陸琳，彭綠春，宋杰，李樹發(fā)，解瑋佳，李世峰

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南昆明650205）

不同高山杜鵑品種花粉活力測定及貯藏方法研究

陸琳，彭綠春，宋杰，李樹發(fā)，解瑋佳，李世峰

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南昆明650205）

以大白花杜鵑、XXL、亮葉杜鵑、馬纓花杜鵑和黃杯杜鵑為研究對象，采用花粉離體培養(yǎng)，比較不同的貯藏條件下花粉活力隨貯藏時間的變化情況。結(jié)果表明，不同杜鵑品種花粉培養(yǎng)基瓊脂均為0.7%，大白花杜鵑最適萌發(fā)培養(yǎng)基為：蔗糖50 g/L，硼酸50 mg/L，氯化鈣50 mg/L；馬纓花杜鵑最適萌發(fā)培養(yǎng)基為：蔗糖100 g/L，硼酸30 mg/L，氯化鈣30 mg/L；黃杯杜鵑、XXL和亮葉杜鵑最適萌發(fā)培養(yǎng)基均為：蔗糖100 g/L，硼酸0 mg/L，氯化鈣30 mg/L；不同品種的杜鵑花新鮮花粉萌發(fā)率差異較大，按花粉萌發(fā)率從大到小排序為黃杯杜鵑＞亮葉杜鵑＞大白花杜鵑＞XXL＞馬纓花杜鵑；黃杯杜鵑花花粉在4個不同溫度貯藏條件下花粉萌發(fā)率均比XXL和馬纓花杜鵑高，說明黃杯杜鵑花花粉的活力較強，在雜交育種中可以優(yōu)先考慮。

杜鵑花；花粉生活力；貯藏；萌發(fā)率

杜鵑花是世界上最重要的觀賞花卉之一，在全世界有900多個種，而在我國分布有近600種[1]，主要分布于西南地區(qū)的云南、西藏、四川省，這3個省共有400多種杜鵑花，占我國種類的近80%。云南是杜鵑花的世界分布中心之一，有著豐富的種質(zhì)資源[2-4]。大白花杜鵑（Rhododendron decorum）、亮葉杜鵑（Rhododendron vernicosum）、馬纓花杜鵑（Rhododendron delavayi Franch）、黃杯杜鵑（Rhododendron wardii）在云南省境內(nèi)分布廣泛，花大而鮮艷，葉常綠，株形美麗，具有較高的觀賞價值，應(yīng)用較為廣泛，不僅適宜種植于街道綠地和公園，也可作盆栽，布置花壇、花境、草地點綴等，是不可多得的園林花卉。XXL（Rhododendron XXL）是進口品種，也是目前市場上比較流行的品種。由于我國現(xiàn)有高山杜鵑的品種基本依賴于進口，致使其產(chǎn)業(yè)發(fā)展受到了嚴重制約，通過雜交育種的方法培育杜鵑花新品種意義重大。

雜交育種是培育杜鵑花新品種的重要手段之一，而雜交親本花粉生活力的高低直接影響著育種的成效，故研究花粉活力檢測方法對杜鵑花雜交育種研究很有必要。杜鵑花雜交育種中有應(yīng)用醋酸洋紅、TTC以及MTT染色法測定花粉活力的報道[5-8]，而MTT染色法測定結(jié)果與花粉體內(nèi)萌發(fā)率最為接近[9]。Brewbaker-Kwack培養(yǎng)基已被用于測定杜鵑花花粉活力[8]，該培養(yǎng)基適用于大多數(shù)的植物花粉培養(yǎng)。我國杜玉虎等[10]、瞿學(xué)杰等[11]、李俊英等[12]研究了果梅、雜交榛、大葉楊等植物的花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)，證明了花粉離體培養(yǎng)萌發(fā)法是一種比較簡便且較為準確的花粉活力檢測方法。張超儀等[13]、李玉萍等[14]對睫毛杜鵑、多鱗杜鵑、薄皮杜鵑、映山紅、馬銀花和比利時杜鵑等杜鵑花的花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基配方進行了研究，結(jié)果表明，不同杜鵑花種類的花粉離體培養(yǎng)配方并不相同。

