■馮 健 李英花 耿春銀 嚴(yán)昌國

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002)

1 試驗材料

1.1 試驗動物

選擇12頭平均體重（545.55±27.00）kg的體健無病延邊黃牛閹牛，隨機分成試驗組和對照組,每組6頭，試驗組每頭牛飼喂生物發(fā)酵飼料2 kg/d，對照組不飼喂生物發(fā)酵飼料,試驗組和對照組的基礎(chǔ)日糧營養(yǎng)水平基本相同。預(yù)飼期10 d，正式期90 d。屠宰后，分別從試驗組與對照組各隨機選取3頭牛，在第14肋骨處采取背最長肌一小塊，迅速放于事先處理好的凍存管中并置于液氮中速凍，-80℃保存待用。

1.2 試驗日糧

生物發(fā)酵飼料是利用玉米粉40%、啤酒糟40%、糖蜜5%、酵母菌4%（微生物實驗室培養(yǎng))和水。混合均勻后在30℃下厭氧發(fā)酵3 d，制成具有酒香味，酒精度為7～9°的新型飼料。其日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 供試牛日糧組成及營養(yǎng)水平

2 試驗方法

2.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中（牛）的FABP4基因序列（序列號：NM_174314.2）、CAPN1基因序列（序列號：NM_174259.2）和β-actin基因序列（序列號：AB098930.1），按照實時熒光定量PCR引物設(shè)計原則，用Oligo6.0軟件設(shè)計特異性引物。內(nèi)參基因是β-actin基因，表2為引物信息（引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成）。

表2 實時熒光定量PCR引物

2.2 背最長肌組織總RNA提取

利用TaKaRa公司的總RNA提取試劑盒提取供試牛背最長肌中的總RNA，整個操作過程在超凈工作臺中進(jìn)行，不能有RNA酶的污染。

2.3 總RNA的檢驗

提取總RNA樣品4 μl，用DEPC處理水稀釋250倍，混合均勻后，測定260、280 nm吸光度（利用紫外分光光度計），確定溶液的OD260/OD280值是否在1.8～2.0區(qū)間之內(nèi)，然后計算總RNA的濃度。

總RNA的濃度(ng/ml)=OD260×稀釋倍數(shù)×50/1 000。

取總RNA樣品5 μl（約6～8 μg的RNA），進(jìn)行凝膠電泳分離，利用凝膠成像儀觀察總RNA條帶數(shù)量、清晰度和有無拖尾現(xiàn)象，其中18S和28S的條帶亮度比約為2∶1。

全市每年都有因城市（鎮(zhèn)）開發(fā)、工業(yè)園區(qū)、房地產(chǎn)、交通、水工程等建設(shè)項目開挖擾動地表、開挖自然山體，不嚴(yán)格執(zhí)行水土保持方案和“三同時制度”，沒有實施生態(tài)修復(fù)和水保設(shè)施建設(shè)，甚至有的建設(shè)單位不按規(guī)定傾倒或者向河道偷倒廢棄建筑渣（土）等。據(jù)監(jiān)測和調(diào)查，全市各類生產(chǎn)建設(shè)項目年造成新的水土流失面積10km2，有的地方破壞面積已接近甚至大于當(dāng)年治理面積，城市生態(tài)環(huán)境嚴(yán)峻形勢不容樂觀。

2.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RT-PCR）

總RNA提取后，利用TaKaRa公司的Prime Scriptò RT-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，向RNase free PCR反應(yīng)管（200 μl）中加入表3中的溶液或試劑，整個過程全部在冰上完成，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書，建立20.0 μl反轉(zhuǎn)錄體系。其條件和方法均按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。

表3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

2.5 PCR的擴增反應(yīng)(見表4)

表4 PCR擴增反應(yīng)體系

PCR的擴增起反應(yīng)體系的混合是在冰上進(jìn)行，反應(yīng)體系為20.0 μl。

PCR反應(yīng)程序為：預(yù)變性93℃ 5 min，變性93℃15 s，退火在54～60 ℃持續(xù)32 s，72 ℃延伸32 s，循環(huán)數(shù)為42個，72℃延伸16 min，4℃保存。

2.6 目的片段的回收

用瓊脂糖凝膠電泳將上述產(chǎn)物分離，利用DNA回收試劑盒將目的片段回收。

2.7 序列分析

通過Blast程序和DNAman軟件分析發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果與Genbank中發(fā)表的相應(yīng)序列相同。

