黃海庭++林栩++尤燕舞++湯春榮++古賢君++黃美英++覃幼玲++譚軍華++黃非凡

【摘要】目的探討瞬時(shí)受體電位陽離子通道蛋白6（TRPC6）高表達(dá)對轉(zhuǎn)化生長因子β1 （TGFβ1）干預(yù)下體外培養(yǎng)小鼠腎足細(xì)胞nephrin、desmin、caspase9表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。

方法用脂質(zhì)體Lip2000將針對小鼠TRPC6的基因真核表達(dá)載體pEX3TRPC6轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞，48小時(shí)后Western blot檢測轉(zhuǎn)染后TRPC6蛋白表達(dá)變化。將足細(xì)胞分為4組：正常對照組，TGFβ1干預(yù)組，TGFβ1+pEX3NC組（空載體組），TGFβ1+pEX3TRPC6組（TRPC6高表達(dá)組），干預(yù)48小時(shí)后用western blot和real time PCR 檢測caspase9、desmin、nephrin蛋白和mRNA表達(dá)水平，用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率，DAPI染色觀察凋亡細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化。

結(jié)果轉(zhuǎn)染48 小時(shí)后TRPC6高表達(dá)組TRPC6蛋白水平較正常對照組明顯升高（P<0.01），空載體組TRPC6蛋白表達(dá)水平無明顯變化；TGFβ1干預(yù)48小時(shí)后caspase9、desmin蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），nephrin蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯下降（P<0.01），使TRPC6高表達(dá)后上述變化更明顯（P<0.05）；TGFβ1干預(yù)后足細(xì)胞凋亡增多并出現(xiàn)典型凋亡細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變，TGFβ1干預(yù)組足細(xì)胞凋亡率為（12.30±0.81）%，TRPC6高表達(dá)組凋亡率為（21.26±1.16）%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），空載體組細(xì)胞凋亡率與TGFβ1干預(yù)組比較無明顯差異。

結(jié)論TRPC6在 TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用，其機(jī)制之一可能通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，減少nephrin表達(dá)，增加desmin表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】足細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長因子β1；凋亡；結(jié)蛋白；nephrin；caspase9

中圖分類號：R692文獻(xiàn)標(biāo)識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2016.04.003

瞬時(shí)受體電位陽離子通道蛋白6（TRPC6）是新近發(fā)現(xiàn)的聯(lián)系足細(xì)胞裂孔隔膜與細(xì)胞骨架的重要分子，通過對人類多種獲得性蛋白尿性腎小球疾病的研究則表明TRPC6表達(dá)升高是足細(xì)胞損傷的重要因素[1]，但TRPC6在足細(xì)胞損傷中的具體機(jī)制目前尚未完全明確。轉(zhuǎn)化生長因子β1 （TGFβ1）具有誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的作用，有研究表明TRPC6可能是TGFβ1下游作用因子之一[2～3]，但TRPC6是否參與TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞的損傷過程，目前尚未檢索到相關(guān)研究。本研究通過基因過表達(dá)技術(shù)，誘導(dǎo)足細(xì)胞TRPC6高表達(dá)，觀察TRPC6高表達(dá)對TGFβ1誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡及nephrin、desmin、caspase9表達(dá)的影響，以期為足細(xì)胞損傷的防治提供新靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和試劑

腎小球足細(xì)胞株（MPC5）購于上海復(fù)旦大學(xué)細(xì)胞中心，RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清[?？寺∩锘瘜W(xué)制品（北京）有限公司]，重組人TGFβ1（ProSpecTany）、BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物工程研究所）、RNA提取試劑盒（愛思進(jìn) AxyPrep）、SuperQuickRT MasterMix（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）、UltraSYBR MixturePCR（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）、TRPC6、nephrin、desmin、GAPDH一抗及HRP標(biāo)記的二抗（美國Abcam），DAPI溶液（北京索萊寶），pEX3NC、pEX3TRPC6質(zhì)粒（上海吉瑪公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋），Lipofeetamine2000（Invitrogen公司）。

1.2足細(xì)胞培養(yǎng)

腎小球足細(xì)胞培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[4]，并稍做修改，細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

實(shí)驗(yàn)前一天，接種1×104細(xì)胞至24孔板中，加入500 μL含血清培養(yǎng)液，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至65%融合。分別將pEX3NC、 pEX3TRPC6與脂質(zhì)體Lipofeetamine2000混合（1∶4），室溫靜置30分鐘后加入24孔板，以無血清的1640培養(yǎng)液孵育6小時(shí)后改用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24及48小時(shí)后通過倒置熒光顯微鏡觀察足細(xì)胞中GFP的表達(dá)，測定轉(zhuǎn)染效率（轉(zhuǎn)染細(xì)胞率=熒光蛋白表達(dá)細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%）；48小時(shí)后應(yīng)用Western blot檢測TRPC6蛋白的表達(dá)。將細(xì)胞分為4組：正常對照組，TGFβ1干預(yù)組，TGFβ1干預(yù)+pEX3NC，TGFβ1干預(yù)+pEX3TRPC6組。在后3組細(xì)胞中加入TGFβ1，使其終濃度為12 ng/ml，干預(yù)48小時(shí)后收集各組細(xì)胞分別進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4real time RTPCR檢測caspase9、nephrin、desmin mRNA表達(dá)

