李文亞，常健，王琪

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

晉西北酸粥發(fā)酵過程中酵母菌的分離鑒定

李文亞，常健，王琪

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

通過個(gè)體形態(tài)特征觀察、生理生化試驗(yàn)，結(jié)合分子生物學(xué)方法，對(duì)晉西北酸粥發(fā)酵過程中的酵母菌進(jìn)行了分類鑒定。結(jié)果表明，在晉西北酸粥發(fā)酵過程中的6個(gè)時(shí)間段共分離出41株酵母菌，形態(tài)學(xué)初步歸為5種類型，經(jīng)生理生化試驗(yàn)和ITS序列分析將其鑒定為3種酵母，分別為：庫(kù)德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），其均存在于晉西北酸粥的整個(gè)發(fā)酵過程中。

晉西北酸粥；發(fā)酵；酵母菌；分離鑒定

酸粥是一種主要由糜米、大米、小米等制作而成的傳統(tǒng)谷類發(fā)酵食品[1]，主要食用地區(qū)分布在內(nèi)蒙古西部、山西西北部、陜西北部等地[2]。類似的谷物發(fā)酵食品在世界其他地區(qū)也有食用，如Sekete，Boza和Champùs等[3-4]。酸粥不但較好地保存了由當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境有益微生物賦予的獨(dú)特風(fēng)味[5]，還具有消食健胃、生津止渴等保健功效。

本試驗(yàn)中的晉西北酸粥是選用北方地區(qū)的優(yōu)質(zhì)糜米（Panicum miliaceum L.）作為原料，經(jīng)過室溫自然發(fā)酵而成。在發(fā)酵過程中酵母菌可以促進(jìn)微生物間的共生作用，在提高特殊風(fēng)味和香氣方面起著重要的作用[6]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于酸粥的研究主要集中于內(nèi)蒙古酸粥，并且對(duì)酸粥中乳酸菌的研究較多[7]，但是對(duì)于晉西北酸粥及其中酵母菌的研究還未見報(bào)道。

本研究以晉西北酸粥為原料，發(fā)酵12 h后分時(shí)段取樣，研究發(fā)酵過程中酵母菌的種類變化。在形態(tài)鑒定基礎(chǔ)上，結(jié)合ITS序列分析，對(duì)酵母菌進(jìn)行鑒定。這既可以對(duì)晉西北酸粥中的酵母菌資源進(jìn)行收集和保存，同時(shí)還可以為進(jìn)一步研究晉西北酸粥的風(fēng)味特征奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

晉西北酸粥發(fā)酵原液和糜米，均從忻州當(dāng)?shù)孬@得。

1.2 試劑及儀器

STE（20 mL）：NaCl 0.12 g，20 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）10 mL，0.5 mol/L EDTA 40 μL，ddH2O 9.96mL。2×CTAB：2%CTAB，1.4mol/LNaCl，0.1mol/L EDTA（pH值8.0）。TE：10 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0），1 mmol/L EDTA（pH值8.0）。1×105Pa滅菌30 min。50×TAE（1 L）：準(zhǔn)確稱取Tris 242 g，EDTA 37.2 g于1 L燒杯中加入800 mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?，?7.1 mL冰乙酸，充分溶解，最后加去離子水定容至1 L，室溫保存。10%SDS（十二烷基硫酸鈉）：稱取1.0gSDS定容至10mL，121℃滅菌20min。蛋白酶-K（10 mg/mL），購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 儀器

試管恒溫加熱儀（北京來亨科貿(mào)有限責(zé)任公司）；高速冷凍離心機(jī)5417R（德國(guó)艾本德股份公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京市醫(yī)療設(shè)備總廠）；ALS 1296 PCR儀（美國(guó)伯樂公司）；Gel Doc 2000 UV凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)伯樂公司）。

1.4 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：其用于酵母菌的分離和菌落觀察。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：其用于酵母菌的液體富集。

YGC培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、瓊脂15 g/L、鏈霉素0.1 g/L，pH值6.6±0.2，121℃滅菌20 min。其用于酵母菌的菌落計(jì)數(shù)。

Wallerstein Laboratory（WL）培養(yǎng)基[8]：葡萄糖5.0 g/L、胰蛋白胨5.0 g/L、酵母浸粉4.0 g/L、磷酸二氫鉀0.55 g/L、氯化鉀0.425 g/L、氯化鐵0.25 mg/L、硫酸鎂0.125g/L、氯化鈣0.125g/L、硫酸錳0.25mg/L、溴甲酚綠22.0 mg/L、瓊脂20 g/L，pH值6.5±0.2，121℃滅菌20 min。其用于對(duì)酵母菌的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察。

