鄭光來(lái)，盧曉冉，張永武，張靜遠(yuǎn)，陳 騰，王東方，嚴(yán) 妍,3，張守鋒，扈榮良*

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130122)

狂犬病病毒磷蛋白在桿狀病毒中的表達(dá)及鑒定

鄭光來(lái)1，盧曉冉2，張永武2，張靜遠(yuǎn)2，陳 騰2，王東方2，嚴(yán) 妍2,3，張守鋒2，扈榮良1*

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130122)

采用RT-PCR方法擴(kuò)增出狂犬病病毒BD06株的磷蛋白(P)基因片段，將其插入桿狀病毒穿梭載體pFastBac 1獲得的pFastBac 1-P重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coliDH10Bac成功構(gòu)建出桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒Bacmid-P，用脂質(zhì)體介導(dǎo)Bacmid-P轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞獲得重組桿狀病毒(AcMNPV-P)。經(jīng)SDS-PAGE、Western blot和直接免疫熒光分析鑒定，BD06-P蛋白在桿狀病毒中成功表達(dá)，且具有良好的反應(yīng)原性，為進(jìn)一步研究狂犬病病毒磷蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。

狂犬病病毒；桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)；磷蛋白

狂犬病(Rabies)是一種古老而又持續(xù)流行的人獸共患傳染病。由于狂犬病病毒(Rabies virus，RV)在感染人或動(dòng)物腦組織以后才會(huì)表現(xiàn)出臨床癥狀，因此一旦發(fā)病，病死率幾乎為100%，全世界每年因?yàn)榭袢「腥径劳龅娜藬?shù)約有50 000人～70 000人，給人類的生命帶來(lái)了巨大的安全隱患[1]。

狂犬病病毒屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒屬(Lyssavirus)的成員，其基因組由11 928(有些毒株為11 932)個(gè)核苷酸組成，為單股不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒。自基因組的3′端至5′端依次編碼著N(核蛋白)、P(磷蛋白)、M(基質(zhì)蛋白)、G(糖蛋白)、L(大轉(zhuǎn)錄酶蛋白)5種蛋白。磷蛋白是狂犬病病毒所有結(jié)構(gòu)蛋白中變異最大的一種蛋白，同時(shí)也是功能最為復(fù)雜的一種蛋白。磷蛋白可以通過(guò)和N、L兩個(gè)蛋白共同作用，促進(jìn)病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯[2-3]；同時(shí)磷蛋白還具有阻止干擾素調(diào)控因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)激活，從而阻止干擾素的表達(dá)等功能[4]。

磷蛋白具有功能多樣性，目前雖然磷蛋白的研究相對(duì)廣泛，但仍不完善。本試驗(yàn)通過(guò)pFast-Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功克隆表達(dá)了狂犬病病毒BD06株的磷蛋白，為深入研究RABV的感染機(jī)制、P蛋白結(jié)構(gòu)和功能以及狂犬病ELISA診斷試劑盒的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

RV BD06毒株、E.coliDH10BacTM感受態(tài)、昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9、桿狀病毒表達(dá)載體pFastBacTM1、磷蛋白單抗1C9、FITC標(biāo)記的磷蛋白單抗1C9均由吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；E.coliDH5α感受態(tài)、ExTaq酶、DNA和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑盒為BioFlux公司產(chǎn)品；小量質(zhì)粒提取試劑盒和小量DNA凝膠回收試劑盒均為AxyGen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank：EU549783.1中RV BD06毒株的磷蛋白基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，并在上、下游引物中引入BamH I和KpnI兩個(gè)酶切位點(diǎn)，上、下游引物分別為BD06-P-F：5′-CGCGGATCCATGAGCAAGATCTTCGT-3′(BamH I)和BD06-P-R：5′-CGGGGTACCTCAGCAGGATGTATA-3′(Kpn I)。磷蛋白基因片段長(zhǎng)度為894 bp。

1.2.2 重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 取RV BD06的細(xì)胞毒100 μL用總RNA提取試劑盒提取病毒RNA，然后用磷蛋白上游引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再用磷蛋白的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。然后將PCR產(chǎn)物和桿狀病毒表達(dá)載體pFastBacTM1分別用BamH I和KpnI雙酶切、回收，T4連接酶16 ℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)以獲得重組桿狀病毒表達(dá)載體pFastBacTM1-P，隨后用雙酶切鑒定，并送至吉林省庫(kù)美生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