本試驗以大白花杜鵑、亮葉杜鵑、馬纓花杜鵑、XXL和黃杯杜鵑為研究對象，在不同的貯藏條件下比較花粉活力隨貯藏時間的變化情況，從而了解花粉的適宜貯藏條件；通過對不同高山杜鵑品種花粉生活力及貯藏溫度的研究，以解決高山杜鵑花期不一致，提高雜交組合成功率，為高山杜鵑花雜交育種提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為3年生以上的杜鵑實生苗，平均株高56～60 cm，冠幅30 cm左右，品種為大白花杜鵑、亮葉杜鵑、馬纓花杜鵑、XXL和黃杯杜鵑。供試植株皆為露地栽培，生長良好，種植于云南春禾園林科技有限公司基地。采集開花前1～2 d或剛開花的花朵，帶回實驗室后剪取花藥，收集于墊有硫酸紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，室內(nèi)陰干1～2 d。待花粉自然散出，收集花粉，裝于1 mL凍存管中，于干燥器內(nèi)密封保存。

1.2 方法

1.2.1 最佳花粉萌發(fā)培養(yǎng)基篩選參考單因子完全隨機試驗，確定6個培養(yǎng)基組分配方為：1.蔗糖100 g/L＋H3BO30 mg/L＋CaCl20 mg/L；2.蔗糖100 g/L＋H3BO30 mg/L＋CaCl230 mg/L；3.蔗糖100 g/L＋H3BO330 mg/L＋CaCl20 mg/L；4.蔗糖100 g/L＋H3BO330 mg/L＋CaCl230 mg/L；5.蔗糖50 g/L＋H3BO320 mg/L＋CaCl220 mg/L；6.蔗糖50 g/L＋H3BO350 mg/L＋CaCl250 mg/L。以上培養(yǎng)基中均加入0.7%的瓊脂，調(diào)節(jié)pH值為6.0，篩選適宜高山杜鵑花花粉萌發(fā)的最佳組合。

1.2.2 花粉培養(yǎng)在雙孔凹型載玻片孔內(nèi)滴入0.1 mL的培養(yǎng)基，將充分混合后的花粉用毛筆蘸取均勻撒播于培養(yǎng)基表面。將玻片置于鋪有2層濕濾紙的培養(yǎng)皿中，在（25±1）℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，統(tǒng)計萌發(fā)的花粉粒數(shù)和未萌發(fā)的花粉粒數(shù)。

在40×顯微鏡下觀察統(tǒng)計，因杜鵑花花粉為四合體，所以在統(tǒng)計花粉萌發(fā)數(shù)時，只要有1個萌發(fā)即視為萌發(fā)?；ǚ勖劝l(fā)后，每隔1 h觀測一次。最終測定時間以2次測定萌發(fā)率基本相同開始，設(shè)3次重復(fù)，每個處理統(tǒng)計10個視野，每個視野觀察不少于50?；ǚ?，以花粉管長度超過花粉直徑為萌發(fā)標準。萌發(fā)率＝已萌發(fā)的花粉粒數(shù)/測定的花粉?？倲?shù)×100%。

1.2.3 不同貯藏條件及不同貯藏時間下花粉萌發(fā)力的測定采用以下4種方法密封保存高山杜鵑花花粉：（1）室溫保存（20℃）；（2）4℃保存；（3）-16℃低溫保存；（4）-80℃超低溫保存。從花粉貯藏開始，每隔一定時間定期檢測花粉萌發(fā)率。取少量的花粉均勻地撒播于最適培養(yǎng)基上，在25℃培養(yǎng)箱中經(jīng)最適時間培養(yǎng)后鏡檢，統(tǒng)計花粉的萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對杜鵑花花粉萌發(fā)的影響