模型建立后按 RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA。用紫外分光光度計(jì)測 RNA 的濃度并用電泳測得RNA的完整性和降解情況。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求加入相應(yīng)的試劑，放入PTC200儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。引物均由上海生物工程公司生產(chǎn)，引物序列見表1。反應(yīng)總體系20 μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，61.7℃延伸58 s，循環(huán)40次。同時(shí)設(shè)熔解曲線55℃～95℃ 10 s共81個循環(huán)。每個樣品均設(shè)3個復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對照和陰性對照，每個樣本重復(fù)3次，取其平均值為樣本Ct值。目標(biāo)基因相對于內(nèi)參基因進(jìn)行相對定量，采用2△△CT法進(jìn)行mRNA相對表達(dá)量的比較。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因特異性。

去除24孔板中的培養(yǎng)液，每孔細(xì)胞中加入50 μL IP（IP使用前與PMSF混勻，使PMSF終濃度為1 mmol/L）充分裂解細(xì)胞，用槍頭上下吹打細(xì)胞10～20次后收集細(xì)胞至1.5 ml離心管中，14 000 g離心5 min，取上清液至200 μL離心管中得細(xì)胞總蛋白質(zhì)，用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。將提取的總蛋白溶于5%SDS，100℃，5分鐘熱變性。每孔加50 μg總蛋白進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，300 mA恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜2.5 h。3%BSA室溫封閉1小時(shí)，加入按適當(dāng)比例稀釋的一抗（兔抗TRPC6多克隆抗體，稀釋度1∶300；兔抗caspase9，稀釋度1∶300；兔抗nephrin，稀釋度1∶200；兔抗desmin，稀釋度1∶500；兔抗GAPDH，稀釋度1∶500），4℃冰箱搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，10 min/次，加入羊抗兔多克隆二抗，稀釋度1∶5000，室溫孵育1小時(shí)，TBST洗膜3次，20 min/次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，曝光、顯影、定影，掃描條帶，利用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶的灰度值的比值表示其相對含量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

各組細(xì)胞先用預(yù)冷的PBS洗2次，然后用胰酶消化，1.5 ml離心管收集各組細(xì)胞，800 g離心5 min分鐘，去上清，用1 ml PBS重懸細(xì)胞，再次離心去上清，重復(fù)兩次以去除胰酶中的ETDA。最后將細(xì)胞重懸于150 μL結(jié)合緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，分別加入2.5 μL Annexin V和0.5 μL 100 μg/ml的PI溶液，室溫避光孵育15 min。上機(jī)檢測前補(bǔ)加200 μL結(jié)合液，輕輕混勻。立即將染色細(xì)胞進(jìn)行流式分析，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.7DAPI熒光染色觀察足細(xì)胞凋亡的核形態(tài)學(xué)變化

各組細(xì)胞干預(yù)72 h后，取10 μg 1 mg/ml的DAPI水溶液加到1 ml PBS中，配制成10 μg/ml的DAPI溶液，每孔細(xì)胞加入50 μL的10 μg/ml DAPI溶液，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞15 min，然后置于熒光顯微鏡360 nm激發(fā)波長下觀察，取圖。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布及方差齊性，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用q檢驗(yàn)（NewmanKeuls法），檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2結(jié)果

2.1足細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及特異性抗原nephrin檢測

正常足細(xì)胞呈多邊形或梭形，細(xì)胞輪廓清晰，自細(xì)胞體伸出少量樹枝樣突起（圖1A）。間接免疫細(xì)胞化學(xué)染色：nephrin分布于胞膜、核周及細(xì)胞質(zhì)（圖1B）。real time RTPCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示該細(xì)胞系表達(dá)nephrin（圖1C），nephrin是足細(xì)胞特異性分子，因此可以認(rèn)為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系來源于足細(xì)胞。

A：正常足細(xì)胞形態(tài)；B：免疫熒光染色nephrin在足細(xì)胞上的表達(dá)、分布；C：nephrin熒光定量PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳。

