儲音越等

[摘要] 目的 觀察金水鮮聯(lián)合放療對肺腺癌A549細胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達的影響，并對其可能的機制進行探討。 方法 常規(guī)培養(yǎng)細胞，隨機分為四組：①對照組（NC組），加入50 μL生理鹽水；②放療組（RT組），單次照射，劑量2 Gy；③金水鮮組（JSX組），加入50 μL金水鮮；④金水鮮聯(lián)合放療組（JSX+RT組），加入50 μL金水鮮后對細胞進行單次放射線照射，劑量為2 Gy。CCK8測量實驗組細胞增殖抑制率，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）及Real Time-PCR檢測各組HIF-1α、VEGF的表達情況。 結(jié)果 CCK8結(jié)果顯示，JSX+RT組增殖抑制最明顯（P < 0.05）。ELISA結(jié)果顯示，在24 h時JSX+RT組HIF-1α、VEGF蛋白表達量分別為（284.27±2.66）、（462.40±3.58）pg/mL。RT-PCR結(jié)果顯示，與其他各組比較，JSX+RT組HIF-1α、VEGF表達量明顯下降（P < 0.05）。 結(jié)論 金水鮮聯(lián)合放療具有抑制腫瘤細胞增殖及HIF-1α、VEGF表達的能力。

[關(guān)鍵詞] 肺腺癌；金水鮮；放射治療；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；血管內(nèi)皮生長因子

[中圖分類號] R734.2 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）10（a）-0004-05

Effect of Jinshuixian combined with radiotherapy for the apoptosis of A549 cells and the expression of HIF-1α and VEGF

CHU Yinyue1 GE Wei1 SONG Jing1 ZHOU Fangzheng2 ZHOU Haibo2 ZHANG Dongsheng2 NIE Long2 SUN Yanyan2

1.Department of Cancer Center， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China； 2.Department of Oncology， Suizhou Central Hospital， Hubei Province， Suizhou 441300， China

[Abstract] Objective To observe the effect of Jinshuixian combined with radiotherapy on the expression of hypoxia inducible factor-1 alpha （HIF-1α） and vascular endothelial growth factor （VEGF） in A549 cells of lung adenocarcinoma， and to explore its possible mechanisms. Methods The cells were cultured generally， and they were randomly divided four groups： ①control group （NC group） was added with 50 μL saline； ②radiotherapy group （RT group） was given single irradiation， the radiation dose was 2 Gy； ③Jinshuixian group （JSX group） was added with 50 μL Jinshuixian； ④Jinshuixian + radiotherapy group （JSX+RT group）， the cells were irradiated with a single radiation dose of 2 Gy after added 50 μL Jinshuixian. The CCK8 assay was used to measure the proliferation inhibitory rates of experimental groups， enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and real time-PCR were introduced to test the expression of HIF-1α， VEGF. Results CCK8 test showed that the capable of inhibiting proliferation of JSX+RT group was the highest （P < 0.05）. ELISA experiment showed that the expression of HIF-1α， VEGF in JSX+RT group were （284.27±2.66）， （462.40±3.58） pg/mL in 24 h. RT-PCR experiment revealed that the expression of HIF-1α， VEGF in JSX+RT group were obviously lower than other groups （P < 0.05）. Conclusion Jinshuixian combined with radiotherapy has the ability of blocking proliferation and inhibiting the expression of HIF-1α and VEGF.

