■ 許友卿 李偉峰，2 鄭一民 丁兆坤*

(1.廣西大學水產科學研究所，廣西南寧530004；2.廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室(欽州學院)，廣西欽州535011)

高度不飽和脂肪酸(Highly unsaturated fatty acids,HUFAs)是海水魚的必需脂肪酸(Essential fatty acids,EFAs)，如二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA,C22∶6n-3)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA,C20∶5n-3)和二十碳四烯酸(Arachidonic acid,AA,C20∶4n-6)[1-3]。HUFAs在維持機體的正常機能、促進生長、發(fā)育、繁殖和提高成活率等方面發(fā)揮重要的生理功能[4-5]。

魚油(FO)富含的n-3 HUFAs，不僅是海水魚必需脂肪酸，還能增加飼料的適口性[6]。然而，隨著水產養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，海洋漁業(yè)資源日益減少，魚油(FO)供應越來越有限[7-8]，務必選用替代品。植物油來源廣，供應穩(wěn)定，質量可靠，而且價格低廉。選用植物油作為魚油替代品，既可減少對魚油的依賴，又可降低養(yǎng)殖成本[9]。蘇籽油(perilla oil，PO)含有70%亞麻酸(C18∶3n-3)[10]，紅花油(safflower oil，SO)含有80%亞油酸(C18∶2n-6)[11]，兩者均可被脂肪酸去飽和酶和延長酶轉化為HUFAs，而且價廉物美，用之替代魚油的前景廣闊[12]。

然而，與淡水魚相異，大部分海水魚由于缺少脂肪酸去飽和酶和（或）延長酶，不能合成或合成的HUFAs不能滿足其生理需要，只能從日糧攝取HUFAs[13-14]。一些廣鹽性海水魚類（如大西洋鮭和黃斑藍子魚等）表現出“淡水魚模式”，能夠將植物油中C18∶2n-6和C18∶3n-3分別轉化成AA、EPA和DHA等HUFAs[15-16]。軍曹魚生長快、肉質細嫩、營養(yǎng)價值高，是我國南方人工網箱養(yǎng)殖的優(yōu)良海水魚種之一[17-18]。目前還未發(fā)展合適的人工配合飼料，尚需研究軍曹魚的營養(yǎng)生理[19-21]。軍曹魚能否利用植物油，把其中C18∶2n-6和C18∶3n-3分別轉化成AA、EPA和DHA等值得研究。

我們前期研究發(fā)現，軍曹魚具有Δ6和Δ5脂肪酸去飽和酶以及延長酶[22]，因此假設軍曹魚具有轉化多不飽和脂肪酸(PUFAs)為AA、EPA和DHA等HUFAs的能力；添加PUFAs可促進軍曹魚(Rachycentron canadum)生長、核酸代謝。本文用添加不同種類PUFAs的飼料投喂軍曹魚幼魚，對魚生長和核酸代謝的影響，并討論了其機理。

1 材料和方法

1.1 飼料原料

北太平洋白魚粉(蛋白質≥65%，脂肪≤10%)和魚油(EPA+DHA≥20%)均購自美國seafood公司；維生素混合物和礦物質混合物購自青島杰海飼料有限公司；蘇籽油(C18∶3n-3≥70%)和紅花油(C18∶2n-6≥79%)購自江西吉平天然植物油有限公司；其他飼料原料均是食品級，購自中國的不同生物公司。

1.2 試驗設計與飼料組成

本試驗設計和各組飼料配方主要參考了我們前期的研究[23]，同時參考了Kamarudin等(2012)[24]和Zhou等(2012)[25]的報告。在基礎飼料中分別添加6%的魚油(FO組）、蘇籽油(PO組)、紅花油(SO組)以及添加3%的魚油和3%的紅花油(FO+SO組)。各組飼料配方和營養(yǎng)成分見表1。

