■ 李 潔 張孟陽(yáng) 郭 宏 黃 娟 王德培，3*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.天津牧豐飼料有限公司，天津300380；3.工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

發(fā)酵液體飼料（Fermented liquid feed，F(xiàn)LF）是指在 人工控制條件下，料水比按1∶1.5～1∶4的比例混合，通過(guò)微生物自身的代謝活動(dòng)，經(jīng)過(guò)足夠長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵后，形成一種低pH值、狀態(tài)穩(wěn)定、易被畜禽采食、消化、吸收的飼料[1-2]。較干料和液體飼料，發(fā)酵液體飼料具有許多優(yōu)點(diǎn)：①適口性好，易消化；②飼料原料來(lái)源廣泛，如食品工業(yè)副產(chǎn)物，降低生產(chǎn)成本；③符合豬的消化生理特點(diǎn)；④微生物某些代謝產(chǎn)物可消除飼料中的抗影響因子，可減少抗生素的使用；⑤降低腸道pH值，抑制有害菌繁殖，提高腸道健康等[3-4]。李永明等[5]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飼喂發(fā)酵谷物液體料組平均日采食量提高22.63%，豐富腸道微生物菌群多樣性，進(jìn)而改善仔豬生長(zhǎng)性能。陳鮮鑫等[6]用30.88 kg左右的杜×長(zhǎng)×大三元雜交生長(zhǎng)豬進(jìn)行飼喂試驗(yàn)，結(jié)果表明，飼喂發(fā)酵液體飼料組與對(duì)照組相比日增重提高34.03%、采食量提高12.55%、料肉比降低15.84%，飼喂發(fā)酵液體飼料組與未發(fā)酵液體飼料組相比日增重提高16.86%、采食量降低6.44%、料肉比降低19.83%。楊建松等[7]對(duì)仔豬飼料發(fā)酵工藝優(yōu)化后，還原糖含量、酸溶蛋白質(zhì)含量和乳酸含量分別增加了1.23%、1.75%和3.3%，同時(shí)含有大量益生菌，有效抑制大腸桿菌。發(fā)酵液體飼料的品質(zhì)受諸多因素的影響，包括發(fā)酵菌種、溫度、時(shí)間、料水比和日糧組成等。Nuria Canibe等[8]研究顯示，使用3種含有不同乙酸濃度的FLF日糧飼喂仔豬，結(jié)果顯示，高乙酸濃度的FLF略微降低飼料的pH值，在不影響體增重的情況下，降低仔豬的飼料采食量。C.Pedersen等[9]研究液體發(fā)酵飼料對(duì)生長(zhǎng)育肥豬的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干料與水1∶3混合飼料與單純干料相比，有降低日糧GE、DM和CP的回腸消化率的趨勢(shì)。在發(fā)酵過(guò)程中，芽孢菌和乳酸菌能產(chǎn)生多種益生素，能有效抑制腸道有害菌的生長(zhǎng)，維持腸道健康，如郭紅炳等[10]試驗(yàn)結(jié)果表明，在斷奶仔豬飼料中使用益生素，可大幅降低飼料中抗生素的用量，并有減少仔豬腹瀉、提高增重的趨勢(shì)。本文以枯草芽孢桿菌和乳酸菌發(fā)酵仔豬全價(jià)液態(tài)飼料進(jìn)行研究，并通過(guò)仔豬飼喂試驗(yàn)探究發(fā)酵液體飼料對(duì)仔豬生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

枯草芽孢桿菌WL-BA-1（Bacillus subtilis WLBA-1）、枯草芽孢桿菌B10-5（Bacillus subtilis B10-5）、凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）、糞腸球菌LJ(Enterococcus faecalis LJ)，均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（g/l）：蛋白胨10、酵母粉10、NaCl 5，pH值7.5。

淀粉培養(yǎng)基（g/l）：牛肉膏5、蛋白胨5、NaCl 5、可溶性淀粉20、瓊脂18，pH值7.2。

MRS培養(yǎng)基（g/l）：蛋白胨 10、牛肉粉5、葡萄糖20、酵母粉4、乙酸鈉5、磷酸氫二鉀2、硫酸鎂0.2、檸檬酸三銨2、硫酸錳0.05、吐溫80 1，pH值6.2。