[Key words] Lung adenocarcinoma； Jinshuixian； Radiotherapy； Hypoxia induced factor-1α； Vascular endothelial growth factor

在我國肺癌的發(fā)病率及病死率均居前位[1]，5年生存率較低，僅為18%左右。由于早期缺乏特異性臨床表現(xiàn)，大多數(shù)患者在確診時已是臨床晚期[2]，失去了手術(shù)的機會。大部分的患者需要接受放射治療，放療破壞腫瘤細胞DNA等遺傳物質(zhì)發(fā)揮殺傷作用，促進腫瘤細胞死亡。但放療靶區(qū)周圍正常組織以及心血管等重要的組織器官對放療劑量的最大承受力是目前提高靶區(qū)放療劑量的重要限制因素。因此對放療增敏靶點的研究及聯(lián)合治療的探究是目前的研究熱點之一。近年來，我國自主研發(fā)的具有抗腫瘤血管生成作用的中藥越來越多，如金龍膠囊、金水鮮膠囊已受到業(yè)內(nèi)的廣泛關(guān)注，然而其聯(lián)合應(yīng)用提高療效的機制正在研究中。金水鮮具有減輕患者癥狀、改善患者生活質(zhì)量、減輕放化療副作用、改善治療效果等作用[3]。對于金水鮮聯(lián)合放療可提高放療的效果，在近期研究中有報道，通過抑制腫瘤血管新生可能是其提高放療效果的有效機制[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)代鮮藥金龍膠囊具有抑制肺腺癌A549的增殖能力，并能誘導(dǎo)其凋亡[5]，在動物模型中一定濃度的金龍膠囊可以抑制新血管網(wǎng)絡(luò)的形成[6]。1990年，F(xiàn)olkman博士提出的Folkman理論，為血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。VEGF對血管的通透性有促進作用，內(nèi)皮細胞是VEGF的主要靶點，腫瘤細胞釋放的VEGF導(dǎo)致腫瘤血管的生成。Fang等[7]證明三羥黃酮通過降低腫瘤組織內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）和VEGF的表達，明顯抑制活體內(nèi)腫瘤血管的發(fā)生，且HIF-1α與VEGF的關(guān)系非常密切。本實驗通過觀察金水鮮聯(lián)合放療對肺腺癌A549細胞HIF-1α、VEGF蛋白及mRNA表達的影響，進而探討金水鮮聯(lián)合放療能否對HIF-1α、VEGF產(chǎn)生明顯抑制及其臨床意義，對抗血管生成治療理論進行補充。

1 材料與方法

1.1 材料

A549人肺腺癌原代細胞購于武漢大學(xué)細胞典藏中心，金水鮮膠囊凍干粉（北京建生藥業(yè)有限公司惠贈，中國），CCK8試劑盒（碧云天，中國），Trizol（Invitrogen公司，美國），SYBRR Green Real time PCR Master Mix（TOYOBO公司，日本），PCR引物（谷歌生物，中國），HIF-1α ELISA試劑盒，VEGF ELISA試劑盒（Santa Cruz公司，美國），1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗（HyClone 公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 用含胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)肺腺癌A549細胞，放入溫度為37℃、CO2濃度為5%的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)后，隨機分為四組：①對照組（NC組）：50 μL生理鹽水；②放療組（RT組）：放射線劑量2 Gy，單次照射，照射源距離細胞表面的距離為1 m左右；③金水鮮組（JSX組）：50 μL金水鮮加入一定體積的培養(yǎng)液中；④金水鮮聯(lián)合放療組（JSX+RT組）：50 μL金水鮮加入一定體積的培養(yǎng)液后迅速對細胞進行單次放射線照射，劑量為2 Gy，照射源距離細胞表面的距離為1 m左右。處理所用藥物為金水鮮膠囊凍干粉，用生理鹽水稀釋，配成50 mg/mL金水鮮膠囊懸液。

1.2.2 CCK8測定腫瘤細胞增殖情況 制細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細胞濃度，在96孔板中接種，培養(yǎng)，過夜。同時設(shè)置空白組，即僅含培養(yǎng)基不含細胞；并在96孔板周圍隔空加100 μL PBS。按實驗分組分別處理細胞，每組5個復(fù)孔，37℃培養(yǎng)。處理后分別培養(yǎng)6、12、18、24 h后每孔加入10 μL CCK8溶液，37℃孵育2 h。OD450測定各孔吸光值。

