胡 璇，苑 鑫*，柏長青*,牛文凱，袁 靜，馮羽中，李璞媛，劉慧瑩

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京100071；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所，北京100071)

肺炎支原體雙向電泳條件的探索

胡 璇1，苑 鑫1*，柏長青1*,牛文凱1，袁 靜2，馮羽中1，李璞媛1，劉慧瑩1

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京100071；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所，北京100071)

目的 建立適用于肺炎支原體(mycoplasmapneumoniae,MP)的雙向電泳技術(shù)。方法 對雙向電泳實驗中的三個關(guān)鍵因素：全蛋白提取量、固相PH梯度膠條范圍、蛋白上樣量進(jìn)行摸索，比較和分析標(biāo)準(zhǔn)株FH電泳圖譜，利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)鑒定部分蛋白斑點。結(jié)果 采用菌液離心結(jié)合超聲破碎的方法提取全蛋白，上樣量為2 mg，固相PH梯度膠條選取PH4-7，可以得到蛋白點分布均勻的雙向電泳圖譜，蛋白點數(shù)為60±2。利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)成功獲得了分子伴侶蛋白(Chaperone protein DnaK)，鑒定成功率為100%。結(jié)論 成功建立了適用于肺炎支原體蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)條件，為肺炎支原體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供一個可靠的技術(shù)平臺。

肺炎支原體；蛋白質(zhì)組學(xué)；雙向電泳技術(shù)

(ChinJLabDiagn,2016,20:2006)

肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae,MP)是呼吸系統(tǒng)感染的主要致病菌之一，是我國成人社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)的首要致病菌[1-3]。MP中約有22個功能蛋白尚未明確[4]，這些蛋白在MP的致病性或耐藥性等方面的作用需進(jìn)一步探討。雙向電泳技術(shù)(two-dimensional electrophoresis of protein,2-DE)可以為MP蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供進(jìn)一步的分析工具。由于肺炎支原體具有臨床分離培養(yǎng)困難、培養(yǎng)周期長、培養(yǎng)條件嚴(yán)格的特點，目前國內(nèi)外對肺炎支原體蛋白質(zhì)雙向電泳方面的研究較少。

為了建立穩(wěn)定的適用于肺炎支原體的雙向電泳技術(shù)，我們針對2-DE中3個關(guān)鍵環(huán)節(jié)：蛋白提取方法、上樣量和固相PH膠條范圍進(jìn)行了實驗探索。通過多種條件的比較篩選，優(yōu)化出一套適用于肺炎支原體的雙向電泳技術(shù)，可以為以后研究肺炎支原體蛋白質(zhì)組學(xué)提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本及儀器

1.1.1 樣本來源

肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株FH(ATCC15531)購自美國。

1.1.2 試劑

CMO4O3購自O(shè)XOID公司；IPG膠條(18 cm，PH4-7，PH3-10)，丙酮均購自GE Healthcare公司；丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，十二烷基磺酸鈉(SDS)，四甲基乙二胺(TEMED)，過硫酸銨，碘代乙酰胺，二硫蘇糖醇(DTT)，1.5M TRIS均購自AMRESCO公司；其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 儀器

Protein Ⅰ水平電泳儀，Protein Ⅱ垂直電泳儀及附件購自Bio-Rad公司；GE Image scanner Ⅲ掃描儀購自GE Healthcare公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

將標(biāo)準(zhǔn)株FH接種到400ml液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3-5天。根據(jù)顏色改變單位試驗(color change unit,CCU)檢測結(jié)果，明確待測菌株濃度達(dá)到104[5]。

1.2.2 蛋白質(zhì)樣品制備[6，7]

采用離心粗提取法和離心結(jié)合超聲破碎法兩種方法制備蛋白樣品。

離心粗提取法：400 ml菌液4℃，10 000 g，30 min離心，棄上清收集菌體。沉淀用0.5×PBS洗3遍，收集沉淀。沉淀中加入裂解液(8M 尿素，50 mM DTT,4% CHAPS)。加入45 μl RNaseA和45 μl RNase。室溫靜置1 h，離心后收集上清。用GE Healthcare公司2-D Quant Kit 試劑盒定量，2 mg/支分裝后-80℃凍存。

離心結(jié)合超聲破碎法：400 ml菌液4℃，10 000 g，30 min離心，棄上清收集菌體。沉淀用0.5×PBS洗3遍，收集沉淀。沉淀中加入裂解液(8M 尿素，50 mM DTT，4% CHAPS)，超聲破碎5 min。加入45 μl RNaseA和45 μl RNase。室溫靜置1 h，離心后收集上清。用GE Healthcare公司2-D Quant Kit 試劑盒定量，2 mg/支分裝后-80℃凍存。

1.2.3 等電聚焦電泳(isoelectronic focusing,IEF)

分別取1 mg、2 mg蛋白樣品量進(jìn)行一向電泳上樣量的優(yōu)化，樣品中加入1 ml預(yù)冷的丙酮，過夜后，4℃，13 000 g，離心30 min，加入348 μl 8M水化液(裂解液中加入微量溴酚藍(lán)),1.7 μl IPG buffer混勻后，室溫靜置1 h，15℃，23 000 g，離心40 min。取上清上一向電泳。一向電泳的固相PH膠條范圍選取兩個范圍進(jìn)行優(yōu)化：PH4-7、PH3-10。電泳參數(shù)如表1。

1.2.4 第二向-垂直平板SDS-PAGE

一向膠條先用DTT平衡膠條15 min，再用碘代乙酰胺平衡膠條15 min，將平衡后的 IPG 膠條移至凝膠的上方。進(jìn)行二向電泳，20 mA先進(jìn)行20 min，再換90 mA進(jìn)行3 h。二向電泳后凝膠用染色液(考馬斯亮藍(lán)G-250)染色過夜，再用1%冰乙酸脫色。