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(g/l)：蛋白胨20、乳糖10、牛膽鹽5、NaCl 5、中性紅0.03、瓊脂18，pH值7.0。

1.3 飼料原料

試驗(yàn)所用飼料原料由天津牧豐飼料有限公司提供，將料水重量體積比1∶3.5混合，糊化前經(jīng)檢測(cè)其還原糖含量為0.19%，乳酸、乳酸菌數(shù)均檢測(cè)不出。

1.4 飼料液體發(fā)酵

將飼料與水按一定比例混合后，裝入發(fā)酵瓶中，置于100℃滅菌鍋中糊化20 min，冷卻到室溫后接入相關(guān)菌株種子液，混勻后置于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 還原糖含量的測(cè)定[11]

采用DNS法測(cè)定發(fā)酵飼料中還原糖的含量。

1.5.2 乳酸含量的測(cè)定

稱取發(fā)酵飼料5.00 g置于裝有45 ml蒸餾水的250 ml三角瓶里，充分搖勻并浸提1 h，之后離心取上清液，稀釋相應(yīng)倍數(shù)后用SBA-40 E型生物傳感分析儀測(cè)其中乳酸含量。

1.5.3 活菌數(shù)的測(cè)定[12]

乳酸菌用MRS固體培養(yǎng)基作為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，42℃厭氧培養(yǎng)48 h計(jì)數(shù)；芽孢桿菌用淀粉培養(yǎng)基作為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)，30℃靜置培養(yǎng)24 h計(jì)數(shù)；大腸桿菌用麥康凱培養(yǎng)基作為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，37℃靜置養(yǎng)24 h計(jì)數(shù)。

1.6 發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化

在前期預(yù)試驗(yàn)中，發(fā)酵液體飼料中芽孢菌與乳酸菌比例為1∶1，兩株芽孢菌接種比例為1∶1，兩株乳酸菌接種比例為1∶1，飼料與水比例(W/V)為1∶4，總接種量為8%，發(fā)酵后液體飼料具有酸甜香味，在此基礎(chǔ)上對(duì)各因素進(jìn)行優(yōu)化。

1.6.1 芽孢菌與乳酸菌接種比例的確定

選取芽孢菌與乳酸菌接種比例分別為1∶2，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1這5個(gè)水平進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。

1.6.2 兩株芽孢菌比例的優(yōu)化

選取兩株芽孢菌比例分別為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3這5個(gè)水平進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。

1.6.3 兩株乳酸菌比例的優(yōu)化

選取兩株乳酸菌比例分別為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3這5個(gè)水平進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。

1.6.4 總接種量的確定

選取總接種量分別為4%、6%、8%、10%、12%這5個(gè)水平進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。

1.6.5 料水比的確定

選取料水比分別為1∶3，1∶3.5，1∶4，1∶4.5，1∶5這5個(gè)水平進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。

1.6.6 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響顯著的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。采用L9(34)型三水平三因素正交表，以芽孢菌與乳酸菌接種比例、總接種量、料水比3個(gè)因素作為考察因素，研究對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響。

1.7 發(fā)酵溫度的確定

選取溫度分別為20、26、32、37、42 ℃這5個(gè)水平進(jìn)行分析，20、26℃發(fā)酵5 d，32、37℃和42℃發(fā)酵3 d。

1.8 仔豬飼喂試驗(yàn)

1.8.1 試驗(yàn)動(dòng)物與日糧

微生物發(fā)酵仔豬全價(jià)飼料，飼喂7日齡～35日齡仔豬，共24只，分兩個(gè)處理組，每個(gè)處理組三個(gè)重復(fù)，對(duì)照組飼喂全價(jià)粉料，試驗(yàn)組微生物發(fā)酵仔豬液態(tài)飼料替代50%全價(jià)粉料。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.8.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)仔豬斷奶后立即轉(zhuǎn)入保育舍，圈舍均為高床平養(yǎng)，保持舍內(nèi)通風(fēng)順暢。試驗(yàn)組每天定時(shí)飼喂4次，喂料時(shí)根據(jù)上次喂料采食情況，適當(dāng)增減給料量，使仔豬保持自由采食狀態(tài)。乳頭式飲水器飲水，豬舍溫度控制在25～30℃，每天打掃2次豬舍。其他日常管理按常規(guī)進(jìn)行。