1.2.3 ELISA法檢測各組 HIF-1α、VEGF蛋白表達情況 分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔，向標(biāo)準(zhǔn)品孔加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，在待測樣品孔中先加樣品稀釋液80 μL及待測樣品20 μL，輕搖，37℃孵育30 min；棄反應(yīng)液，甩干，洗滌液洗滌，輕搖30 s，去洗滌液，用吸水紙拍干，重復(fù)5次，每次浸泡1～2 min；除空白孔外，每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，輕搖，37℃，30 min；棄反應(yīng)液，洗滌液洗滌，方法同上；每孔加入顯色劑A 100 μL，再加入顯色劑B 100 μL，輕搖，37℃避光，30 min；取出酶標(biāo)板，加入終止液50 μL，終止反應(yīng)，觀察顏色變化；以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的光密度（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及對應(yīng)OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，根據(jù)樣品OD值及回歸方程計算對應(yīng)樣品濃度。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 RT-PCR檢測各組HIF-1α、VEGF信使RNA表達差異 提取各組細胞RNA，以b-actin為內(nèi)參，其基因序列是F 5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTC-3'，R 5'-TAAAGACCTCTATGCCAACAC-3'；HIF-1α：F 5'-TGATGACCAGCAACTTGAGG-3'，R 5'-TGGGGCATGG TAAAAGAAAG-3'；VEGF：F 5'-ACATCTTCAAGCCG TCCTGT-3'，R 5'-GCATTCACATCTGCTGTGCT-3'。逆轉(zhuǎn)錄cRNA，反應(yīng)體系RNA 4.744 μg；Oligo（dT）15（10 μmol/L）2 μL；dNTP（2.5 mmol/L）2 μL；dd H2O（Rnase free）Up to 14.5 μL。半定量RT-PCR檢測，b-actin f（10 μmol/L）0.5 μL；b-actin r（10 μmol/L）0.5 μL；dNTP（2.5mmol/L）2 μL；Ex Taq 0.25 μL；10×Ex Taq E buffer 2.5 μL；cDNA 1 μL；dd H2O Up to 25 μL。實時熒光定量PCR，b-actin f（100 μmol/L）0.4 μL；b-actin r（100 μmol/L）0.4 μL；SYBR Green/Flourescein 10 μL；qPCR Master Mix（2X）H2O 5.4 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；擴增循環(huán)條件為：94℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 40 s，共40個循環(huán)。每個反應(yīng)管熒光信號值到達設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值。采用ΔΔCt的方法計算HIF-1α、VEGF mRNA的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組均數(shù)間的比較使用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同處理方式對各組A549細胞抑制情況

各個不同處理組的肺腺癌A549細胞生長抑制率不同，具有明顯的時效性，抑制作用隨著處理時間的延長而增強。其中JSX+RT組與RT組對肺腺癌A549細胞的生長抑制作用較JSX組更為明顯（P < 0.05），RT組對A549細胞生長抑制率與JSX組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

表1 不同處理組肺腺癌A549細胞不同時間點的抑制率（%，x±s，n = 4）

注：與RT組比較，*P < 0.05；與JSX組比較，#P < 0.05；RT：放療；JSX：金水鮮

2.2 各組A549細胞中HIF-1α、VEGF蛋白表達情況

與NC組比較，各處理組A549細胞HIF-1α、VEGF的表達量均有呈下降趨勢，且JSX+RT組在24 h時HIF-1α、VEGF表達量顯著下降。統(tǒng)計分析顯示，在處理前（0 h）各個不同處理組中HIF-1α、VEGF的蛋白表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。處理后24 h內(nèi)，與NC組比較，各處理組HIF-1α、VEGF表達量均有所下降；處理24 h時，與其他各組比較，JSX+RT組HIF-1α、VEGF蛋白均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2～3。

