組。

表3 玉米粉和食淀粉乳桿菌處理對(duì)苜蓿青貯35 d后化學(xué)成分的影響

2.3 玉米粉和食淀粉乳酸桿菌對(duì)苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)及化學(xué)成分的交互作用

如表2所示，玉米粉和L.amylovorus復(fù)合處理對(duì)青貯苜蓿的pH值、乳酸含量、乳酸與乙酸比例、NH3-N含量以及淀粉含量等指標(biāo)均存在顯著的交互作用(P＜0.05)。因此在分別對(duì)玉米粉添加量和乳酸菌菌株2個(gè)主效應(yīng)進(jìn)行分析后，本研究又對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行了精細(xì)比較并作圖。結(jié)果表明，在3%、6%和9%玉米粉添加組中，L1和L2處理組的pH值含量均顯著(P＜0.05)低于單獨(dú)添加玉米粉組和L3處理組(見圖1)。在3%玉米粉添加量時(shí)，L1、L2處理組乳酸含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，其中L1處理組乳酸含量最高，為8.57%，但是二者乳酸與乙酸比例沒有顯著差異；L3處理組乳酸含量、乳酸與乙酸比例均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。在添加不同玉米粉處理組中，L1、L2處理組乳酸含量和乳酸與乙酸比例，均顯著高于其他處理組(P＜0.05)，其中6%玉米粉處理組乳酸含量最高，分別為9.75%和9.37%，9%玉米粉處理組乳酸與乙酸比例最高，分別為13.01和13.24。在所有處理中，玉米粉和L2復(fù)合處理組NH3-N含量最低，且9%處理組的氨態(tài)氮含量顯著低于其它處理組(P＜0.05)。在未添加玉米粉處理組，3株乳酸菌處理后其淀粉含量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(見圖2)(P＞0.05)；在添加3%玉米粉后，L3處理組淀粉含量雖然顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，但是顯著高于 L1、L2處理組(P＜0.05)；在 6%玉米粉添加后，與3%玉米粉處理組不同的是，L1處理組淀粉含量顯著高于L2處理組(P＜0.05)；而9%玉米粉處理后，L3處理組淀粉含量與對(duì)照組相比沒有顯著差異(P＜0.05)。

圖2 玉米粉和食淀粉乳桿菌處理對(duì)苜蓿青貯35 d后淀粉含量的影響

3 討論

3.1 添加玉米粉對(duì)苜蓿青貯品質(zhì)的影響

本研究中，苜蓿直接青貯的發(fā)酵品質(zhì)較差，添加玉米粉后，其發(fā)酵品質(zhì)得到顯著改善，尤其是乳酸含量和乳酸與乙酸比例得到顯著提升，這主要是由于玉米粉中含有較高的DM和WSC，添加后對(duì)青貯原料的特性有顯著的改善作用，而DM和WSC的比例會(huì)直接影響青貯的品質(zhì)和效果。雖然不同玉米粉添加量對(duì)苜蓿青貯的pH值、乳酸、丁酸含量的影響不顯著，但乙酸和NH3-N含量顯著降低，乳酸與乙酸比例顯著升高，這與Jones的研究結(jié)果類似，這可能是由于較高的玉米粉添加，對(duì)DM和WSC含量的提升作用更明顯，因此加速了發(fā)酵過程，進(jìn)而有效抑制不良發(fā)酵的進(jìn)行。

3.2 添加食淀粉乳桿菌對(duì)苜蓿青貯品質(zhì)的影響

許多研究表明，向青貯料中添加一定量的優(yōu)質(zhì)乳酸菌，不僅可加速發(fā)酵過程，還能改變青貯飼料的乳酸菌發(fā)酵類型，有效地抑制梭菌等不良微生物的活動(dòng)，保證青貯飼料的質(zhì)量和安全。本研究中，L2處理組乳酸與乙酸比值最高，L1的比值次之，而L3處理組乳酸與乙酸比值最低，僅為2.43，其pH值和乙酸含量均顯著高于L1、L2處理組（見表2），這表明該組處理中異型乳酸發(fā)酵強(qiáng)于其他組，這可能是由于不同菌株之間的乳酸代謝的差異引起的。此外，L3處理組，NH3-N含量顯著高于其他乳酸菌處理組，這表明該處理組蛋白質(zhì)分解較多，青貯質(zhì)量較差。青貯過程中，蛋白質(zhì)的分解主要受牧草的種類、pH值、DM和發(fā)酵溫度的影響，L3處理組乳酸含量顯著低于其他處理組，pH值顯著高于其他處理組，因此推斷其在發(fā)酵過程中pH值下降緩慢，導(dǎo)致蛋白大量分解，因此產(chǎn)生較多的NH3-N。