表1 不同培養(yǎng)基對杜鵑不同品種花粉萌發(fā)率的影響%

從表1可以看出，新鮮高山杜鵑花花粉在不同培養(yǎng)基上萌發(fā)率差異較大。大白花杜鵑最適萌發(fā)培養(yǎng)基為6號培養(yǎng)基，高濃度的硼和鈣離子能促進該品種的花粉萌發(fā)；馬纓花杜鵑花粉萌發(fā)率最低，在最適萌發(fā)培養(yǎng)基4號上只有32.3%的萌發(fā)率；黃杯杜鵑、XXL和亮葉杜鵑最適萌發(fā)培養(yǎng)基均為2號培養(yǎng)基，在沒有硼酸的情況下，這3個品種的花粉萌發(fā)率分別達到83.5%，45.6%和74.4%。結(jié)果表明，鈣離子對高山杜鵑花粉萌發(fā)影響更大，適宜的離體培養(yǎng)基配方因杜鵑花品種不同而不同。

同時，不同品種的杜鵑花新鮮花粉萌發(fā)率差異較大（表1），按花粉萌發(fā)率從大到小排序為黃杯杜鵑＞亮葉杜鵑＞大白花杜鵑＞XXL＞馬纓花杜鵑。結(jié)果表明，高山杜鵑在添加不同濃度的硼離子和鈣離子后，能有效促進花粉萌發(fā)，對于萌發(fā)率高的品種，在以后的育種中應(yīng)加以重視。

2.2 不同貯藏方法對大白花杜鵑花粉活力的影響

花粉的長期貯藏對種質(zhì)保存和雜交育種十分重要。在花粉貯藏中，貯藏溫度對花粉生活力影響最大。低溫、干燥有利于花粉活力的保存，這是由于花粉貯藏期間可溶性糖類和有機酸消耗減少。

對不同貯藏方式下不同貯藏時間的大白花杜鵑花粉萌發(fā)進行檢測，結(jié)果表明，在室溫下（20℃）10 d后的花粉萌發(fā)率僅為1.5%，在相同的貯藏時間下，隨著貯藏溫度的降低花粉萌發(fā)率呈升高趨勢，但隨著貯藏時間的延長，花粉萌發(fā)率逐步下降。貯藏的前30 d，-80℃貯藏的大白花杜鵑花粉萌發(fā)率高于-16℃貯藏，但貯藏至40 d時，-16℃貯藏的大白花杜鵑花粉萌發(fā)率（17.9%）高于-80℃貯藏（16.4%）（表2）。表明花粉短期（30 d內(nèi)）貯藏用-80℃較好，長期（30 d以上）以-16℃貯藏較好。

表2 大白花杜鵑花粉在不同貯藏溫度下的萌發(fā)率%

2.3 不同貯藏條件對杜鵑花不同品種花粉萌發(fā)的影響

對不同貯藏方式及時間下杜鵑花不同品種花粉萌發(fā)進行了檢測。從表3可以看出，室溫（20℃）貯藏至10 d時，黃杯杜鵑花粉萌發(fā)率達到53.9%，而XXL和亮葉杜鵑的花粉萌發(fā)率分別僅為6.9%和15.1%，貯藏至20 d左右各個品種之間的花粉萌發(fā)率差別大，黃杯杜鵑能達到40%以上，而其余2個品種的花粉萌發(fā)率均不到6%，說明高山杜鵑花花粉活力在常溫下貯藏時間較短。不同的高山杜鵑花花粉低溫貯藏的時間差別也較大，以黃杯杜鵑花花粉的貯藏時間最長，在-80℃時，貯藏120 d花粉萌發(fā)率還能達到45%，而XXL雖然在貯藏120 d后還能測得花粉萌發(fā)率，但僅為10.5%，亮葉杜鵑在貯藏90 d后花粉萌發(fā)率不到10%，在相同的貯藏時間下，隨著貯藏溫度的降低花粉萌發(fā)率呈升高趨勢，但隨著貯藏時間的延長，花粉萌發(fā)率逐步下降。不同貯藏條件下杜鵑花不同品種花粉萌發(fā)率差異較大，黃杯杜鵑花花粉在4個不同貯藏條件下花粉萌發(fā)率均比另外2個品種高，說明黃杯杜鵑花花粉的活力較強，在雜交育種中可以優(yōu)先考慮。

表3 不同品種及不同貯藏方式對高山杜鵑花粉萌發(fā)率的影響

3 討論

不同高山杜鵑花的花粉萌發(fā)培養(yǎng)基并不相同，有效的培養(yǎng)基配方能促進花粉的萌發(fā)，添加不同濃度的硼離子和鈣離子能提高高山杜鵑花粉的萌發(fā)率。硼離子與糖形成絡(luò)合物，易于在組織中運輸和參與果膠物質(zhì)的合成，以利于花粉管的建造，從而促進花粉萌發(fā)與花粉管的生長，但其濃度要求因植物不同而異[15]。