生理生化培養(yǎng)基：糖發(fā)酵培養(yǎng)基、同化氮源培養(yǎng)基、同化乙醇培養(yǎng)基、無維生素基礎(chǔ)培養(yǎng)基和50%葡萄糖液體培養(yǎng)基（檢測(cè)類淀粉物質(zhì)生成）。

1.5 采樣

將200 g糜米加入600 mL晉西北酸粥原液中進(jìn)行發(fā)酵。自12 h起每隔2 h采樣一次，共采6次，即第12，14，16，18，20，22小時(shí)，分別編號(hào)為1，2，3，4，5，6。

1.6 分離純化和菌落計(jì)數(shù)

對(duì)每次的樣品進(jìn)行如下梯度稀釋：無菌移液管取原液1 mL加入至9 mL無菌水中，得10-1濃度稀釋液，取10-1濃度稀釋液系列稀釋至10-6。取10-4，10-5，10-6等3個(gè)濃度梯度的稀釋液0.1 mL，分別涂布于PDA平板和YGC平板上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行，30℃恒溫培養(yǎng)24～48 h。以不加菌液為對(duì)照。長(zhǎng)出明顯菌落后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。最大稀釋梯度下挑取不同形態(tài)的典型菌落，進(jìn)行觀察、編號(hào)、劃線分離和純化。

1.7 菌落形態(tài)及個(gè)體形態(tài)觀察

根據(jù)微生物學(xué)試驗(yàn)手冊(cè)[9]，從菌落形狀、氣味、邊緣等方面對(duì)分離到的酵母菌菌落形態(tài)進(jìn)行觀察記錄。同時(shí)，以0.1%美藍(lán)溶液為介質(zhì)制片，顯微觀察菌株的細(xì)胞形態(tài)和繁殖方式。以此對(duì)分離到的酵母菌株進(jìn)行初步的形態(tài)聚類。將已分類的菌株接種于PDA斜面，4℃保藏。

1.8 菌株的生理生化試驗(yàn)

糖發(fā)酵試驗(yàn)：將挑選出的5株代表菌（編號(hào)1.4，2.3，3.5，4.2，6.5）用接種環(huán)挑取一環(huán)，分別接種于11種糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖、D-果糖、蔗糖、D-麥芽糖、乳糖、木糖、菊糖、山梨糖、L-阿拉伯糖、D-樹膠醛糖、淀粉）中，每種糖做3個(gè)平行，30℃培養(yǎng)2～3 d，觀察有無氣泡產(chǎn)生和試管顏色變化。

其他生理生化試驗(yàn)：用同樣的方法接種酵母菌于同化氮源培養(yǎng)基、同化乙醇培養(yǎng)基、無維生素基礎(chǔ)培養(yǎng)基和50%葡萄糖液體培養(yǎng)基中，重復(fù)3次，30℃培養(yǎng)24～72 h。觀察酵母菌生長(zhǎng)情況。

1.9 液體富集和DNA提取

室溫下活化保藏菌株，將挑選出的5株代表菌用接種環(huán)挑取一環(huán)，接種于含5 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的試管中，30℃，160 r/min培養(yǎng)48 h后，用改良CTAB法[10]提取酵母菌DNA。

具體的提取方法為：取液體培養(yǎng)物各4.5 mL，12 000 r/min離心10 min，棄上清，用STE洗菌2次，取沉淀于無菌離心管中，對(duì)應(yīng)標(biāo)號(hào)1～5，分別加入經(jīng)65℃預(yù)熱的300 μL 2×CTAB提取緩沖液，加2%β-巰基乙醇（1 mL 2×CTAB提取緩沖液中加2 μL的2%β-巰基乙醇），65℃水浴中輕輕混勻，加400 μL 10%SDS，10 μL 10 mg/mL蛋白酶-K，混勻，置于65℃水浴1 h，每隔10 min上下?lián)u晃混勻，冷卻至室溫。在離心管中加入等體積Tris-飽和酚、氯仿進(jìn)行抽提，上下緩慢搖晃，12 000 r/min離心10 min，吸上清至無菌離心管中，取與無菌離心管中液體等體積的氯仿抽提，上下緩慢搖晃多次之后，12000r/min離心10min，將所得上清液吸出置于新的無菌離心管中，加入2倍體積的異丙醇，上下輕輕振蕩，可見白色絮狀沉淀析出。將沉淀用1 mL 75%乙醇洗滌2次，風(fēng)干后溶于50 μLTE，60℃水浴1 h，4℃過夜溶解。