表1 一向電泳參數(shù)

1.2.5 圖像掃描與分析

凝膠用GE Image scanner Ⅲ掃描儀掃描，并對圖像進(jìn)行分析。

1.2.6 蛋白斑點膠內(nèi)酶解和質(zhì)譜分析

切取凝膠中的蛋白斑點，送至華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司分析，進(jìn)行膠內(nèi)酶解和質(zhì)譜分析，獲得蛋白斑點的肽質(zhì)量指紋圖譜 (peptide mass fingerprinting,PMF),進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索比對，初步對蛋白點進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 雙向電泳條件優(yōu)化

對雙向電泳中三個關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化：①兩種方法提取的全蛋白；②不同的蛋白上樣量；③不同的固相pH膠條范圍。共獲得8幅雙向電泳圖，通過比較分析選取離心結(jié)合超聲破碎的方法提取全菌蛋白，采用2 mg的蛋白上樣量，在pH值4-7范圍內(nèi)進(jìn)行雙向電泳，可以得到蛋白點分布均勻的雙向電泳圖譜，蛋白點數(shù)為 60±2(見表2)。

2.2 鑒定蛋白

選取最優(yōu)的雙向電泳圖中3個蛋白質(zhì)點進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜分析后，獲得3個蛋白質(zhì)點的肽質(zhì)量指紋圖譜，鑒定成功率為100%。蛋白鑒定結(jié)果見表3。

3 討論

蛋白質(zhì)是基因功能的最終執(zhí)行者，雙向電泳從等電點和分子量兩個方面展示蛋白質(zhì)，是蛋白質(zhì)組研究中的經(jīng)典方法。MP的雙向電泳條件尚無標(biāo)準(zhǔn)成熟方案，需要對雙向中三個關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行試驗探索。雙向電泳中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是蛋白樣品的制備，蛋白裂解的不充分會影響蛋白量的多少，通過摸索對MP提取全蛋白采用的裂解液體系為：8M尿素，50 mM DTT,4%CHAPS，結(jié)合超聲破碎5 min，試劑盒定量結(jié)果為50 μl/mg；蛋白質(zhì)的上樣量一般為100 μg-2 mg[6，8，9]，根據(jù)膠條長度的不同而選擇不同的蛋白上樣量，實驗發(fā)現(xiàn)2 mg蛋白上樣量比1 mg蛋白上樣量得到的蛋白電泳圖更清晰；雙向電泳中先根據(jù)蛋白等電點的不同進(jìn)行一向分離，再根據(jù)蛋白分子量的不同進(jìn)行二向分離，實驗發(fā)現(xiàn)一向分離選取PH值3-10范圍的膠圖比PH值4-7范圍的膠圖分辨率差，也不利于后續(xù)取點鑒定，選擇PH值為4-7范圍進(jìn)行一向電泳可以得到清晰的電泳圖，取點后進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為分子伴侶蛋白。

表2 雙向電泳結(jié)果

表3 蛋白質(zhì)譜鑒定和生物信息檢索結(jié)果

通過對實驗條件的摸索用離心結(jié)合超聲破碎的方法提取全蛋白，然后取2 mg蛋白進(jìn)行雙向電泳，在固相PH梯度膠條為PH4-7范圍內(nèi)，可以得到分辨率和重復(fù)性都很好的蛋白圖譜，用LC-MS/MS的方法成功鑒定了肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株FH中3個蛋白點，鑒定結(jié)果為分子伴侶蛋白(Chaperone protein DnaK)，鑒定成功率為100%。

肺炎支原體是我國社區(qū)獲得性肺炎首位致病菌，但其耐藥現(xiàn)象在我國十分嚴(yán)重，對首選藥物大環(huán)內(nèi)酯類耐藥率高達(dá)69%以上[10]，另一類有效抗生素喹諾酮類的最低抑菌濃度也在不斷提升。利用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)開展MP的功能蛋白研究并尋找可能的耐藥相關(guān)性蛋白，可為MP致病機(jī)理的研究和耐藥的防治提供蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法。

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Optimization of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis techniques formycoplasmapneumoniae

HUXuan1,YUANXin1,BAIChang-qing1,etal.

(1.DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,theAffiliatedHospitaloftheAcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100071,China；2.InstituteofDiseaseControlandPrevention,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100071,China)

Objective To develop a scheme of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis(2-DE) formycoplasmapneumoniae(MP).Methods The main factors of 2- DE technique,including protein precipitation,PH gradient gel strip range and protein sample size,were studied in this research.The standard FH electrophoresis map was compared and analyzed,and then some protein spots were identified by liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC-MS/MS).Results The proteins spots of FH were well distributed under the condition of whole protein extracted by centrifugal and ultrasonic fragmentation,the 2mg protein sample size,and PH 4-7.60±2 protein spots were detected in the maps.By using LC-MS/MS,protein identification results were molecular chaperone protein DnaK.Identification rate was 100%.Conclusion The 2-DE method for proteomics analysis of MP was successfully established which could be effectively used in the MP proteomics investigation.

Mycoplasma pneumoniae;proteomics;two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis

首都特色基金(Z141107002514182)；國家自然科學(xué)基金(81400009)

1007-4287(2016)12-2006-03

R392

A

胡璇(1987-)，女，碩士研究生，研究實習(xí)員，主要從事肺炎支原體對四環(huán)素類耐藥機(jī)制的研究。

2016-05-15)

*通訊作者