趙丹

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院，山西太谷030800）

擬南芥苯丙氨酸解氨酶基因的克隆與表達(dá)分析

趙丹

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院，山西太谷030800）

苯丙烷途徑是植物體內(nèi)廣泛存在的次生代謝途徑，此代謝過(guò)程中的第1個(gè)關(guān)鍵酶為苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-1yase，PAL）。苯丙氨酸解氨酶通過(guò)對(duì)基因的起始轉(zhuǎn)錄、頻率的控制和對(duì)外界誘導(dǎo)因子的響應(yīng)來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)，并且其表達(dá)水平對(duì)于下游黃酮類物質(zhì)的合成起著非常重要的作用。在一定條件下，苯丙氨酸解氨酶可利用其特殊的酶學(xué)性質(zhì)逆向催化生產(chǎn)L-苯丙氨酸。通過(guò)一系列的生物信息學(xué)分析，確定擬南芥中苯丙氨酸解氨酶的存在，并進(jìn)行基因的克隆及表達(dá)分析，為L(zhǎng)-苯丙氨酸的生產(chǎn)提供新的物種來(lái)源。

擬南芥；苯丙氨酸解氨酶；生物信息學(xué)；克隆

苯丙氨酸解氨酶是1961年在大麥中發(fā)現(xiàn)的[1]，其是苯丙烷途徑的第1個(gè)關(guān)鍵酶，在各種各樣的植物中均有存在，而且在少量微生物中也有存在。苯丙氨酸解氨酶是一種將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酚類化合物的重要蛋白酶，決定了酚類化合物合成的速率[2]。同時(shí)，苯丙氨酸解氨酶通過(guò)對(duì)基因的起始轉(zhuǎn)錄、頻率的控制以及對(duì)外界誘導(dǎo)因子的響應(yīng)來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)，并且其表達(dá)水平對(duì)于下游黃酮類物質(zhì)的合成起著非常重要的作用。在酸堿值為10，過(guò)量的銨根離子和酚類化合物同時(shí)存在的條件下，苯丙氨酸解氨酶可逆向催化酚類化合物加氨生成L-苯丙氨酸[3-5]，這種特殊的酶學(xué)性質(zhì)被廣泛地應(yīng)用在生物化工領(lǐng)域，以創(chuàng)造更高的價(jià)值。

提高L-苯丙氨酸產(chǎn)量的一個(gè)重要方法是在眾多的苯丙氨酸解氨酶源中篩選出一種活力較高并且穩(wěn)定性好的物種[6-8]。擬南芥的生長(zhǎng)過(guò)程較短，培養(yǎng)條件也相對(duì)較低，便于大量培育，是分子遺傳性與農(nóng)業(yè)研究中良好的材料[9]。同時(shí)，由于擬南芥基因高度純合的特點(diǎn)，使用不同的物理因素或者化學(xué)因素對(duì)擬南芥進(jìn)行處理時(shí)其容易產(chǎn)生突變，生成突變植株，便于對(duì)其進(jìn)行代謝功能及調(diào)控酶的研究[10-11]。建立擬南芥中苯丙氨酸解氨酶的研究機(jī)制，為L(zhǎng)-苯丙氨酸的生產(chǎn)提供新的物種來(lái)源，對(duì)于我國(guó)的農(nóng)業(yè)研究和農(nóng)作物的發(fā)展具有重要的影響及意義。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為擬南芥幼苗。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 試劑PCR引物合成于生工公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TE緩沖液購(gòu)于TAKARA公司；苯酚、氯仿、戊酮、異丙醇無(wú)水乙醇試劑均為分析純。

1.2.2 主要儀器培養(yǎng)箱、PCR儀、-20℃冰箱、冷凍離心機(jī)、滅菌鍋、電子天平、pH計(jì)、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)。

1.2.3 主要試劑配制提取緩沖液：Rris-HCl，EDTA，NaCl，SDS；氯仿-戊酮-乙醇體積比為80∶4∶16。

1.3 方法

1.3.1 擬南芥苯丙氨酸解氨酶序列查找在NCBI中通過(guò)苦蕎苯丙氨酸解氨酶的BLAST分析，查找可能的擬南芥苯丙氨酸解氨酶序列。其他物種的苯丙氨酸解氨酶序列從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得。