不同種類花粉能夠長期貯藏的時間也有所不同，為了探討杜鵑花粉的貯藏條件和解決育種過程中花期不遇引起的授粉困難，本試驗研究了不同貯藏條件及貯藏時間下花粉萌發(fā)率的變化，并對4種不同貯藏溫度下花粉生活力進行了單因素對比試驗。結(jié)果表明，低溫冷凍是高山杜鵑花粉的最佳貯藏條件。低溫貯藏的花粉之所以能保持較高的活力，可能是由于低溫不但能降低可溶性糖類和有機酸類物質(zhì)的消耗，還能降低呼吸強度和酶活性[16]，延長花粉的壽命。花粉的生活力除了受貯藏溫度影響外，還受到貯藏環(huán)境的濕度、花粉自身含水量等因素的影響。研究表明，貯藏溫度越低，花粉貯藏壽命就越長。另外，過高或過低的貯藏環(huán)境濕度也會降低花粉的萌發(fā)率，大多數(shù)植物花粉的最適貯藏環(huán)境濕度在40%～60%[17]。對百合品種花粉貯藏特性的研究表明，冷凍貯藏有利于保持百合花粉生活力[17]，而山梅花在冷凍貯藏條件下的花粉萌發(fā)數(shù)最低[18]。本研究表明，冷凍貯藏有利于保持大白花杜鵑花粉生活力，由此可見，不同物種間花粉貯藏條件存在顯著差異。因此，研究杜鵑花粉貯藏時的含水量與貯藏方式，找出適合于各種花粉的貯藏方法對雜交育種具有重大意義。

另外，在本研究中還發(fā)現(xiàn)，不同杜鵑花種類的新鮮花粉萌發(fā)率差異較大，在供試的5個杜鵑品種中，馬纓花杜鵑的花粉萌發(fā)率最低，這可能與它的生物學(xué)特性有一定的關(guān)系，還有待于進一步深入研究。

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Study on Viability and Storage Capacity of Pollen among Different Rhododendron lapponicum Cultivars

LU Lin，PENG Lyu-chun，SONG Jie，LI Shu-fa，XIE Wei-jia，LI Shi-feng
（National Engineering Research Center for Ornamental Horticulture，Institute of Flower，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming650205，China）

To investigate the pollen viability of Rhododendron lapponicum cultivars,the pollen germination rate of Rhododendron decorum,Rhododendron XXL,Rhododendron vernicosum,Rhododendron decorum Franch and Rhododendron wardii were determined by culture in vitro under different storage conditions.The results showed that the optimal germination medium of pollen for Rhododendron decorum was sucrose 50 g/L＋H3BO350 mg/L＋CaCl250 mg/L＋0.7%agar;sucrose 100 g/L＋H3BO330 mg/L＋CaCl230 mg/L＋0.7%agar for Rhododendron decorum Franch；sucrose 100 g/L＋H3BO30 mg/L＋CaCl230 mg/L＋0.7%agar for Rhododendron wardii,Rhododendron XXL and Rhododendron vernicosum.There were significant differences in germination rate of pollen among difference Rhododendron cultivars,the germination rate of pollen was in order as:Rhododendron wardii＞Rhododendron vernicosum＞Rhododendron decorum＞Rhododendron XXL＞Rhododendron decorum Franch.The germination rate of pollen of Rhododendron wardii under 4 different storage temperature conditions were higher than that of Rhododendron XXL and Rhododendron decorum Franch,which indicated the pollen of Rhododendron wardii performance higher vitality,which can be applied in hybrid breeding.

Rhododendron;pollen vitality;storage;germination rate

S685.21

A

1002-2481（2016）02-0175-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.02.11

2015-10-28

云南省科技計劃項目（2015BB013）

陸琳（1976-），女，云南昆明人，副研究員，主要從事云南特色園林花卉的種質(zhì)資源創(chuàng)新研究工作。李世峰為通信作者。