1.10 PCR反應(yīng)

ITS5區(qū)域PCR擴(kuò)增：以提取到的基因組為模板，用真菌通用引物ITS4-ITS5擴(kuò)增酵母菌的ITS序列，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。反應(yīng)體系（50 μL）：5 μL 10×Trans Easy Taq Buffer；2 μL dNTP；引物（20 mmol/L）各4 μL；1 μLTrans Easy Taq DNA polymerase；2 μL DNA模板；ddH2O補(bǔ)至50 μL。陰性對(duì)照用ddH2O代替模板。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，34個(gè)循環(huán)后；72℃保溫10 min[11]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，UV凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 晉西北酸粥酵母菌計(jì)數(shù)

因YGC平板上10-4，10-5稀釋梯度下的菌落密度大不適宜計(jì)數(shù)，故選取10-6稀釋梯度的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其結(jié)果列于表1。

由表1可知，酸粥中的酵母菌總數(shù)在2.81～ 3.43 lgcfu/mL。酵母菌在發(fā)酵過程中的數(shù)量呈現(xiàn)“增加—恒定—增加—降低”的變化趨勢(shì)。

表1 酸粥樣品中的酵母菌計(jì)數(shù)lgcfu/mL

2.2 晉西北酸粥酵母菌的形態(tài)特征

分離純化后共得到41株酵母菌。其中，樣品1分離出5株，分別編號(hào)為1.1，1.2，1.3，1.4，1.5；樣品2分離出8株，分別編號(hào)為2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8；樣品3分離出6株，分別編號(hào)為3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6；樣品4分離出7株，分別編號(hào)為4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7；樣品5分離出8株，分別編號(hào)為5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8；樣品6分離出7株，分別編號(hào)為6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7。

表2 酵母菌菌落形態(tài)描述

根據(jù)41株酵母菌在PDA和WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征，將其區(qū)分為5種類型（表2）。挑選5株代表菌（編號(hào)1.4，2.3，3.5，4.2，6.5，分別用A，B，C，D和E表示）鏡檢。5株酵母菌在顯微鏡下可分為2種形態(tài)類型（圖1），一種為橢圓形，另一種為圓形，繁殖方式均為芽殖。

2.3 酵母菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果

從表3可以看出，5株菌均可以利用葡萄糖和D-果糖，均不可以利用菊糖、乳糖、L-阿拉伯糖和D-樹膠醛糖。菌株A，B，C，D可以利用木糖和山梨糖。菌株E可以利用蔗糖和D-麥芽糖。菌株A，B，C，D不能利用淀粉，而菌株E為可變反應(yīng)。

由表4可知，5株菌均不能產(chǎn)生類淀粉物質(zhì)，不可以利用硝酸鹽。菌株A，B，C，D都耐高滲透壓，可以同化乙醇，能合成自身需要的全部維生素，可以利用硫酸鹽，且A，B，C與D相比長(zhǎng)勢(shì)較好。菌株E只能在37℃生長(zhǎng)。

2.4 PCR結(jié)果

用改良的CTAB法提取5株酵母菌DNA，經(jīng)ITS序列擴(kuò)增后凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在500～800 bp有明亮的特異性條帶，與預(yù)測(cè)的理論值基本相符（圖2）。

表3 酵母菌糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

表4 其他生理生化試驗(yàn)結(jié)果

2.5 分子鑒定

將5株典型的酵母菌株A，B，C，D和E的ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，將獲得的序列提交GenBank，經(jīng)BLAST比對(duì)，結(jié)果表明，菌株A與庫(kù)德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）KP674517.1和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）EF198000.1的同源性均為99%；菌株B與庫(kù)德畢赤酵母（P.kudriavzevii）LC014798.1的同源性為99%；菌株C與庫(kù)德畢赤酵母（P.kudriavzevii）KP674517.1和東方伊薩酵母（I.orientalis）EF198000.1的同源性均為100%；菌株D與東方伊薩酵母（I.orientalis）EF198000.1的同源性為99%；菌株E與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）KP723678.1的同源性為99%。綜合以上形態(tài)特征及生理生化特征，采用《酵母菌特征及鑒定手冊(cè)》[12]介紹的方法，對(duì)5株酵母進(jìn)行分類，可以將菌株A，B和C鑒定為Pichia kudriavzevii，菌株D鑒定為Issatchenkia orientalis，菌株E鑒定為Saccharomyces cerevisiae。