1.3.2 生物信息在線分析網(wǎng)站http://swissmodel. expasy.org/Swiss-model在線數(shù)據(jù)庫(kù)；http://www.ncbi. nlm.nih.gov/NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)；http://prosite.expasy. org/PROSITE在線數(shù)據(jù)庫(kù)；http://www.expasy.org/Expasy在線數(shù)據(jù)庫(kù)；https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ NPS@在線數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3.3 生物信息分析軟件預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)利用TMHMM軟件；信號(hào)肽預(yù)測(cè)工具利用SignalP軟件；亞細(xì)胞定位分析利用WOLFPSPORT軟件；蛋白同源性比對(duì)利用NCBI中的BLASTX程序；蛋白序列比對(duì)分析利用DNA MAN軟件；蛋白理化性質(zhì)分析利用Protparam工具。

1.3.4 擬南芥基因組的快速提取在50 mL離心管中加入20 mL提取緩沖液，50℃水浴預(yù)熱；取擬南芥幼苗5～15 g，粉碎；加入25 mL氯仿-戊酮-乙醇溶液，顛倒混勻；在室溫下5 000 r/min離心5 min；移取上清液放置50 mL離心管中，加入1倍體積異丙醇，搖動(dòng)混勻，在室溫下靜置，出現(xiàn)絮狀DNA沉淀；在1.5 mL離心管中加入1 mL TE，用玻璃棒取出DNA絮團(tuán)，用吸水紙吸干水分，再加入含TE的離心管中，使DNA溶解于TE中。

1.3.5 擬南芥總RNA的提取收取擬南芥放在滅過(guò)菌的研缽中，加入液氮搗碎，迅速轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，以3 000 r/min離心2 min，棄上清，將沉淀彈起；加入1 mL的Trizol試劑于1.5 mL離心管中，輕搖混勻，放置5 min；加入200 mL的氯仿到離心管中，用手劇烈搖晃15 s，在室溫下放置10 min，管內(nèi)溶液分層，于4℃，12 000 r/min離心15 min；將上層水相轉(zhuǎn)移到干凈的1.5 mL離心管中后，吸取等體積的異丙醇加入離心管中，上下顛倒搖晃至混勻，室溫下放置10 min，4℃12 000 r/min離心15 min，此時(shí)可見RNA沉淀；棄上清，加入用RNA酶無(wú)菌水配制的75%乙醇，上下顛倒搖晃洗滌沉淀，4℃12 000 r/min離心10 min；棄上清，無(wú)菌條件下干燥5 min，將RNA溶于30 μL的去RNA酶無(wú)菌水中。

1.3.6 擬南芥總cDNA的合成參照TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以提取到的總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增體系為37℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85℃5 s終止反應(yīng)，產(chǎn)物4℃保存（表1）。

表1 擬南芥總cDNA的合成

1.3.7 擬南芥中PAL基因的克隆以擬南芥cDNA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增PAL基因的開放閱讀框，并使用半定量方式檢驗(yàn)PAL基因在不同時(shí)期擬南芥幼苗中的表達(dá)情況（表2）。

表2 試驗(yàn)所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥苯丙氨酸解氨酶序列

在NCBI中通過(guò)苦蕎苯丙氨酸解氨酶的BLAST分析，查找可能的擬南苯丙氨酸解氨酶序列，其結(jié)果如下。

MEINGAHKSNGGGVDAMLCGGDIKTKNMVIN AEDPLNWGAAAEQMKGSHLDEVKRMVAEFRKPV VNLGGETLTIGQVAAISTIGNSVKVELSETARAGVN ASSDWVMESMNKGTDSYGVTTGFGATSHRRTKNG VALQKELIRFLNAGIFGSTKETSHTLPHSATRAAML VRINTLLQGFSGIRFEILEAITSFLNNNITPSLPLRGTI TASGDLVPLSYIAGLLTGRPNSKATGPNGEALTAEE AFKLAGISSGFFDLQPKEGLALVNGTAVGSGMASM VLFETNVLSVLAEILSAVFAEVMSGKPEFTDHLTHR LKHHPGQIEAAAVMEHILDGSSYMKLAQKLHEMD PLQKPKQDRYALRTSPQWLGPQIEVIRYATKSIERE INSVNDNPLIDVSRNKAIHGGNFQGTPIGVSMDNTR LAIRAIGKLMFAQFSELVNDFYNNGLPSNLTASRNP SLDYGFKGAEIAMASSIEREINSVNDNPLIDVSRNK AIHGGNFQGTPIGVSMDNTRLAIRAIGKLMFAQFSELVNDFYNNGLPSNLTASRNPSLDYGFKGAEIAMAS YCSELQYLANPVTSHVQSAEQHNQDVNSLGLISSR KTSEAVDILKLMSTTFLVAICQAVDLRHLEENLRQT VKNTVSQVAKKVLTTGVNGELHPSRFCEKDLLKV VDREQVYTYADDPCSATYPLIQKLRQVIVDHALVN GESEKNAVTSIFHKIGAFEEELKAVLPKEVEAARA AYDNGTSAIPNRIKECRSYPLYRFVREELGTELLTG EKVTSPGEEFDKVFTAICEGKIIDPMMECLNEWNG APIPIC