2.3 各處理組A549細胞中HIF-1α、VEGF mRNA表達情況

經(jīng)RT-PCR擴增后，統(tǒng)計分析顯示，在處理前（0 h）各個不同處理組中HIF-1α、VEGF mRNA表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。處理后24 h內(nèi)各處理組HIF-1α、VEGF mRNA表達量均有所下降；但在處理24 h時，JSX+RT組與其他各組比較，HIF-1α、VEGF mRNA明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），JSX組與NC組比較差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表4～5。

3 討論

據(jù)最新調(diào)查研究顯示[8-9]，2012年全球有820萬人死于癌癥，預(yù)計到2030年每年死于癌癥的人口將達到1300萬人。肺癌是我國常見的惡性腫瘤之一，放化療是其晚期患者術(shù)前及術(shù)后常用的輔助治療手段，以達到對腫瘤的最大殺傷及控制，提高患者的生存時間，降低手術(shù)復(fù)發(fā)率[10-11]。但，目前，肺癌患者的治療現(xiàn)狀并不樂觀。近年來隨著基因工程的大力發(fā)展，靶向治療成為治療腫瘤的重要手段。Folkman學(xué)者在20世紀(jì)70年代提出腫瘤新生血管在腫瘤發(fā)展中的重要意義，腫瘤細胞的增殖依賴其新生血管供氧及能量，且轉(zhuǎn)運代謝產(chǎn)物，如CO2、乳酸等。有研究發(fā)現(xiàn)[12]，腫瘤體積大于2 mm時需要新生血管為其生長提供所需營養(yǎng)物質(zhì)。由于促血管生成的通路在許多實體瘤的生長轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用，故促血管生成通路已被確立為實體瘤的重要治療靶點[13-14]。腫瘤血管的新生在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移的過程中扮演著重要作用，涉及一個高度復(fù)雜的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)途徑，包括腫瘤細胞的自分泌及周圍基質(zhì)細胞的旁分泌等。眾多研究報道表明，乏氧是血管新生的關(guān)鍵因素[15-17]，可顯著刺激促血管生成因子的表達。同時，乏氧也是影響放療療效的關(guān)鍵，以及放射治療后腫瘤復(fù)發(fā)的重要因素[18-20]。放療對促血管新生因子也具有影響作用，研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞接受不同劑量照射后，VEGF水平不同程度的升高，影響腫瘤血管新生，導(dǎo)致放療耐受[21]?？寡苄律幬锟筛纳颇[瘤組織血管紊亂結(jié)構(gòu)，使其接近正常血管的結(jié)構(gòu)和功能，此為血管正?；碚?。血管正?；罂筛纳颇[瘤組織局部血供，降低其間質(zhì)壓力，提高氧分壓，繼而增強放療敏感性[22]。研究發(fā)現(xiàn)，放療結(jié)束后應(yīng)用抗血管新生藥物可顯著降低腫瘤的局部復(fù)發(fā)率[41]，此機制可能與腫瘤血管正?；嚓P(guān)。現(xiàn)代鮮藥作為腫瘤中醫(yī)藥治療的特色，采用現(xiàn)代萃取工藝，最大限度地保留了其活性成分，以其獨特的優(yōu)勢為我國鮮藥廣泛應(yīng)用于臨床提供了依據(jù)和保障。21世紀(jì)初，金龍膠囊以及金水鮮膠囊的研制為抗腫瘤治療提供了新的選擇。近年來已有大量臨床試驗證實抗血管新生治療可改善放療敏感性，提高放療效果[23-24]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，放射治療腫瘤時聯(lián)合中醫(yī)中藥治療，不僅能減輕其副作用，而且具有抗腫瘤療效[25]。但中醫(yī)中藥對腫瘤放療增敏的作用機制缺乏相應(yīng)的基礎(chǔ)實驗研究，尚未完全闡明。