表1 試驗飼料配方及營養(yǎng)成分

1.3 試驗魚、馴化、養(yǎng)殖和采樣

試驗用軍曹魚，購自廣東省湛江市流沙鎮(zhèn)海水魚育苗場，養(yǎng)殖試驗在廣西水產研究所防城企沙南美白對蝦研究基地的養(yǎng)殖車間進行。用對照組日糧馴化23 d魚齡的軍曹魚2周后，挑選47 d魚齡，初始體重為(12.60±0.35)g的軍曹魚幼魚825尾，隨機分為5個組，每組3個平行，每桶55尾魚(每桶容積400 L)，用5組不同的日糧投喂：①對照日糧(CO)僅含基礎飼料；②魚油日糧(FO)為基礎飼料添加6%魚油(富含n-3 PUFAs)；③蘇籽油日糧(PO)為基礎飼料添加6%蘇籽油(富含 C18∶3n-3，LNA)；④紅花油日糧(SO)為基礎飼料添加6%紅花油(富含C18∶2n-6，LA)；⑤紅花油+魚油日糧(SO+FO)為基礎飼料添加3%紅花油(富含n-6 PUFAs)和3%魚油(富含n-3 PUFAs)。試驗養(yǎng)魚用過濾和曝氣海水，水溫28.0～32.0 ℃，鹽度26.0～29.0，pH值7.8～8.5，溶氧≥6 mg/l。每天于8：00和17：00投喂，日投喂量為當時魚體重的5%。

分別于0周和12周隨機取全魚和組織或器官樣品。0周共取樣品魚37尾，其中9尾全魚樣品，解剖28尾取組織或器官樣品。第12周末，每個養(yǎng)殖桶隨機取全魚3尾，另6尾解剖取組織或器官樣品。取樣前，魚禁食24 h，用1/13 000的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222,Sigma,St.Louis,MO,USA)逐尾將魚麻醉2～3 min，用紗布吸干體表水分，稱體重、量體長和全長。用注射器從心臟采血至EP管中，血液于室溫靜置0.5 h后，3 800×g離心12 min取血清。然后分別解剖魚體取腦、肝臟、心臟、腎臟和背大肌(去皮)，并用0.65%魚用生理鹽水清洗組織或器官樣品表面附著的血液，各組織或器官稱重和記錄。把解剖好的各組織或器官分別妥裝于樣品袋中，標注固定好，于液氮中速凍，然后轉至-80℃冰箱保存待測定(Ding等，2017)。

1.4 提取魚組織或器官樣品總RNA和DNA

稱100 mg軍曹魚肝臟(或腦、肌肉、心臟、腎臟)樣品，于液氮條件下，用研缽迅速將樣品研成粉末后，將樣品粉末迅速轉入已預冷并于4℃的玻璃勻漿器中充分勻漿(血清樣品無需研磨和勻漿)，根據標準Trizol抽提法，用RNAiso plus試劑(Takara，大連寶生物工程有限公司)提取總RNA。

用UNIQ-10柱式動物基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程技術有限公司)抽提組織DNA(血清樣品無需研磨和勻漿)。用Nanodrop 1200微量核酸蛋白分析儀(Thermo，USA)分別測定和計算樣品總RNA和DNA濃度。

1.5 計算公式和數理統(tǒng)計

式中：CRNA——每毫克樣品中RNA的含量(μg/mg)；

CDNA——每毫克樣品中DNA的含量(μg/mg)；

CA和CB——分別為測定的DNA和RNA濃度；

100(μl)——樣品DNA和RNA被稀釋體積；

1 000——ng和μg的換算倍數；

M——樣品重量(mg)。

相對增重率(RWG，%)=(Wt-Wi)/Wi×100。

式中：Wt——最終體重；

Wi——最初體重。

用SPSS 19.0數據處理軟件對組間數據進行單因素統(tǒng)計分析，得出平均值、標準差和標準誤等值，并用Duncan's法對平均數進行多重比較(P＜0.05)。

2 結果

2.1 投喂不同PUFAs添加劑對軍曹魚幼魚生長的影響

用添加不同PUFAs的飼料投喂軍曹魚幼魚12周，其生長受到不同程度的影響，其中SO+FO組魚體重(143.73 g)顯著高于SO組魚(127.40 g)(P＜0.05)和CO組魚(121.46 g)(P＜0.05)。但SO+FO、FO組和PO組魚體重間無顯著差異(P＞0.05)(圖1A)，用添加不同PUFAs的飼料投喂的各組軍曹魚的相對增重率(RWG)均分別顯著高于CO組(P＜0.05)(圖1B)。

