別曉東李 敏虞 立楊潔紅萬海同張宇燕△

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310009；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州310053）

復(fù)方紅花飲對(duì)大鼠腦挫裂傷后血腦屏障通透性和SOD、MDA水平影響的實(shí)驗(yàn)研究*

別曉東1李 敏2虞 立2楊潔紅2萬海同2張宇燕2△

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310009；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州310053）

目的通過大鼠腦挫裂傷后對(duì)血腦屏障通透性和SOD、MDA水平的影響，觀察復(fù)方紅花飲對(duì)大鼠腦挫裂傷的作用。方法 SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、治療組（予復(fù)方紅花飲），每組10只。采用自由落體打擊法制備大鼠腦挫裂傷模型，觀察各組在6 h、24 h、72 h、7 d不同時(shí)間點(diǎn)腦組織中EB含量、SOD活力和MDA含量。結(jié)果 治療組在6 h、24 h、72 h能顯著降低伊文思藍(lán)含量，在6 h、24 h、72 h、7 d能顯著升高SOD活力，在24 h、72 h、7 d能顯著降低MDA含量，與模型組比較具有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論 復(fù)方紅花飲對(duì)大鼠腦挫裂傷后具有抑制腦挫裂傷后血腦屏障的過度開放和明顯抗氧化作用。

復(fù)方紅花飲 腦挫裂傷 血腦屏障通透性 超氧化物歧化酶 丙二醛

腦挫傷和腦裂傷往往同時(shí)并存，合稱腦挫裂傷。顱腦外傷患者中常見到急性硬膜下血腫，且多伴腦挫裂傷，兩者均可繼發(fā)腦水腫，在受損位置產(chǎn)生占位效應(yīng)，壓迫、推移周圍腦組織，導(dǎo)致顱內(nèi)壓力升高，嚴(yán)重者可使中線結(jié)構(gòu)移位，腦干受壓，從而引發(fā)腦疝，造成嚴(yán)重后果［1-3］。復(fù)方紅花飲是在歷史悠久的療效確切的古方通竅活血湯的基礎(chǔ)上，通過臨床診治經(jīng)驗(yàn)的進(jìn)一步積累形成的中藥配伍方藥。復(fù)方紅花飲是按照現(xiàn)代制劑工藝要求，提取藏紅花、川芎、石菖蒲、水蛭、杜仲、生地黃等的主要活性成分后與藥用輔料制備而成的復(fù)方制劑，通過前期臨床治療表明，對(duì)于腦創(chuàng)傷患者擁有明確的療效，對(duì)腦繼發(fā)性損害有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。為進(jìn)一步探討復(fù)方紅花飲對(duì)腦挫裂傷的作用機(jī)制，同時(shí)可開發(fā)具有較好療效的中藥新藥，本課題組開展了復(fù)方紅花飲對(duì)大鼠腦挫裂傷后的作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（280± 10）g，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，合格證：SYXK［滬］2013-016。

1.2 試藥與儀器 復(fù)方紅花飲（主要由紅花6 g，川芎6 g，水蛭10 g，牛膝15 g，杜仲15 g，生地黃15 g等組成。按照處方組成和用量，在浙江中醫(yī)藥大學(xué)心腦血管病研究所提取制備成水煎濃縮液，相當(dāng)于生藥0.6 g/mL，并通過HPLC-DAD測定川芎嗪平均含量為0.37 mg/mL）；腦震寧顆粒：山西振東安特生物制藥有限公司。伊文思藍(lán)（Evan′s blue，Sigma進(jìn)口分裝），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒：購自南京建成生物工程研究所。UV-28系列紫外可見分光光度計(jì)（上海恒科儀器有限公司）；Micro17（R）/21（R）臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher）。

1.3 分組與給藥 SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、治療組（予復(fù)方紅花飲，按臨床成人用量120 g生藥計(jì)算，灌胃給藥10.8 g生藥/kg）。分別于造模成功后立即給藥，每天1次，連續(xù)給藥7 d。假手術(shù)組和模型組分別灌服給予等容積的生理鹽水。假手術(shù)組10只，同時(shí)模型組和復(fù)方紅花飲治療組分設(shè)6 h、24 h、72 h、7 d等4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)組10只。