1.8.3 測(cè)定指標(biāo)

詳細(xì)記錄每天圈舍的溫濕度和采食飲水狀況等變化。觀察每天仔豬糞便變化、健康狀況。試驗(yàn)初、中和末期稱重，計(jì)算耗料。計(jì)算平均日耗料、料肉比、日增重、腹瀉率等。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液體飼料芽孢菌與乳酸菌接種比例的優(yōu)化

發(fā)酵液體飼料中兩株芽孢菌接種比例為1∶1，兩株乳酸菌接種比例為1∶1，飼料與水比例(W/V)為1∶4，總接種量為8%，芽孢菌與乳酸菌比例見(jiàn)表2。

由表2可以看出，芽孢菌與乳酸菌接種比例對(duì)發(fā)酵液pH值和發(fā)酵后乳酸和還原糖含量影響相對(duì)較小，且pH值＜4.0，有效抑制有害菌的生長(zhǎng)，芽孢菌與乳酸菌接種比例為2∶1時(shí)，還原糖含量最高，且乳酸含量、芽孢菌數(shù)和乳酸菌數(shù)也有較高的水平，所以確定發(fā)酵液體飼料中芽孢菌與乳酸菌比例為2∶1。

表2 芽孢菌與乳酸菌接種比例對(duì)發(fā)酵液體飼料的影響

2.2 發(fā)酵液體飼料兩株芽孢菌比例的優(yōu)化

發(fā)酵液體飼料中芽孢菌與乳酸菌接種比例為2∶1，飼料與水比例(W/V)為1∶4，接種量為8%，兩株乳酸菌接種比例為1∶1，兩株芽孢菌比例如表3。

表3 兩株芽孢菌混合比例對(duì)發(fā)酵液體飼料的影響

由表3可看出，兩株芽孢菌的比例對(duì)乳酸和及益生菌數(shù)影響較小，而對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生還原糖含量影響明顯，當(dāng)兩株芽孢菌比例為1∶1時(shí)，還原糖含量最高，所以確定發(fā)酵液體飼料中兩株芽孢菌WL-BA-1和B10-5的比例為1∶1。

2.3 發(fā)酵液體飼料兩株乳酸菌比例的優(yōu)化

發(fā)酵液體飼料中芽孢菌與乳酸菌接種比例為2∶1，接種量為8%，兩株芽孢菌比例為1∶1，兩株乳酸菌比例如表4。

從表4可以看出，兩株乳酸菌的比例為1∶2時(shí)，還原糖含量最高，益生菌總數(shù)也處于較高水平，從而確定發(fā)酵液體飼料中兩株凝結(jié)芽孢桿菌和糞腸球菌LJ的比例為1∶2。

2.4 發(fā)酵液體飼料總接種量的優(yōu)化

發(fā)酵液體飼料中芽孢菌與乳酸菌接種比例為2∶1，兩株芽孢菌比例為1∶1，兩株乳酸菌比例分別為1∶2，接種量如表5。

由表5可以看出，隨著接種量的增加，接種量對(duì)還原糖含量影響不明顯，對(duì)乳酸含量影響也不顯著，但接種量高，生產(chǎn)上所需的菌液也高，成本也隨之增加，而4%接種量還原糖和乳酸含量以及益生菌數(shù)都處于一個(gè)較高的水平，所以最終確定接種量為4%。

表4 兩株乳酸菌比例對(duì)發(fā)酵液體飼料的影響

表5 總接種量對(duì)發(fā)酵液體飼料的影響

2.5 發(fā)酵液體飼料料水比的優(yōu)化

發(fā)酵液體飼料中芽孢菌與乳酸菌接種比例為2∶1，接種量為4%，兩株芽孢菌比例為1∶1，兩株乳酸菌比例為1∶2，飼料與水比例(W/V)如表6。

表6 料水比對(duì)發(fā)酵液體飼料的影響

液體飼料能提高豬的生長(zhǎng)性能，飼料的含水量有助于飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的吸收利用，同時(shí)影響液體發(fā)酵的質(zhì)量。研究報(bào)道，料水比達(dá)到1∶3或1∶3.5時(shí)能提高生長(zhǎng)效率和飼料利用率。由表6可知，隨著水分的提高，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)乳酸和活菌數(shù)沒(méi)有明顯影響，而對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生還原糖影響較大呈先增大后減少，料水比1∶3.5時(shí)達(dá)到最大值，所以確定料水比為1∶3.5。