2.8 實時熒光定量PCR

①反應(yīng)溫度的篩選。根據(jù)引物的退火溫度，在實時熒光定量PCR儀上設(shè)置54～60℃，5個溫度梯度，觀察其溶解曲線及擴增曲線，找出適宜3個基因的反應(yīng)溫度。

②標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。將目的基因稀釋，按照10倍梯度方法，然后對FABP4、CAPN1和β-actin三個基因進(jìn)行擴增反應(yīng)，按說明書的步驟進(jìn)行操作，其反應(yīng)體系為25 μl，最后得出每個目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

③熒光定量PCR。采用SYBRò Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa）試劑盒對β-actin、FABP4和CAPN1基因進(jìn)行擴增。反應(yīng)條件參考試劑盒進(jìn)行(見表5)。

表5 熒光定量PCR反應(yīng)體系

2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

根據(jù)熒光定量PCR檢測出的內(nèi)參基因和目的基因，利用2-ΔΔCt方法分析基因的相對表達(dá)差異量，試驗數(shù)據(jù)一律采用統(tǒng)計軟件SAS（V8.0）中的一般線性模型（GLM）模塊來進(jìn)行單因素方差分析。表中結(jié)果表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”，P＜0.05為結(jié)果差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 RNA及目的基因片段檢測結(jié)果（見圖1）

如圖1可見，將提取的試驗組與對照組牛背最長肌的總RNA進(jìn)行電泳，將試驗組3個個體和對照組3個個體的總RNA分別經(jīng)紫外分光光度計分析，所有樣本的D260/D280均在1.8～2.0。電泳結(jié)果表明，RNA分子保持完整RNA質(zhì)量符合實時熒光定量PCR試驗的要求。

圖1 總RNA提取的電泳結(jié)果

常規(guī)PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果如圖2。泳道1為CAPN1基因，泳道2為FABP4基因，泳道3為β-actin基因，從圖中可以看出三個基因的條帶均清晰明亮、無雜帶，而且其片段的大小也都在預(yù)先設(shè)計的范圍內(nèi)，說明引物的特異性很高，測序結(jié)果與目的序列一致，確定為目的基因片段。

圖2 目的基因的PCR檢測結(jié)果

3.2 實時熒光定量結(jié)果與分析

3.2.1 內(nèi)參基因與目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線及溶解曲線

β-actin、FABP4和CAPN1基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線均在100～10-3模板濃度范圍內(nèi)建立。β-actin、FABP4 和CAPN1基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3～圖5，從圖中我們可以看出，目的基因的Ct值與起始模板濃度的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.998、1.000和0.999，線性關(guān)系很好，作為本試驗的一個重要參數(shù)，對于采用Ct值基因進(jìn)行準(zhǔn)確的定量很有利。β-actin、FABP4和CAPN1基因的溶解曲線如圖6～圖8，從圖中可以看出，目的基因的溶解曲線上未見雜峰，內(nèi)參基因（β-actin基因）有雜峰信號出現(xiàn)，可能是引物二聚體或者是非特異性擴增產(chǎn)物，但它們的量與擴增子相比顯得非常少，所以對定量結(jié)果影響不大。CAPN1、β-actin和FABP4基因的擴增曲線如圖9～圖11所示，橫坐標(biāo)為待測樣品循環(huán)數(shù)Ct，縱坐標(biāo)為熒光強度。Ct是熒光強度在被檢測時所得到的對應(yīng)的循環(huán)數(shù)。擴增曲線圖反映了循環(huán)過程中熒光值的變化，即每個循環(huán)Ct值與起始模板濃度的對數(shù)成反比。

圖3 β-actin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 FABP4基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 CAPN1基因標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖6 CAPN1基因溶解曲線