1.4 模型制備 采用自由落體打擊法制備大鼠腦挫裂傷模型［4-5］，大鼠稱體質(zhì)量后用 10%水合氯醛（0.4 mL/100 g體質(zhì)量）腹腔注射麻醉。手術(shù)區(qū)剔除毛，碘伏（75%酒精）消毒，手術(shù)中使用電熱板，并監(jiān)測大鼠的肛溫，維持在37℃左右，俯臥位固定大鼠。選取右側(cè)顱頂旁正中切口，用電鉆在矢狀縫旁1.5 mm、冠狀縫后1.5 mm向外后磨出直徑約4 mm×6 mm的骨窗，用于放置撞擊圓錐，并注意保持骨膜的完整性。之后采用改良的Feeney架自由落體撞擊造成大鼠腦挫裂傷模型，將大鼠移至Feeney架擊打平臺(tái)，將擊打墊片置于大鼠暴漏骨窗上，用20 g砝碼置于距離顱骨35 cm高處自由落體擊打墊片，對(duì)大鼠腦組織造成撞擊，擊打深度均為3～4 mm，不打穿硬腦膜。造成大鼠中等程度局灶性腦挫裂傷并昏迷。立即止血，封閉骨窗，雙氧水、生理鹽水沖洗創(chuàng)面后縫合，再用酒精擦洗傷口。假手術(shù)組除不擊打外，其余操作方法均相同。手術(shù)后均立即用40 W白熾燈保暖，保持肛溫37℃左右，一般1～2 h可以蘇醒。蘇醒后正常飼養(yǎng)，自由飲食。各組大鼠分別在6 h、24 h、72 h、7 d等不同時(shí)間點(diǎn)取損傷側(cè)腦組織進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測定。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）腦組織中伊文思藍(lán)（EB）含量測定：在取腦組織手術(shù)前1 h股靜脈注射2%EB 3 mL/kg，待大鼠眼球結(jié)膜、四肢皮膚均顯示藍(lán)色，表明注入成功。分別在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)腹腔麻醉，迅速開胸，穿刺左心室后剪右心房一小口，用加抗凝劑（肝素鈉）的生理鹽水，直至右心房流出清亮液體，迅速斷頭取損傷側(cè)半球腦組織，稱濕質(zhì)量后，置于已加有5 mL甲酰胺的離心管中，54℃恒溫培養(yǎng)24 h，讓組織中的EB充分溶解中甲酰胺溶液中，3000 r/min離心8 min，取上清液，用紫外可見分光光度計(jì)（635 nm）測定吸光度，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算溶液中EB含量。2）腦組織中SOD活力和MDA含量的測定：取損傷側(cè)腦組織，稱質(zhì)量后按質(zhì)量體積比加生理鹽水制備成10%的組織勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清，-80℃冰箱保存，按試劑盒說明測定腦組織中SOD活力和MDA含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)方紅花飲對(duì)大鼠腦挫裂傷后血腦屏障通透性的影響 見表1。大鼠腦挫裂傷后，損傷側(cè)腦組織EB含量增高明顯，6 h達(dá)到最高峰值，以后逐漸呈下降趨勢(shì)，各不同時(shí)間點(diǎn)模型組與假手術(shù)組相比均具有顯著差異（P＜0.01）。治療組與模型組比較，在6、24、72 h均具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。表明復(fù)方紅花飲具有降低大鼠腦挫裂傷后EB含量，抑制腦挫裂傷后血腦屏障的過度開放。

表1 各組大鼠腦挫裂傷后不同時(shí)間點(diǎn)EB含量比較（μg/g，）

表1 各組大鼠腦挫裂傷后不同時(shí)間點(diǎn)EB含量比較（μg/g，）

與假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01。下同。

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2.2 復(fù)方紅花飲對(duì)大鼠腦挫裂傷后SOD活力和MDA含量的影響 見表2，表3。大鼠腦挫裂傷6 h后，損傷側(cè)腦組織SOD的活力顯著降低，MDA含量顯著升高，各不同時(shí)間點(diǎn)模型組與假手術(shù)組相比均具有顯著差異（P＜0.01）。治療組與模型組比較，在6 h、24 h、72 h、7 d不同時(shí)間點(diǎn)，SOD活力均顯著高于模型組 （P＜0.01或P＜0.05），MDA含量在24 h、72 h、7 d不同時(shí)間點(diǎn)均顯著低于模型組（P＜0.01）。表明復(fù)方紅花飲可顯著提高大鼠腦挫裂傷后SOD的活力，降低MDA含量，具有明顯抗氧化作用。

表2 各組大鼠腦挫裂傷后SOD活力比較（U/mg，）

表2 各組大鼠腦挫裂傷后SOD活力比較（U/mg，）

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表3 各組大鼠腦挫裂傷后MDA含量比較（nmol/mg，）

表3 各組大鼠腦挫裂傷后MDA含量比較（nmol/mg，）

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3 討 論

腦挫裂傷是頭部外傷后腦組織發(fā)生的一系列器質(zhì)性損傷，腦組織出現(xiàn)散在的小點(diǎn)狀出血、撕裂、水腫及壞死，鄰近部位常合并腦水腫、腦腫脹或不同程度的顱內(nèi)血腫［6］。腦創(chuàng)傷后血腦屏障通透性增加在腦水腫的發(fā)生和發(fā)展過程中亦起著重要作用。血腦屏障通透性增高是嚴(yán)重顱腦損傷和實(shí)驗(yàn)性腦損傷的特征之一，在創(chuàng)傷性腦水腫的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［7-8］，而腦組織中富含易受氧自由基攻擊的磷脂和自由基生成過程中有催化作用的鐵離子，使腦細(xì)胞對(duì)氧自由基的過氧化反應(yīng)特別敏感，腦挫裂傷后引起氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化作用，并形成脂質(zhì)過氧化物，導(dǎo)致腦組織損傷［9］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，大鼠腦挫裂傷后血腦屏障通透性在6 h后內(nèi)達(dá)到高峰，然后逐漸降低；損傷側(cè)腦組織SOD的活力顯著降低，MDA含量顯著升高，6 h、24 h、72 h、7 d內(nèi)均與假手術(shù)組有顯著差異。