圖1 不同PUFAs添加劑投喂軍曹魚幼魚12周，對其體重(BW，圖1A)和相對增重率(RWG，圖1B)的影響

2.2 投喂不同PUFAs添加劑對軍曹魚幼魚組織或器官核酸代謝的影響

用添加不同PUFAs的飼料投喂軍曹魚幼魚12周，不同程度的影響其肌肉、肝臟、腦、心臟、腎臟和血清的核酸代謝(見表2)，以肌肉為例，SO+FO組魚合成RNA 最多，為[(239.48±0.79)μg/mg]，顯著高于 PO[(201.19±0.81)μg/mg]、SO[(194.86±0.93)μg/mg]組和CO[(143.44±1.25) μg/mg]組(P＜0.05)。SO+FO 組魚RNA/DNA比值也顯著高于CO、PO組和SO組魚(P＜0.05)。

表2 添加不同PUFAs的飼料投喂軍曹魚幼魚12周，對其肌肉、肝臟、腦、心臟、腎臟和血清核酸代謝的影響

線性回歸分析顯示(見圖2)，軍曹魚幼魚組織或器官RNA/DNA比值與體重的相關性隨組織或器官不同而異，肌肉的RNA/DNA比值與體重的相關性呈顯著正相關（R2=0.956 9），依次是肝臟(R2=0.905 5)、腦(R2=0.775 7)、心臟(R2=0.527 4)、腎臟(R2=0.502 8)和血清(R2=0.419 3)，其中血清的RNA/DNA比值與體重的相關性最低。

3 討論

我們發(fā)現，PUFAs是影響魚生長的重要因素之一，而且n-3和n-6 PUFAs的比例也顯著影響魚的生長。試驗結果表明，用不同PUFAs添加劑投喂的各組魚體重和相對增重率均顯著高于對照組(CO)(P＜0.05)(見圖1)，依次為：SO+FO組＞FO組＞PO組＞SO組＞CO組。除CO組外，SO+FO組魚的生長效果最好，SO組魚最低。這是因為SO組魚飼料的∑n-3 PUFAs含量最低(3.44%)，∑n-6 PUFAs含量最高(42.45%)，∑n-3 PUFAs和∑n-6 PUFAs的比值最低，為0.08%，促進生長的能力最低；相反地，PO組魚飼料的∑n-3 PUFAs含量最高(35.53%)，∑n-6 PUFAs含量最低(12.58%)，∑n-3 PUFAs和∑n-6 PUFAs的比值最高(2.82%)，促進魚生長的能力較高，但不是最高；而SO+FO組日糧含有較高的∑n-6 PUFAs(27.44%)和較高的∑n-3 PUFAs(17.42%)，∑n-3 PUFAs和∑n-6 PUFAs比值適中，為0.63%(見表1)，促進魚生長的能力最高?？梢?，∑n-3 PUFAs和∑n-6 PUFAs對軍曹魚的生長都是必要的。其理由n-6和n-3 PUFAs都是軍曹魚所必需。n-6和n-3 PUFAs都是海水魚的必需脂肪酸[26]。在海水稚幼魚階段，DHA和AA在神經細胞和視覺細胞中，特別是視桿細胞外節(jié)膜和突觸膜中含量很高[27]，說明DHA和AA在神經和視覺系統(tǒng)發(fā)育及其功能的重要性；PUFAs，尤其是AA和EPA，是類花生酸的重要前體[28]。類花生酸是一類重要的旁分泌激素，參與機體一系列的生理活動，包括發(fā)育、免疫和繁殖[29]。并在介導和調控各種細胞活動中發(fā)揮動態(tài)作用，也是細胞膜的重要組成物質[30]。AA還可顯著影響魚的生長和成活率[31]。另一方面，∑n-3 PUFAs和∑n-6 PUFAs的合理比例對軍曹魚生長也非常重要，∑n-3 PUFAs和∑n-6 PUFAs比值過高或過低都不適宜軍曹魚的生長，只有適宜的比例才適合其生長，而且合理的n-3和n-6 PUFAs比例對軍曹魚的正常生長發(fā)育至關重要。其他某些學者對其他魚種的研究也有相似的報道。Robaina等[32]報道，使用合理的n-3和n-6 PUFAs比例飼料投喂金頭鯛(Sparus aurata)可以提高其生長性能。飼料中n-3和n-6 PUFAs比例顯著影響革胡子鯰(Clarias gariepinus)[33]和軍曹魚[34]的生長和體成分(P＜0.05)。AA、DHA/PEA和AA/EPA是評估魚卵和幼魚質量的重要指標[26,35]。然而，日糧中高比例的n-6/n-3 PUFAs可能增加魚的應激反應，導致心臟疾病[36]。