2.2 蛋白質(zhì)的理化分析

為了更加準(zhǔn)確地了解擬南芥苯丙氨酸解氨酶，研究其理化性質(zhì)是必不可少的，理化性質(zhì)更能直接簡(jiǎn)單地為植物學(xué)研究提供很大的幫助。利用生物信息分析軟件Protparam對(duì)擬南芥苯丙氨酸解氨酶進(jìn)行理化分析，其結(jié)果如表3所示。

由表3可知，擬南芥苯丙氨酸解氨酶是由725個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其分子量為78 782.7 Da，等電點(diǎn)PI為5.96。

表3 蛋白質(zhì)的理化分析

2.3 蛋白的功能域及保守域分析

使用PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)[12]對(duì)擬南芥苯丙氨酸解氨酶氨基酸序列進(jìn)行功能域和功能位點(diǎn)分析，以確定其是否具有保守功能域及其功能域的具體位置（圖1）。由圖1可知，擬南芥苯丙氨酸解氨酶氨基酸序列在第207～223位點(diǎn)存在一段保守功能域，序列為GTITASGDLVPLSYIAG，而此序列為丙氨酸解氨酶家族蛋白的特征序列，證明查找的蛋白序列存在苯丙氨酸解氨酶的功能基礎(chǔ)。

2.4 蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測(cè)

采用ProtScale（http：//ca.expasy.org/tools/protsca le.html）軟件[13]對(duì)擬南芥苯丙氨酸解氨酶進(jìn)行疏水性分析（圖2）。圖2橫軸表示的是氨基酸的位置，縱軸代表的是氨基酸平均疏水指標(biāo)，并且圖中的正值和負(fù)值分別表示的是疏水性和親水性；由圖2可知，較粗的橫線為親疏水性零點(diǎn)，此蛋白序列在親疏水性正負(fù)兩側(cè)分布均勻，結(jié)合蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析可以得出，此蛋白總體沒有表現(xiàn)出明顯的親水性或疏水性，符合苯丙氨酸解氨酶的特性。

2.5 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

本試驗(yàn)利用TMHMM在線生物信息分析網(wǎng)站[14]中專業(yè)預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的軟件，對(duì)擬南芥苯丙氨酸解氨酶進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖3）。圖3橫軸表示的是氨基酸的位置，縱軸代表的是跨膜結(jié)構(gòu)的可能性，圖3結(jié)果顯示，擬南芥苯丙氨酸解氨酶所有位點(diǎn)均沒有存在跨膜結(jié)構(gòu)的可能性。結(jié)合跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果以及蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果表明該蛋白亞單位不含有跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.6 蛋白序列比對(duì)分析

通過(guò)NCBI查找發(fā)現(xiàn)，擬南芥中苯丙氨酸解氨酶有725個(gè)氨基酸，用DNA MAN軟件[15]把其氨基酸的序列和大豆、楊樹、苦蕎中的苯丙氨酸解氨酶蛋白序列進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示，不同生物物種的苯丙氨酸解氨酶蛋白序列存在一定的序列一致性，并存在一個(gè)較保守的結(jié)構(gòu)域，主要集中在210～230個(gè)氨基酸之間（圖4）。這樣的序列一致性符合苯丙氨酸解氨酶保守功能域的特性，證明擬南芥中苯丙氨酸解氨酶的結(jié)構(gòu)域是保守的，能夠執(zhí)行相應(yīng)的生物學(xué)功能，具有和其他物種苯丙氨酸解氨酶相似的生理意義。

2.7 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步組成的，它具有疏水核位于內(nèi)部、親水鏈位于內(nèi)部的特點(diǎn)[16-17]。利用Swiss-model在線數(shù)據(jù)庫(kù)[18]（http://swissmodel.expasy.org/）對(duì)擬南芥苯丙氨酸解氨酶進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，其結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，擬南芥苯丙氨酸解氨酶主要由α-螺旋組成，結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定。而α-螺旋在DNA結(jié)合基序（DNA binding motifs）中有非常重要的作用，比如在鋅指結(jié)構(gòu)、亮氨酸拉鏈、螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋等基序中都含有α-螺旋。擬南芥苯丙氨酸解氨酶含有豐富的α-螺旋結(jié)構(gòu)，其可能指導(dǎo)苯丙氨酸解氨酶對(duì)相關(guān)基因的起始轉(zhuǎn)錄、頻率的控制和對(duì)外界誘導(dǎo)因子的響應(yīng)，從而調(diào)控黃酮類物質(zhì)的合成。