復(fù)方紅花飲主要是由紅花、川芎、石菖蒲、水蛭、杜仲、生地黃等組成，通過臨床診治經(jīng)驗(yàn)表明具有較好的治療腦挫裂傷的療效。方中，藏紅花味甘性寒，具有較強(qiáng)的活血祛瘀作用，又兼有涼血解毒功效；川芎味辛性溫，辛香走竄，主“中風(fēng)入腦，頭痛、寒痹痙攣”，功善活血行氣，祛風(fēng)止痛，為歷代醫(yī)家治頭痛之要藥；石菖蒲芳香開竅，水蛭苦咸，歸肝經(jīng)，破瘀血而不傷新血，具有通絡(luò)止痛作用；杜仲、生地黃補(bǔ)腎生髓養(yǎng)腦。諸藥合用祛瘀血、清邪熱、補(bǔ)腦髓，達(dá)活血、開竅、泄熱、補(bǔ)腎之功。

現(xiàn)代藥理研究也表明，藏紅花具有抗炎、抗腫瘤、降血脂等多種藥理活性［10］，對(duì)缺血缺氧性及創(chuàng)傷性腦損傷具有明顯的保護(hù)作用［11-12］。川芎中有效成分如川芎嗪等可改善微循環(huán)、降壓；可通過鎮(zhèn)痛，增加微循環(huán)的血液供應(yīng)，提高腦組織對(duì)缺氧的耐受力，促進(jìn)血腫吸收，降低顱內(nèi)壓，改善腦功能；抑制IL-8、IL-18、ICAM-1增加，降低腦水腫，改善神經(jīng)功能缺損，抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡等［13-16］。石菖蒲提取物能明顯減輕腦水腫，可能是其醒腦開竅作用的病理生理學(xué)基礎(chǔ)［17］。水蛭體內(nèi)的水蛭素、組胺樣物質(zhì)、肝素、抗血栓素等多種藥用活性，對(duì)消除手術(shù)后引起的后遺癥、阻礙血液凝固、促進(jìn)血液循環(huán)有重要作用［18］。杜仲、生地黃等通過促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)生長等多種途徑，對(duì)腦損傷具有較好的保護(hù)作用［19-20］。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也表明，治療組飲與模型組相比，在6 h、24 h、72 h能顯著降低EB含量，抑制腦挫裂傷后血腦屏障的過度開放，在6 h、24 h、72 h、7 d不同時(shí)間點(diǎn)顯著升高SOD活力，在24 h、72 h、7 d不同時(shí)間點(diǎn)顯著降低MDA含量，具有明顯抗氧化作用。為臨床治療腦挫裂傷提供了思路，有助于開發(fā)具有確切療效的中藥新藥，提高臨床療效。

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Effect of the Compound of Safflower Drink on the Level of BBB Permeability，SOD and MDA in Rats after Brain Contusion

BIE Xiaodong，LI Min，YU Li，et al.The Second Affiliated Hospital of Medical College of Zhejiang University，Zhejiang，Hangzhou 310009，China.

Objective：To observe the effect of the compound of safflower drink against rats after brain contusion through the impact on the levels of blood-brain barrier permeability，SOD and MDA in rats after brain contusion.Methods：SD rats were randomly divided into the sham group，the brain contusion model group and the compound of safflower drink treated group.Each group had 10 rats.By adopting the method of free-fall combating the brain contusion model was established to observe EB content，SOD activity and MDA content in brain tissue at different time points of 6 h，24 h，72 h and 7 d.Results：The EB content at 6 h，24 h，72 h were significantly reduced and the SOD activity in 6 h，24 h，72 h，7 d were significantly increased；the MDA content at 24 h，72 h，7 d were significantly reduced in the compound of safflower drink treated group，which had significant difference compared with the model group（P＜0.01 or P＜0.05）.Conclusion：The compound of safflower drink has a significant anti-oxidant effect and can inhibit BBB excessive open after brain contusion in rats.

Compound of safflower drink；Brain contusion；BBB permeability；SOD；MDA

·研究報(bào)告·

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014ZA070）

△（電子郵箱：yannoo7376@sina.com）

R285.5

A

1004-745X（2016）11-2036-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.11.005

（2016-07-26）