將經(jīng)鑒定正確的重組桿狀病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入E.coliDH10BacTM感受態(tài)中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選較大的白斑并純化一次。然后挑取大個(gè)的白斑用Bacmid質(zhì)粒上的通用引物M13F/M13R進(jìn)行PCR鑒定。最終得到含有BD06-P基因的重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒Bacmid-P。

1.2.3 重組桿狀病毒(AcMNPV-P)的獲得與擴(kuò)增 用CellfectinⅡReagent脂質(zhì)體介導(dǎo)Bacmid-P轉(zhuǎn)染六孔板里匯合度達(dá)到80%左右的Sf9細(xì)胞，并設(shè)立空白對(duì)照。待細(xì)胞出現(xiàn)病變(約96 h)后收集細(xì)胞上清即為P1代AcMNPV-P。經(jīng)2次傳代后，獲得大量的P3代AcMNPV-P，用于后期蛋白表達(dá)及鑒定，并用Reed-Muench法計(jì)算第3代AcMNPV-P病毒滴度。

1.2.4 重組磷蛋白的鑒定

1.2.4.1 直接免疫熒光試驗(yàn)(DIFA) 用第3代AcMNPV-P感染六孔板里的正常Sf9細(xì)胞，設(shè)立未接毒的空白對(duì)照。28 ℃培養(yǎng)72 h后棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，800 mL/L的丙酮于4 ℃固定20 min，然后棄去丙酮，風(fēng)干，加入FITC標(biāo)記的小鼠抗磷蛋白單抗1C9(1∶800)，37 ℃孵育1 h，用PBST洗滌3次，5 min/次。滴加2滴800 mL/L的甘油，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4.2 SDS-PAGE和Western blot檢測(cè) 收集感染AcMNPV-P的Sf9細(xì)胞，用PBS洗滌2遍，然后加入適量的PBS。反復(fù)凍融3次后離心取上清，加入5×的SDS-Loading buffer，煮沸10 min。處理好的樣品跑兩份SDS-PAGE膠，一份用于考馬斯亮藍(lán)染色，另一份用半干式轉(zhuǎn)膜法電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。轉(zhuǎn)印好的PVDF膜用10 g/L的酪蛋白室溫振蕩封閉2 h，PBST洗滌3次，10 min/次；用小鼠抗磷蛋白的單抗1C9(1∶200)室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，10 min/次；用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，10 min/次；TMB顯色10 min。1.2.5 重組Ac-MNPV-P的電鏡觀察 用重組Ac-MNPV-P感染Sf9細(xì)胞，待細(xì)胞完全病變后(約96 h)收集細(xì)胞懸液于離心管中，室溫下1 000 r/min，離心5 min，取上清進(jìn)行電鏡觀察。

不斷推進(jìn)人員本土化進(jìn)程。保加利亞公司高度重視生產(chǎn)與管理的本土化，聘請(qǐng)保籍農(nóng)業(yè)專家擔(dān)任執(zhí)行經(jīng)理，聘請(qǐng)培育、種植、加工、病蟲(chóng)害防治的農(nóng)藝專家和技術(shù)骨干，組成以農(nóng)業(yè)院校、種植專家、科技機(jī)構(gòu)相結(jié)合的中保方人員參與的技術(shù)管理團(tuán)隊(duì)，目前絕大多數(shù)的中層崗位由保加利亞人員擔(dān)任。同時(shí)不斷加強(qiáng)中方管理人員與基地保方負(fù)責(zé)人、農(nóng)業(yè)技術(shù)人員的溝通、交流，將中國(guó)先進(jìn)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)與保加利亞豐富的自然資源相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了資源、技術(shù)等多項(xiàng)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，農(nóng)業(yè)種植、田間管理的經(jīng)驗(yàn)共享與提高。

2 結(jié)果

2.1 磷蛋白基因PCR產(chǎn)物鑒定

從RV BD06株感染的BHK細(xì)胞上清液里提取病毒的總RNA，并以此為模板進(jìn)行RT-PCR，然后用磷蛋白的特異性引物擴(kuò)增出磷蛋白基因片段(圖1)。

1～2.磷蛋白基因；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 0001-2.BD06-P gene fragment；M.DNA Marker DL1 000

2.2 重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

利用通用引物M13F/R對(duì)重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，若沒(méi)有重組成功則只會(huì)出現(xiàn)300 bp的條帶，若重組成功則會(huì)擴(kuò)增出3 196 bp(2 300 bp+894 bp)的條帶。試驗(yàn)成功擴(kuò)增出了3 200 bp左右的條帶(圖2)，證明重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 5 000；1～2.重組質(zhì)粒Bacmid-P的PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 5 000；1-2：PCR products of recombinant plasmid Bacmid-P