2.6 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)

以單因素優(yōu)化的發(fā)酵條件，采用L9(34)型三水平三因素正交試驗(yàn)研究接種量、芽孢菌與乳酸菌的接種比例、料水比對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響，以還原糖含量作為指標(biāo)進(jìn)行分析，如表7和表8所示。

通過(guò)正交試驗(yàn)中各組發(fā)酵產(chǎn)生的還原糖進(jìn)行分析可以看出各因素?zé)o顯著性影響，各因子的主次順序?yàn)椋航臃N量＞料水比＞接種比例，即優(yōu)化后的條件是接種量為4%，芽孢菌與乳酸菌接種比例為1∶1，料水比為1∶3.5。正交試驗(yàn)中第4組既是這個(gè)組合，其還原糖含量可達(dá)到2.12%，乳酸含量3.2%，芽孢菌數(shù)為1.3×106CFU/g，乳酸菌數(shù)為1.7×1010CFU/g，并且有效抑制了大腸桿菌，最終確定發(fā)酵條件。

表7 正交試驗(yàn)極差分析

表8 正交試驗(yàn)方差分析

2.7 發(fā)酵液體飼料溫度的優(yōu)化

以優(yōu)化后的最佳條件接種發(fā)酵，進(jìn)行發(fā)酵溫度的確定，如表9。

表9 溫度對(duì)發(fā)酵液體飼料的影響

從表9可看出，隨著溫度的升高，還原糖含量先增加后減小，37℃達(dá)到最高。其原因可能在于35℃左右芽孢菌代謝活躍，產(chǎn)生了淀粉酶、纖維素酶等，將飼料中的大分子物質(zhì)降解成小分子物質(zhì)，而溫度過(guò)高，加上飼料發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)熱，將會(huì)影響芽孢菌的生長(zhǎng)以及代謝物的產(chǎn)生。在實(shí)際生產(chǎn)中，嚴(yán)格控制發(fā)酵溫度難以實(shí)現(xiàn)，應(yīng)根據(jù)季節(jié)變化改變發(fā)酵時(shí)間，通過(guò)表中數(shù)據(jù)可知，在32～37℃間發(fā)酵都可以實(shí)現(xiàn)一個(gè)較好的效果。

2.8 發(fā)酵飼料對(duì)仔豬生長(zhǎng)的影響

由表10可看出，各組豬初始體重、日采食量、料肉比無(wú)顯著性差異。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組平均日增重提高11.68%（P＜0.05），平均日采食量提高1.96%（P＞0.05），料肉比降低8.55%（P＞0.05），腹瀉率下降54.88%。由于試驗(yàn)仔豬為7日齡～35日齡，每天的采食量較少，加上正在開(kāi)胃階段，所以試驗(yàn)組的平均日采食量的提高不明顯，與許多研究有差距。由表11可以看出，發(fā)酵后飼料中有機(jī)酸以乳酸為主，含有少量的檸檬酸、丙酸和乙酸，使飼料中含有輕微酸甜香味。Van Winsen等（2011）[13]認(rèn)為，發(fā)酵液體飼料的理想特性是：pH值＜4.5；乳酸菌菌數(shù)＞9 logCFU/ml；乳酸濃度＞150 mmol/l；乙酸濃度＜40 mmol/l；乙醇濃度＜0.8 mmol/l，本試驗(yàn)發(fā)酵后飼料品質(zhì)基本與Van Winsen闡述的一致。表12可知，試驗(yàn)組糞便中乳酸菌數(shù)是對(duì)照組的80倍，而對(duì)照組糞便中大腸菌數(shù)是試驗(yàn)組的9倍，腹瀉率是試驗(yàn)組的2.2倍，說(shuō)明飼用發(fā)酵液體飼料增加了腸道乳酸菌，改變了腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)。以上說(shuō)明發(fā)酵液體飼料能提高仔豬生長(zhǎng)性能，改善腸道健康，從而保證仔豬健康。