在金水鮮聯(lián)合放療對肺腺癌A549細胞的增殖抑制試驗中，結(jié)果表明，與NC組比較，各處理組細胞增殖均受到顯著抑制作用，尤其是JSX+RT組細胞抑制率最高，明顯高于其他處理組（P < 0.05），并且具有時間依賴性。推測金水鮮可能具有抑制腫瘤細胞增殖的能力。腫瘤細胞經(jīng)放射線照射后，細胞中的遺傳物質(zhì)經(jīng)放射性的直接作用，以及氧自由對遺傳物質(zhì)的間接作用，對細胞的正常周期具有阻滯作用，從而引起腫瘤細胞的增殖抑制以及細胞壞死。VEGF是腫瘤新生血管形成的最有效和特異的因子。臨床研究表明腫瘤中VEGF的表達量與其血管密度密切相關(guān)，同時也與腫瘤惡性程度以及患者預(yù)后相關(guān)[26-27]。當(dāng)腫瘤組織處于缺氧狀態(tài)，其細胞相互連接為“擬態(tài)血管”，為腫瘤早期供氧。由VEGF介導(dǎo)的腫瘤新血管不同于正常血管[28]，其能增高腫瘤的轉(zhuǎn)移概率。實驗結(jié)果表明，金水鮮聯(lián)合放療可以顯著抑制HIF-1α、VEGF蛋白及mRNA的表達。乏氧以及營養(yǎng)供應(yīng)不足是實體腫瘤常見的主要特點。在實體瘤中，由迅速增殖的腫瘤細胞導(dǎo)致腫瘤中心區(qū)域供血不充分，從而發(fā)生缺血壞死。VEGF及其信號通路介導(dǎo)腫瘤組織中新生脈管的形成，其在腫瘤血管生成、重塑中發(fā)揮著重要作用。在缺氧環(huán)境下，腫瘤細胞亦處于乏氧狀態(tài)，對射線的低能量線性傳遞產(chǎn)生抵抗，降低其對放射線的敏感性。HIF-1是乏氧的關(guān)鍵因子，研究表明，當(dāng)HIF-1α復(fù)合物結(jié)合至VEGF啟動子時，乏氧誘導(dǎo)VEGF的轉(zhuǎn)錄[21]。HIF-1在促進腫瘤血管新生中具有重要作用，在乏氧情況下，腫瘤細胞通過表達HIF-1調(diào)控其增殖及血管新生，從而促進腫瘤發(fā)展。也有研究證實放療及化療均促進HIF-1α的表達，進而促進多種促腫瘤生長因子的表達，如VEGF、bFGF、EGF等，刺激腫瘤血管新生[29]。有實驗表明這些相關(guān)蛋白（如HIF-1α、VEGF等）不僅能誘導(dǎo)腫瘤細胞對放化療的抵抗，而且增強腫瘤細胞的存活能力，抑制與之相關(guān)的蛋白，如HIF-1α，可使放療增敏[30]。本研究中，各組細胞在不同處理方式處理24 h時，JSX+RT組與其他各組比較，HIF-1α和VEGF mRNA表達均有統(tǒng)計學(xué)差異（P < 0.05），表明金水鮮能夠抑制腫瘤細胞分泌HIF-1α和VEGF；金水鮮與放療聯(lián)用對HIF-1α和VEGF的抑制作用更明顯。因此推斷金水鮮膠囊聯(lián)合放療可能下調(diào)HIF-1α及VEGF基因的表達，這可能是其放療增敏作用的機制之一。

綜上所述，通過金水鮮聯(lián)合放療可以抑制腫瘤細胞增殖及VEGF、HIF-1α的表達，其機制可能與HIF-1α、VEGF表達的調(diào)控相關(guān)，從而抑制血管生成因子對腫瘤血管新生的促進作用得以實現(xiàn)。然而本研究僅為體外實驗，條件單一，所得結(jié)論尚需進一步驗證，有待后續(xù)研究。

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（收稿日期：2016-04-11 本文編輯：張瑜杰）