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒Bacmid-P的PCR鑒定

Fig.2 Identification of recombinant plasmid Bacmid-P by PCR

2.3 重組桿狀病毒的獲得

感染AcMNPV-P的Sf9細(xì)胞72 h后可以觀察出明顯的細(xì)胞病變，與正常細(xì)胞相比，病變細(xì)胞的直徑變大，細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)許多顆粒物，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，病變細(xì)胞慢慢脫落。而正常細(xì)胞的直徑則大小均勻，形狀規(guī)則(圖3)。

2.4 重組磷蛋白的直接免疫熒光(DIFA)檢測(cè)

用FITC標(biāo)記的磷蛋白單克隆抗體1C9對(duì)重組桿狀病毒表達(dá)的磷蛋白進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果顯示(圖4)，表達(dá)的重組磷蛋白能夠和磷蛋白單抗發(fā)生特異性的反應(yīng)。證明重組磷蛋白在Sf9細(xì)胞中成功表達(dá)且具有良好的反應(yīng)原性。

A.Sf9細(xì)胞；B.感染AcMNPV-P 72 h后的Sf9細(xì)胞

A.Sf9 cells；B.Sf9 cells infected with AcMNPV-P after 72 h

圖3 正常Sf9細(xì)胞和感染AcMNPV-P的Sf9細(xì)胞(100×)

Fig.3 Control Sf9 cells and Sf9 cells infected with AcMNPV-P (100×)

A.感染AcMNPV-P 72 h后的Sf9細(xì)胞；B.Sf9細(xì)胞

A.Sf9 cells infected with AcMNPV-P after 72 h；B.Sf9 cells

圖4 直接免疫熒光鑒定重組磷蛋白的表達(dá)(100×)

Fig.4 Detection of recombinant phosphoprotein by DIFA(100×)

2.5 SDS-PAGE和Western blot分析重組磷蛋白

用SDS-PAGE分析Sf9細(xì)胞和重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞的細(xì)胞裂解上清，在40 ku左右出現(xiàn)了一個(gè)條帶。Western blot顯示在40 ku左右出現(xiàn)了特異性的條帶，與預(yù)期蛋白大小一致，而正常Sf9細(xì)胞的裂解上清未出現(xiàn)條帶。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、4.Sf9細(xì)胞裂解上清；2、3.感染AcMNPV-P的Sf9細(xì)胞裂解上清

M.Protein molecular weight Marker；1,4.The supernatant of lysed Sf9 cells；2,3.The supernatant of lysed Sf9 cells infected with AcMNPV-P

圖5 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western blot分析

Fig.5 Analyses of the expressed proteins by SDS-PAGE and Western blot

2.6 重組AcMNPV-P的電鏡觀察

用重組AcMNPV-P感染Sf9細(xì)胞，待細(xì)胞完全病變后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行電鏡觀察(圖6)。在病變的細(xì)胞上清中觀察到了重組桿狀病毒。

圖6 重組AcMNPV-P的電鏡觀察

3 討論

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為四大表達(dá)系統(tǒng)之一，與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有安全性高，對(duì)外源基因克隆容量大，重組病毒易于篩選，具有對(duì)重組蛋白進(jìn)行翻譯后的加工和修飾功能，且重組蛋白易從無(wú)血清的培養(yǎng)集中純化，無(wú)內(nèi)毒素等優(yōu)點(diǎn)[5]。目前，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于重組蛋白的獲取、基因治療、疫苗研制和藥物開(kāi)發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域[6]。

目前，不同狂犬病病毒毒株的磷蛋白已在多個(gè)表達(dá)系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。張金陽(yáng)等[7]利用真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了狂犬病毒Flury-HEP毒株磷蛋白，但真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量有限，且不易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)。靳紅亮等[8]利用人腺病毒5型表達(dá)了狂犬病病毒BD06株磷蛋白，但這種腺病毒載體存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。許運(yùn)斌等[9]利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了狂犬病病毒 ERA 株磷蛋白，而狂犬病病毒ERA株屬于弱毒株。本試驗(yàn)利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了狂犬病病毒 BD06 株的磷蛋白。與狂犬病病毒ERA株不同的是狂犬病病毒BD06株屬于強(qiáng)毒株，因此對(duì)其蛋白組分中的磷蛋白進(jìn)行克隆表達(dá)，為探討強(qiáng)毒株磷蛋白的生物功能及研究狂犬病病毒致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