圖2 用添加不同PUFAs的飼料投喂軍曹魚幼魚12周，對各組魚體重與肌肉、肝臟、腦、心臟、腎臟和血清RNA/DNA比值的回歸關系的影響

同時，我們發(fā)現，只添加n-3 PUFAs比只添加n-6 PUFAs更能促進軍曹魚的生長。這就是PO(富含C18∶3n-3，LA)組魚體重和相對增重率高于SO(富含C18∶2n-6，LNA)組魚的緣故。這些事實主要說明兩個問題：①軍曹魚具有把C18∶3n-3轉化為EPA和DHA以及把C18∶2n-6轉化為AA的能力。這與我們前期研究發(fā)現軍曹魚具有合成HUFAs關鍵酶——Δ6、Δ5脂肪酸去飽和酶和延長酶活性是一致的[22]，證明軍曹魚可以合成HUFAs。飼料中充足的C18PUFAs(LNA和LA)可以激活軍曹魚體內合成HUFAs關鍵酶的脂肪酸去飽和酶和延長酶活性，或(和)促進合成HUFAs關鍵酶的轉錄，以致能將LNA和LA轉化為HUFAs，此是自身因素和營養(yǎng)調節(jié)的結果。Seiliez等[14]發(fā)現，用菜籽油和豆油飼喂金頭鯛(Sparus aurata)幼魚，其Δ6脂肪酸去飽和酶mRNA表達量提高6倍，但是金頭鯛Δ6去飽和酶的兩種轉錄本都被富含HUFAs的日糧所抑制。植物油可提高魚Elovl 2和Elovl 5b mRNA的表達水平，促進HUFAs生物合成過程的延長效率[37-38]。②n-3 PUFAs對軍曹魚幼魚生長的作用大于n-6 PUFAs或說前者更能促進軍曹魚生長。這可能是因為幼魚在快速生長時期需要更多的n-3 HUFAs來維持代謝、滿足生物膜結構完整性以及神經系統(tǒng)的發(fā)育需要[39-41]。EPA對維持海水幼魚細胞膜結構和功能的完整性方面發(fā)揮重要作用[14]。發(fā)育中的幼魚會優(yōu)先將DHA供給神經細胞和視網膜[42-43]。在幼魚早期生長發(fā)育階段，神經組織是機體的主要組成部分[44]。

本試驗發(fā)現，添加PUFAs影響軍曹魚的核酸代謝。這與我們前期研究結果一致，添加EPA、DHA和AA等n-3 HUFAs，可促進軍曹魚(Rachycentron canadum)幼魚的核酸代謝，提高魚RNA/DNA比率，增加蛋白質合成，加速生長；而且不同劑量和比例的EPA、DHA和AA對軍曹魚幼魚核酸代謝影響相異，劑量高的影響大，與魚肌肉核酸代謝成正比，與幼魚生長正相關[45-46]。RNA含量和RNA/DNA比值是體內蛋白質合成能力的生理指標之一，它可以反映機體的營養(yǎng)和生長狀況[47-48]。研究證實，RNA/DNA比值與魚類生長呈正相關，生長良好的魚RNA/DNA比值較大，生長差的魚RNA/DNA比值較小，揭示了RNA/DNA比值與魚類生長之間的變化規(guī)律，用RNA/DNA比值可以更精確地評價魚類近期和長期生長狀況，具有實用價值[49-51]。魚類生長過程的實質是體內蛋白質合成過程，而蛋白質合成取決于RNA量的變化[52]。因此，蛋白質的合成和魚的生長可通過檢測RNA含量來預測[53]。由于DNA含量在魚的細胞中是固定的，DNA含量只與細胞以及核體積密切相關，DNA濃度高，說明單位組織中細胞體積小但數目多，RNA/DNA比值能排除細胞數量的影響而反映出細胞內RNA的濃度。所以，RNA/DNA比值比單獨的RNA濃度能更好地反映出魚體蛋白質合成的水平[54-55]。即使在魚開始生長階段，根據RNA/DNA比值的大小就能夠算出魚類的生長速度[45]。

總而言之，添加PUFAs可提高軍曹魚稚幼魚的生長性能和促進核酸代謝，其肌肉和肝臟的RNA/DNA比值均可作為軍曹魚稚幼魚生長的衡量指標。