2.8 擬南芥中苯丙氨酸解氨酶基因序列的克隆

上述的試驗(yàn)驗(yàn)證了通過(guò)生物信息學(xué)方式查找到的擬南芥中苯丙氨酸解氨酶具有保守的功能結(jié)構(gòu)域，是具有生物功能和意義的活性蛋白。為了進(jìn)一步研究擬南芥中苯丙氨酸解氨酶的功能，進(jìn)行基因過(guò)表達(dá)或轉(zhuǎn)基因操作，以PAL-F與PAL-R為引物（表2），以擬南芥cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增出約2 178 bp的PAL基因片段（圖6）。

2.9 擬南芥中苯丙氨酸解氨酶基因的表達(dá)分析

取擬南芥第0，10，20，40，60，80，100天的苗株進(jìn)行qRT-PCR分析（圖7），以17S為對(duì)照，結(jié)果表明，擬南芥中苯丙氨酸解氨酶基因在幼苗前20 d表達(dá)量不高，20 d后開始大量表達(dá)，并保持穩(wěn)定的表達(dá)趨勢(shì)，這可能是由次生代謝的開始所引起的。證明在擬南芥中苯丙氨酸解氨酶能夠穩(wěn)定存在，為L(zhǎng)-苯丙氨酸的生產(chǎn)提供了可能的新的物種來(lái)源。

3 結(jié)論

生物信息技術(shù)的使用使我們對(duì)龐大基因庫(kù)的分析變得更加高效、快速，這種分析方法可以使日后的研究實(shí)現(xiàn)“事半功倍”的效果，能夠?yàn)橹笤囼?yàn)研究提供重要線索，提升了日常工作效率[19-20]。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)分析軟件從結(jié)構(gòu)組成、基本理化性質(zhì)、疏水性/親水性、三級(jí)結(jié)構(gòu)以及功能域等方面對(duì)擬南芥苯丙氨酸解氨酶進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果表明，擬南芥PAL基因是由2 628個(gè)堿基所組成，其所編碼含有725個(gè)氨基酸殘基的多肽序列，蛋白分子量為78 782.7 Da；氨基酸中大部分沒有顯現(xiàn)出明顯的親水性或疏水性，并且等電點(diǎn)PI為5.96；該蛋白不可以進(jìn)行跨膜運(yùn)動(dòng)，不含有跨膜結(jié)構(gòu)域。對(duì)擬南芥苯丙氨酸解氨酶氨基酸序列進(jìn)行功能域和功能位點(diǎn)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其含有保守結(jié)構(gòu)域?；虻目寺『捅磉_(dá)譜分析表明，擬南芥中苯丙氨酸解氨酶基因在幼苗前20 d表達(dá)量不高，20 d后開始大量表達(dá)，并保持穩(wěn)定的表達(dá)趨勢(shì)，這可能是由于次生代謝的開始所引起的。證明在擬南芥中苯丙氨酸解氨酶能夠穩(wěn)定存在，為L(zhǎng)-苯丙氨酸的生產(chǎn)提供了可能的新的物種來(lái)源。

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Cloning and Expression Analysis of Phenylalanine Ammonia-lyase Gene fromArabidopsis thaliana

ZHAODan
（College ofInformation，Shanxi Agricultural University，Taigu 030800，China）

Phenylalanine ammonia-lyase（PAL）is the first key enzyme involved in the metabolism of phenylpropanoid,which is a widespread metabolic pathwayin plants.Phenylalanine ammonia-lyase（PAL）regulates the expression ofgenes bytranscription initiation, frequency control and response to external factors,and its expression level plays an important role in downstream flavonoid synthesis. Under certain conditions,phenylalanine ammonia-lyase can be used to reverse-catalyze the production ofL-phenylalanine by its special enzymatic properties.In this paper,the presence of phenylalanine ammonia-lyase in Arabidopsis thaliana was determined by a series of bioinformatics analysis,and cloning and expression of the gene analysis,for the production of L-phenylalanine to provide a newspecies source.

Arabidopsis thaliana;phenylalanine ammonia-lyase;bioinformatics;clone

Q943.2

A

1002-2481（2016）12-1767-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.12.07

2016-10-27

趙丹（1986-），男，山西太原人，助教，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究工作。