2.2TRPC6轉(zhuǎn)染效率

將pEX3NC、pEX3TRPC6轉(zhuǎn)染足細(xì)胞48小時(shí)后，Westernblot 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEX3TRPC6（高表達(dá)組）TRPC6蛋白明顯升高（P<0.05），傳染pEX3NC（空載體組）對TRPC6蛋白表達(dá)無明顯影響（P>0.05）。正常對照組、空載體組、高表達(dá)組TRPC6/GAPDH蛋白灰度值之比分別為（0.49±0.02）、（0.50±0.001）、（1.01±0.04）。見圖2A、B。

A：westernblot蛋白條帶原始圖；B：目的蛋白表達(dá)相對灰度值之比，與正常組相比，a：P<0.01，與空載體組相比，b：P<0.01。

2.3TRPC6高表達(dá)對TGFβ1干預(yù)下足細(xì)胞nephrin、caspase9、desmin mRNA表達(dá)的影響

TGFβ1干預(yù)48小時(shí)后足細(xì)胞nephrin mRNA表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），caspase9、desmin mRNA表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），TGFβ1干預(yù)+轉(zhuǎn)染pEX3TRPC6（TRPC6高表達(dá)） 組上述變化更加明顯 （P<0.05）。TGFβ1干預(yù)+轉(zhuǎn)染pEX3NC （空載體）組與TGFβ1干預(yù)組nephrin、caspase9、desmin mRNA表達(dá)水平無明顯差異。見表2。

2.4TRPC6高表達(dá)對TGFβ1干預(yù)下足細(xì)胞nephrin、caspase9、desmin 蛋白表達(dá)的影響

TGFβ1刺激48小時(shí)后足細(xì)胞nephrin 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），caspase9、desmin 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.01），TGFβ1干預(yù)+轉(zhuǎn)染pEX3TRPC6（TRPC6高表達(dá)組）上述變化更加明顯 （P<0.05）。TGFβ1干預(yù)+轉(zhuǎn)染pEX3NC（空載體組）與TGFβ1干預(yù)組nephrin、caspase9、desmin 蛋白表達(dá)水平無明顯差異。見圖3。

2.5DAPI染色結(jié)果

細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變是細(xì)胞凋亡的重要鑒別依據(jù)。在熒光顯微鏡下（圖4A），可觀察到正常足細(xì)胞的染色質(zhì)疏松，熒光強(qiáng)度相對較弱，細(xì)胞核大小一致，形態(tài)規(guī)則（圖4A）； 細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)染色質(zhì)濃縮，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，一些細(xì)胞核碎裂，呈現(xiàn)大小不一的熒光斑塊，即“凋亡小體”（圖4B）； 各組細(xì)胞經(jīng)DAPI染色后均可見典型細(xì)胞凋亡的細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變，但各組細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)明顯不一（圖4C～F）。

A：western blot 蛋白條帶原始；B：目的蛋白表達(dá)相對灰度值之比：與正常組相比，a：P<0.01；與TGFβ1干預(yù)組相比，b：P<0.01。

A，B（×20倍）：箭頭表示斷裂的染色質(zhì)及濃縮的細(xì)胞核，三角形表示正常細(xì)胞核；A：正常足細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)，B：TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的細(xì)胞核形態(tài)。C、D、E、F（×10倍）：各組細(xì)胞核形態(tài)變化；C：正常對照組，D：TGFβ1干預(yù)組，E：TGFβ1干預(yù)+高表達(dá)組，F(xiàn)：TGFβ1干預(yù)+高空載體組。

2.6TRPC6高表達(dá)對TGFβ1誘導(dǎo)下足細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示正常對照組足細(xì)胞凋亡率為（1.34±0.15）%，應(yīng)用TGFβ1處理48 小時(shí)后凋亡率明顯升高，其凋亡率為（12.30±0.81）%，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而TGFβ1干預(yù)+TRPC6高表達(dá)組凋亡率為（21.26±1.16）%，明顯高于TGFβ1干預(yù)組（P<0.01），轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞凋亡率為（13.20±1.25）%，與TGFβ1干預(yù)組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖5A～D、表3。

A：正常組；B：TGFβ1干預(yù)組；C：TGFβ1干預(yù)+高表達(dá)組；D：TGFβ1干預(yù) + 空載體組

3討論

瞬時(shí)受體電位陽離子通道蛋白6（transient receptor potential channel6，TRPC6）作為瞬時(shí)受體電位超家族中的一員，是一種非選擇性的陽離子通道。TRPC6是2005年Winn研究小組通過對家族性遺傳性局灶節(jié)段性腎小球硬化癥研究所發(fā)現(xiàn)，隨后免疫共沉淀技術(shù)顯示TRPC6和podocin、nephrin共表達(dá)，且與這些蛋白之間有相互作用，TRPC6參與構(gòu)成裂孔隔膜信號復(fù)合體[5]， TRPC6的發(fā)現(xiàn)將足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白與離子通道聯(lián)系起來，拓寬了足細(xì)胞分子網(wǎng)絡(luò)，為復(fù)雜腎臟疾病的研究提供新的思路。但目前對于TRPC6的研究尚處于起步階段，具體作用機(jī)制尚未完全闡明。