磷蛋白是一種磷酸化的蛋白，在SDS-PAGE中呈現(xiàn)的約為40 ku的磷酸化形式[10-11]。通過(guò)Western blot和直接免疫熒光試驗(yàn)對(duì)重組磷蛋白進(jìn)行反應(yīng)原性的研究，發(fā)現(xiàn)重組磷蛋白能夠和狂犬病病毒磷蛋白單克隆抗體1C9產(chǎn)生良好的反應(yīng)，且相對(duì)分子質(zhì)量約為40 ku，與預(yù)期相符。證明利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功的表達(dá)了具有反應(yīng)原性的重組RV-BD06-P蛋白，為深入研究狂犬病病毒的感染機(jī)制和狂犬病ELISA診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

[1] Fooks A R,Banyard A C,Horton D L,et al.Current status of rabies and prospects for elimination[J].Lancet,2014,384(9951):1389-1399.

[2] Manos M,Frédéric I,Catherine M,et al.Isolation and characterisation of the rabies virus N degrees-P complex produced in insect cells[J].Virology,2003,305(2):406-414.

[3] Guillaume C,Mohamed C,Grégory C,et al.Peptides that mimic the amino-terminal end of the rabies virus phosphoprotein have antiviral activity[J].J Virol,2009,83(20):10808-10820.

[4] Brzózka K,Finke S,Conzelmann K K.Identification of the rabies virus alpha/beta interferon antagonist:phosphoprotein P interferes with phosphorylation of interferon regulatory factor 3[J].J Virol，2005,79(12):7673-7681.

[5] Jong Seok L,Young-Man K,Hye Suk H,et al.Baculovirus-expressed virus-like particle vaccine in combination with DNA encoding the fusion protein confers protection against respiratory syncytial virus[J].Vaccine,2014,32(44):5866-5874.

[6] 孫新寬,宋麗麗,韋 平,等.昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在病毒性家禽疾病研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)家禽,2014,36(1)：39-41.

[7] 張金陽(yáng),李貞景,宋玉竹,等.狂犬病毒磷蛋白的生物信息學(xué)分析及其真核表達(dá)[J].昆明理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2014,(6):82-88.

[8] 靳紅亮,王述超,張守峰,等.狂犬病病毒磷蛋白重組人 5 型腺病毒的構(gòu)建及鑒定[J].生物制品學(xué)雜志,2015,28 (10)：1023-1025.

[9] 許運(yùn)斌,徐潔萍,張金陽(yáng),等.狂犬病病毒磷蛋白在桿狀病毒系統(tǒng)的表達(dá)及鑒定[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2012(2):17-22.

[10] Gupta A,Blondel D S,Banerjee A.The phosphoprotein of rabies virus is phosphorylated by a unique cellular protein kinase and specific isomers of protein kinase C[J].J Virol,2000,74(1):91-98.

[11] Moseley G W,Filmer R P,Dejesus M A,et al.Nucleocytoplasmic distribution of rabies virus P-protein is regulated by phosphorylation adjacent to C-terminal nuclear import and export signals[J].Biochemistry,2007,46(43):12053-12061.

Expression and Characterization of Rabies Virus Phosphoprotein in Baculovirus

ZHENG Guang-lai1,LU Xiao-ran2,ZHANG Yong-wu2,ZHANG Jing-yuan2,CHEN Teng2,WANG Dong-fang2,YAN Yan2,3,ZHANG Shou-feng2,HU Rong-liang1

(AcademyofMilitaryMedicalSciences,KeyLaboratoryofJinlinProvincialZoonosis,VeterinaryResearchInstitute,Changchun，Jilin,130122,China)

The phosphoprotein gene of rabies virus BD06 stain was amplified by RT-PCR and cloned into the baculovirus shuttle vector pFastBac 1,then the recombinant vector pFastBac 1-P was transformed intoE.coliDH10Bac to obtain the recombinant expression plasmid Bacmid-P. The recombinant baculovirus AcMNPV-P was obtained by transfecting the Bacmid-p into Sf9 cells.The expressed recombinant phosphoprotein was identified by SDS-PAGE,Western blot and direct immunofluoresence assay.The results showed that the BD06-P was expressed in recombinant baculovirus successfully and had a good antigenicity,it would be potentially used for further study on the structures and functions of the phosphoprotein of rabies virus.

Rabies virus;baculovirus expression systerm;phosphoprotein

2015-11-23

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA10A212)

鄭光來(lái)(1989-)，男，河南許昌人，碩士研究生，主要從事分子病毒學(xué)研究。*通訊作者

S852.655

A

1007-5038(2016)05-0026-04