在單純添加106cfu/g的L.amylovorus組中，僅L2顯著降低苜蓿青貯的pH值，而L1和L3處理組與對(duì)照組相比沒有顯著改善，這可能是由于只有在DM和WSC含量足夠高的情況下，接種乳酸菌才能顯著改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，而新鮮苜蓿中DM和WSC含量均較低，因此乳酸菌接種后沒有效果或改善效果有限。雖然所用乳酸菌具備解淀粉能力，但是本研究所用苜蓿中淀粉含量較低，青貯前后，淀粉含量?jī)H有輕微變化，因此對(duì)苜蓿發(fā)酵品質(zhì)的改善作用有限。

3.3 添加食淀粉乳桿菌對(duì)苜蓿青貯中淀粉含量的影響

Owens等研究表明，在1 d中，苜蓿中淀粉含量隨著收割時(shí)間的延遲而增加，但其在收割后萎蔫的過程中會(huì)被植物組織迅速代謝到1%以下，且在青貯前后變化很小。因此，雖然乳酸菌L2具有優(yōu)良的發(fā)酵性能和分解淀粉的能力，但是單獨(dú)添加該乳酸菌，并不能充分利用該菌分解淀粉能力的優(yōu)良特性。

玉米粉和乳酸菌復(fù)合處理組的淀粉含量顯著低于同水平玉米粉添加組，這可能是發(fā)酵過程中淀粉被轉(zhuǎn)化為可溶性糖，被乳酸菌發(fā)酵利用，因此復(fù)合處理組發(fā)酵品質(zhì)顯著優(yōu)于二者單獨(dú)處理組。在添加的3株乳酸菌中，L3分解淀粉能力較差，尤其是9%玉米粉添加組，其淀粉含量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，這可能是由于該處理?xiàng)l件下，DM和WSC含量較高，pH值下降速度快，而該菌分泌的淀粉酶在酸性條件下活力較低，其pH值在密封后迅速失活導(dǎo)致的。在6%和9%玉米粉添加組，L2的淀粉含量均顯著低于L1處理組，然而3%玉米粉添加組，L1和L2處理后，其淀粉含量沒有顯著差異，這可能是由于在該條件下，淀粉含量較少，水解較充分導(dǎo)致的，因此在操作條件較差的情況下青貯時(shí)，可適當(dāng)提高玉米粉的添加量。乳酸菌L1和L2在較低的pH值范圍內(nèi)仍然具有較高的淀粉酶活性，這與Fitzsimons等的研究結(jié)果一致，而市售的α-淀粉酶則在青貯pH值范圍內(nèi)活力下降明顯，不能很好地在青貯中發(fā)揮作用，因此，在苜蓿青貯實(shí)踐中，可選擇能夠分泌耐酸淀粉酶的優(yōu)良L.amylovorus菌株和玉米粉混合使用，來提高苜蓿的青貯品質(zhì)。

4 結(jié)論

苜蓿中DM、WSC和淀粉含量較低，單獨(dú)青貯和添加L.amylovorus青貯發(fā)酵品質(zhì)均較差，而添加玉米粉，可以顯著提高苜蓿的發(fā)酵品質(zhì)，但是玉米粉中的淀粉不能被乳酸菌分解利用。復(fù)合添加玉米粉和L.amylovorus后，淀粉可有效被降解利用，對(duì)pH值、乳酸、氨態(tài)氮等發(fā)酵指標(biāo)有顯著的改善作用。此外，L.amylovorus分解淀粉酶的能力和產(chǎn)酸能力，在不同菌株間存在顯著差異，本試驗(yàn)所用3株L.amylovorus中L2的作用效果最好，L1次之，添加L3不能顯著提高苜蓿的青貯品質(zhì)。因此，在青貯實(shí)踐中，可以復(fù)合添加L1或L2和3%玉米粉，來改善青貯苜蓿的發(fā)酵品質(zhì)。

（參考文獻(xiàn)刊略，需者可函索ndz@cau.edu.cn）