3 討論

糜米發(fā)酵成酸粥后，因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提高，儲(chǔ)存期延長(zhǎng)，深受黃河沿岸老百姓的喜歡。酸粥利用附著在谷物上的微生物自然發(fā)酵，在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生功能性低聚糖、多肽與氨基酸、抗氧化活性物質(zhì)和降低膽固醇及血壓的物質(zhì)等[13]，因而被賦予了特殊的保健功能。

白梅等[14]從內(nèi)蒙古地區(qū)的28份酸粥樣品中分離到的酵母菌有Issatchenkia orientalis，Saccharomyces cerevisiae和Candida pararugosa等9種酵母，I.orientalis為優(yōu)勢(shì)菌株。陳忠軍[15]從內(nèi)蒙古河套地區(qū)酸粥中分離出了裂殖酵母（Schizosaccharomyces spp.）、小橢圓接合酵母（Zygosaccharomyces microellipsoides）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。而本試驗(yàn)則從晉西北酸粥中共分離出3種酵母，分別為：P.kudriavzevii、S.cerevisiae和I.orientalis。就分離出的酵母種類而言，比內(nèi)蒙古地區(qū)酸粥中酵母菌種類少，這可能是由地域、氣候、谷物種類和制作方法所致。

Issatchenkia spp.和Saccharomyces spp.是以植物為底物進(jìn)行酸發(fā)酵時(shí)較為常見的菌[16-18]。在烏干達(dá)的一種粥中分離出東方伊薩酵母（I.orientalis），它對(duì)該食品的發(fā)酵和成熟都有重要的作用[19]。畢赤酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵產(chǎn)生的酯類、酸等對(duì)改善發(fā)酵谷物食品的口感、風(fēng)味有著重要的作用[20]。此外，在發(fā)酵過程中，乳酸菌和酵母菌存在著共同代謝關(guān)系，酵母菌會(huì)為乳酸菌提供維生素和其他生長(zhǎng)因子，而乳酸菌生長(zhǎng)造成的酸性環(huán)境也會(huì)影響酵母菌的種類[17]。

通過研究晉西北酸粥的6個(gè)不同時(shí)段酵母菌的種類變化可以發(fā)現(xiàn)，在晉西北酸粥發(fā)酵的整個(gè)過程中酵母菌有3種并且一直存在。酵母菌數(shù)量在發(fā)酵的第14小時(shí)增長(zhǎng)后基本保持恒定，直至第20小時(shí)數(shù)量出現(xiàn)再次明顯的增長(zhǎng)，之后開始下降。這可能是由發(fā)酵液的pH值改變，不再適宜酵母菌的增長(zhǎng)所造成的。

本試驗(yàn)是利用傳統(tǒng)的研究方法獲得純培養(yǎng)菌株后對(duì)其特性進(jìn)行描述，從而得到微生物的大致類群，然而，自然環(huán)境中有相當(dāng)多的菌種（90%～99%）無法通過傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法培養(yǎng)得到[21-22]。因此，在傳統(tǒng)制作的酸粥中仍可能存在著未知的酵母菌類型，這有待后續(xù)的深入研究。

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Isolation and Identification of Yeasts in the Fermentation Process of Northwestern Shanxi Acid Gruel

LI Wen-ya，CHANGJian，WANGQi
（College ofLife Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

The morphological characteristics,physiological and biochemical experiments combined with molecular biology method was used toidentifythe species ofyeasts in the fermentation process ofnorthwestern Shanxi acid gruel.The results showed that 41 strains of yeasts were isolated in the six periods of the fermentation process of northwestern Shanxi acid gruel.These strains were classified into five types bymorphological characteristics,and identified as respectively Pichia kudriavzevii,Issatchenkia orientalis and Saccharomyces cerevisiae byphysiological and biochemical experiments and ITS4 and ITS5 series analysis.The three kinds ofyeasts existed in the entire fermentation process ofnorthwestern Shansi acid gruel.

northwestern Shanxi acid gruel;fermentation;yeasts;isolation and identification

TS201.3

A

1002-2481（2016）03-0323-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.03.13

2015-11-04

李文亞（1990-），女，山西臨汾人，在讀碩士，研究方向：資源微生物。王琪為通信作者。