表10 發(fā)酵飼料對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響

表11 發(fā)酵飼料發(fā)酵3 d后有機(jī)酸的含量

表12 發(fā)酵飼料對(duì)仔豬糞便中微生物的影響

3 討論

3.1 發(fā)酵液體飼料前后營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的變化

發(fā)酵飼料的品質(zhì)直接影響了仔豬的適口性，而影響液體發(fā)酵飼料的因素主要包括菌種、接種量、接種比例、溫度和料水比等。本試驗(yàn)選用乳酸菌和芽孢桿菌作為發(fā)酵菌種，芽孢桿菌在發(fā)酵過(guò)程中消耗了氧氣，產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等，將飼料中大分子物質(zhì)降解成小分子物質(zhì)，不僅有利于乳酸菌的生長(zhǎng)，而且提高了飼料適口性，提高動(dòng)物消化率；乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生乳酸，降低pH值，抑制飼料中雜菌的生長(zhǎng)，在腸道中還可抑制致病菌的繁殖。發(fā)酵前，飼料中含大量雜菌，還原糖、粗蛋白等含量較低，有益菌幾乎沒(méi)有，本試驗(yàn)發(fā)酵后益生乳酸菌＞1010CFU/g，還原糖和乳酸含量分別達(dá)到2.17%和3.4%，含有少量檸檬酸和丙酸，從而飼料具有酸甜香味，大大提高仔豬適口性。李龍等[14]對(duì)復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料工藝進(jìn)行優(yōu)化后，結(jié)果發(fā)酵飼料品質(zhì)為金黃色、芳香味、質(zhì)地良好、pH值為4.27，游離氨基酸/總氮為13.73%，總菌數(shù)為5.50×108CFU/g，乳酸菌數(shù)和乳酸含量分別為16.17×108CFU/g和4.86 g/kg。張翠綿等[15]在最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵高纖維固體飼料，結(jié)果顯示固體飼料中面包酵母菌、嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌的活菌數(shù)分別為5.67×107、1.31×109、8.06×108CFU/g，酸香味濃郁，適口性強(qiáng)。

3.2 發(fā)酵液體飼料對(duì)仔豬生長(zhǎng)的影響

飼料在發(fā)酵過(guò)程中，不僅產(chǎn)生一些有益物質(zhì)，還能減少或消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，將植物蛋白降解成小肽、寡肽和游離氨基酸，很容易被小腸消化吸收。發(fā)酵液體飼料與母乳形態(tài)相似，減少斷奶綜合征對(duì)仔豬的影響。本試驗(yàn)以優(yōu)化的最佳條件發(fā)酵后，將發(fā)酵料替代50%的仔豬全價(jià)粉料進(jìn)行飼喂試驗(yàn)，試驗(yàn)組比對(duì)照組的平均日增重和日采食量都有所提高，腹瀉率下降，說(shuō)明發(fā)酵飼料改善了仔豬的適口性，提高消化率和轉(zhuǎn)化率，并改善腸道健康。李小燕等（2013）研究結(jié)果表明，飼喂發(fā)酵液體飼料組與顆粒料組和粉料組相比，平均日增重分別提高9.39%和11.39%，料重比降低7.34%和8.53%，有效提高腸胃中乳酸菌含量，降低大腸桿菌含量，并有效提高仔豬生長(zhǎng)性能。

4 結(jié)論

本文通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定仔豬發(fā)酵液體飼料的發(fā)酵工藝為：接種量為4%，芽孢菌與乳酸菌接種比例為1∶1，料水比為1∶3.5，發(fā)酵溫度32～37℃范圍均可。按此條件37℃下發(fā)酵3 d后還原糖含量2.17%，乳酸含量3.4%，檸檬酸含量0.331%，丙酸含量0.130%，同時(shí)乳酸菌數(shù)達(dá)到1010CFU/g以上，大腸桿菌未檢出。添加50%發(fā)酵液態(tài)飼料飼喂仔豬，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組平均日增重提高11.68%（P＜0.05），平均日采食量提高1.96%（P＞0.05），料肉比降低8.55%（P＞0.05），腹瀉率下降54.88%。