圖7 FABP4基因溶解曲線

圖8 β-actin基因溶解曲線

圖9 CAPN1基因擴增曲線

圖10 β-actin基因擴增曲線

圖11 FABP4基因擴增曲線

3.2.2 FABP4、CAPN1基因mRNA在延邊黃牛背最長肌組織中表達(dá)的差異

飼喂生物發(fā)酵飼料對延邊黃牛牛背最長肌中FABP4、CAPN1基因表達(dá)的相對定量結(jié)果見表6。

表6 飼喂生物發(fā)酵飼料對黃牛背最長肌FABP4、CAPN1 mRNA相對表達(dá)量的影響

由表6可以看出，延邊黃牛日糧中飼喂發(fā)酵飼料對牛背最長肌中FABP4具有極顯著影響（P＜0.01）,當(dāng)延邊黃牛日糧中飼喂發(fā)酵飼料后，F(xiàn)ABP4基因mRNA的表達(dá)量顯著高于對照組,試驗組中FABP4 mRNA的表達(dá)量是對照組的2.27倍。CAPN1 mRNA的表達(dá)量受日糧影響差異顯著（P＜0.05），當(dāng)延邊黃牛飼飼喂發(fā)酵飼料后，黃牛背最長肌中CAPN1 mRNA的表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05）。

4 討論

4.1 飼喂生物發(fā)酵飼料對延邊黃牛背最長肌FABP4基因表達(dá)的影響

肌間脂肪（IMF）作為影響牛肉品質(zhì)的一個主要因素，其含量與牛肉的嫩度和風(fēng)味有著十分密切關(guān)系。Michal等[2]研究表明，F(xiàn)ABP4基因在脂肪沉積中發(fā)揮重要的作用，與牛大理石花紋、皮下脂肪厚度呈顯著相關(guān)。Cho等[5]的研究結(jié)果表明該FABP4基因與背膘厚相關(guān)。Shogo等[6]研究顯示，F(xiàn)ABP4基因與日本黑牛牛肉中脂肪酸的組成成分呈顯著相關(guān)。Barendse等[7]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4基因位于第3外顯子和第3內(nèi)含子之間存在一個剪接位點突變，該SNP與澳大利亞牛肌間脂肪沉積顯著相關(guān)。

本試驗采用熒光定量RT-PCR方法檢測飼喂發(fā)酵飼料的延邊黃牛和正常飼喂的延邊黃牛FABP4基因mRNA表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，F(xiàn)ABP4基因在試驗組和對照組牛背最長肌組織中均有表達(dá)，且試驗組和對照組FABP4基因表達(dá)量相比，試驗組顯著高于對照組，說明飼喂發(fā)酵飼料可以增加肌間脂肪的沉積，改善牛肉的風(fēng)味。

4.2 飼喂生物發(fā)酵飼料對延邊黃牛背最長肌CAPN1基因表達(dá)的影響

嫩度作為衡量牛肉品質(zhì)重要的指標(biāo)。在不同品種和不同部位中差異很大，在不同部位中以背最長肌最具代表性。鈣蛋白酶是影響肌肉嫩度的重要基因，它控制著肌纖維蛋白的降解，與宰后的嫩度變化有著非常密切關(guān)系[8]。作為最早發(fā)現(xiàn)的鈣蛋白酶之一，鈣蛋白酶Ⅰ即CAPN1基因，是由21個內(nèi)含子和22個外顯子組成[9]。Koohmaraie等[3]研究報道，半胱氨酸蛋白酶在肉質(zhì)嫩化過程中起著非常重要的作用,而半胱氨酸蛋白酶就是由CAPN1基因編碼所產(chǎn)生的，因此，CAPN1基因可作為研究肉質(zhì)嫩度的主要候選基因。Koohmaraie等[3]的研究也發(fā)現(xiàn)CAPN1基因在肉質(zhì)嫩化的過程中起著非常重要作用。Page等(2004)[4]研究中發(fā)現(xiàn)CAPN1基因是一個影響肉質(zhì)嫩度的非常重要的遺傳標(biāo)記。Pinto等[10]研究表明，CAPN1基因?qū)ε５娜赓|(zhì)嫩度具有顯著影響。

本試驗采用熒光定量RT-PCR方法檢測飼喂生物發(fā)酵飼料的延邊黃牛和正常飼喂的延邊黃牛CAPN1基因mRNA表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，CAPN1基因在試驗組和對照組牛背最長肌組織中均有表達(dá)，且試驗組和對照組CAPN1基因表達(dá)量相比，試驗組顯著高于對照組，說明飼喂生物發(fā)酵飼料可提高延邊黃牛牛肉嫩度。

5 結(jié)論

飼喂生物發(fā)酵飼料可顯著提高FABP4、CAPN1基因在延邊黃牛背最長肌中的表達(dá)量。