TRPC6基因突變可以導(dǎo)致常染色體顯性遺傳性局灶節(jié)段性腎小球硬化，在高糖[6]、血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)[7]、鏈脲佐菌素誘導(dǎo)[8]的足細(xì)胞損傷過程中，TRPC6高表達(dá)可通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流增加，引起足細(xì)胞骨架分布紊亂、裂孔隔膜蛋白表達(dá)異常。在糖尿病腎病[9]、膜性腎病[10]等多種人類獲得性蛋白尿性腎小球疾病中其表達(dá)量與蛋白尿程度呈正比。TGFβ1是公認(rèn)的致腎臟纖維化細(xì)胞因子，具有誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的作用，但在此過程中TRPC6是否參與其中目前尚無研究。鑒于此，本研究通過轉(zhuǎn)染TRPC6真核表達(dá)載體至足細(xì)胞使其高表達(dá)TRPC6，觀察TRPC6高表達(dá)對TGFβ1干預(yù)下足細(xì)胞損傷的影響。通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，在TGFβ1作用下，nephrin表達(dá)明顯下降，desmin表達(dá)明顯增多，基因誘導(dǎo) TRPC6高表達(dá)后nephrin下降更加明顯，desmin表達(dá)升高更加明顯，這表明TRPC6高表達(dá)能促進(jìn)TGFβ1誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷過程，與上述研究結(jié)果相似。

足細(xì)胞丟失是導(dǎo)致腎小球硬化的關(guān)鍵因素，而凋亡則是導(dǎo)致足細(xì)胞丟失的重要原因之一，深入探討足細(xì)胞凋亡機(jī)制對延緩腎小球硬化進(jìn)程具有重要意義。TGFβ1是一種多功能細(xì)胞因子，參與細(xì)胞增殖分化、凋亡、血管形成、細(xì)胞外基質(zhì)形成等多種生物學(xué)事件[11]。在TGF損傷足細(xì)胞的多種機(jī)制中，促凋亡是其重要的環(huán)節(jié)，但TRPC6與TGF誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的關(guān)系目前國內(nèi)外尚未檢索到相關(guān)報(bào)道。因此，本研究中我們首先通過DAPI染色觀察足細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組細(xì)胞經(jīng)DAPI染色后均可見典型細(xì)胞凋亡的細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變，TRPC6高表達(dá)后細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增多。由此可初步判斷TRPC6高表達(dá)參與TGF誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡過程。為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更有說服力，我們又通過流式細(xì)胞檢測各組細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示，TGFβ1作用48小時(shí)后足細(xì)胞凋亡率由（1.34±0.15）%增高至（1230±0.81）%，而使TRPC6高表達(dá)后凋亡率升高至（21.26±1.16）%，轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞凋亡率較TGFβ1干預(yù)組無明顯差異。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明TRPC6高表達(dá)參與了TGFβ1誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡過程。

既往研究發(fā)現(xiàn)，線粒體凋亡途徑在TGFβ1誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Das等[12]通過體外構(gòu)建TGFβ1誘導(dǎo)條件永生化小鼠足細(xì)胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)TGFβ1通過SmadERK1/2mTORC1軸提高Nox4的表達(dá)，進(jìn)而使ROS產(chǎn)生增多、線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶家族（caspase） 是一類凋亡特異性蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中處于中心地位，其中caspase9是線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源凋亡途徑中首先被激活的因子[13]。為了進(jìn)一步研究TRPC6在TGFβ1誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡中的可能作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)觀察了TRPC6高表達(dá)對TGFβ1干預(yù)下足細(xì)胞caspase9表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGFβ1作用48小時(shí)后足細(xì)胞caspase9表達(dá)水平明顯上調(diào)，說明線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑確實(shí)參與了TGFβ1誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡過程，而當(dāng)使TRPC6高表達(dá)后caspase9在基因及蛋白水平均明顯升高，這說明TRPC6至少部分通過調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑caspase9的表達(dá)進(jìn)而增加TGFβ1誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。

綜上所述，我們的研究表明TRPC6是TGF誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷過程中的重要分子，通過加深TGFβ1誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡程度，減少nephrin表達(dá)，增加desmin表達(dá)可能是其作用機(jī)制之一。阻斷病理狀況下TRPC6的高表達(dá)或許是治療蛋白尿性腎臟疾病的新策略，我們將在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)一步探討。

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（收稿日期：2016-04-24修回日期：2016-08-06）

（編輯：梁明佩）