■王 偉 李 佳 姜軍坡 王世英

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071000）

家禽養(yǎng)殖過(guò)程中的所產(chǎn)生的排泄物在微生物厭氧發(fā)酵作用下會(huì)產(chǎn)生大量氨氣等有害氣體。舍內(nèi)的氨氣達(dá)到一定濃度后，可誘使家禽罹患呼吸道疾病[1]，使雞群抗病能力急劇下降，尤其在冬春季節(jié)，出于防寒保溫的需要，通風(fēng)受限，雞舍內(nèi)氨氣濃度急劇升高，更加影響了雞群的生產(chǎn)性能和健康水平[2]。吳迪梅等[3]發(fā)現(xiàn)，肉雞7～21日齡氨氣濃度超過(guò)10 mg/m3，28～42日齡氨氣濃度超過(guò)15 mg/m3，均會(huì)對(duì)肉雞的生產(chǎn)性能產(chǎn)生影響，氨氣濃度達(dá)到60 mg/m3可造成萬(wàn)只規(guī)模肉雞場(chǎng)年經(jīng)濟(jì)損失近10萬(wàn)元。同時(shí)，雞場(chǎng)所產(chǎn)生的大量氨氣最終排放到大氣中，成為可吸入肺顆粒物（PM2.5）形成的重要原因，在與一些酸性物質(zhì)反應(yīng)后形成銨鹽氣溶膠，導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)富營(yíng)養(yǎng)化和酸化[4]，加劇了環(huán)境污染的程度。如何降低雞糞中氨氣的揮發(fā)，國(guó)內(nèi)外已有很多研究報(bào)道[5]。利用微生物吸收或抑制糞便中氨氣的釋放的方法因其安全、環(huán)保、高效成為近些年來(lái)研究的熱點(diǎn)。Kim等[6]分離到一株乳酸桿菌KJ-2008菌株，其能將氨氣濃度降低98.5%。甘曉等[7]從雞場(chǎng)排污口糞污和水族箱水中篩選到的一株假單胞菌屬YF1菌株和中華根瘤菌屬YS2菌株，將兩種菌株以1∶1混合噴灑于雞糞堆上可使雞糞中氨氣釋放量降低75.6%。氨氣揮發(fā)前在糞便中的主要存在形式是NH4+-N，利用微生物對(duì)NH4+-N的轉(zhuǎn)化作用，降低糞便中NH4+-N的濃度，進(jìn)而降低氨氣的散發(fā)量。劉志云等[8]從雞糞中分離得到一株具有良好氨氮降解性能的酵母菌LSA，經(jīng)鑒定為Candida krusei。該菌在1 105.26 mg/l氨氮濃度的培養(yǎng)液具有高強(qiáng)度的氨氮耐受性，轉(zhuǎn)化率為27.28%。芽孢桿菌益生菌抗逆性強(qiáng)，且可以產(chǎn)豐富的消化酶類、調(diào)節(jié)腸道菌群，應(yīng)用廣泛。其降解氨氮性能多用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[9-10]，在家禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用較少。本研究主要是篩選氨氮降解能力強(qiáng)、抗逆性芽孢菌屬細(xì)菌菌株，使其以飼料添加劑或直接噴灑的方式應(yīng)用于家禽生產(chǎn)中，并研究其對(duì)雞糞氨氣的抑制作用，為以后的理論研究及實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 供試樣品

健康的雞腸道內(nèi)容物及糞便。

1.2 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基的配制方法具體參見(jiàn)《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[11]。加入0.3%膽酸鹽的NA培養(yǎng)基。

初篩培養(yǎng)基：葡萄糖 5.0 g、NaCl 1.0 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、(NH4)2SO42.0 g、NaH2PO40.25 g，蒸餾水1 000 ml，瓊脂15～20 g，115℃高壓滅菌20 min，pH值7.2～7.4。

復(fù)篩培養(yǎng)基：葡萄糖 5.0 g、NaCl 1.0 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、NaH2PO40.25 g、蒸餾水1 000 ml，氨態(tài)氮的最終濃度為200 mg/l，以此計(jì)算加入的(NH4)2SO4量。115 ℃高壓滅菌20 min，pH值7.2～7.4。

1.3 試驗(yàn)試劑

生理生化試驗(yàn)所用試劑參見(jiàn)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]。

2 試驗(yàn)方法

2.1 氨氮降解菌的分離和篩選

2.1.1 耐受0.3%膽酸鹽菌株的分離

分別取雞腸道內(nèi)容物和糞便樣品各1.0 g置于9.0 ml無(wú)菌水的試管中，經(jīng)80℃加熱處理15 min?；靹蚝笕?.0 ml置于9.0 ml無(wú)菌水的試管中進(jìn)行梯度稀釋，分別取 10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度的稀釋液各0.1 ml涂布到含有0.3%的膽酸的NA培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)24 h。挑取生長(zhǎng)良好、不同形態(tài)的單菌落經(jīng)純化后，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 初篩

將2.1.1獲得的菌株采用“十字劃線法”接入到氨氮初篩培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取生長(zhǎng)良好菌株進(jìn)行復(fù)篩。

2.1.3 復(fù)篩

將初篩得到的各菌株分別接入到NB培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h。以10%的接種量接種到氨氮初始濃度為200 mg/l的液體復(fù)篩培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。每隔24 h取樣后10 000 r/min離心5 min，采用納氏比色法分別測(cè)定上清液中氨氮的含量，并與未接種菌株的空白培養(yǎng)基作對(duì)比，計(jì)算氨氮降解率。

式中：c——氨氮含量（mg/l）。

2.2 氨氮降解菌株減少氨釋放量的研究

稱取100 g新鮮雞糞加入到250 ml三角瓶中，將篩選所獲得的各菌株以10%的接種量接入雞糞中，以加入無(wú)菌水作為對(duì)照。另量取20 ml 2%硼酸吸收溶液置于50 ml三角瓶中，并滴入指示劑（以甲基紅∶亞甲基紅=2∶1為指示劑）用于吸收氨氣。將兩個(gè)三角瓶通過(guò)膠管連接，保證整個(gè)系統(tǒng)密封性良好。將該裝置置于25℃恒溫培養(yǎng)箱，96 h后通過(guò)鹽酸滴定法[13]，評(píng)價(jià)菌液對(duì)雞糞便的產(chǎn)氨量的影響，每組做2個(gè)平行。

2.3 拮抗菌株的種屬鑒定

所獲優(yōu)良菌株進(jìn)行菌落形態(tài)、菌體特征及生理生化鑒定。參見(jiàn)東秀珠等《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]。

3 結(jié)果

3.1 耐受0.3%膽酸鹽菌株的分離和氨氮降解菌的初篩

本試驗(yàn)分離得到15株耐受0.3%膽酸鹽菌株。通過(guò)初篩得到9株能夠在僅含有硫酸銨為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的菌株，分別為N-1、N-2、N-3、N-4、C-1、C-2、C-3、J1和T-1。

3.2 復(fù)篩

對(duì)初篩所獲得的菌株分別在不同時(shí)間進(jìn)行氨氮降解率的測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接入C-2、C-3、T-1和N-3菌液的培養(yǎng)基中氨氮含量隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)呈整體下降趨勢(shì)。結(jié)果如圖1所示。

由試驗(yàn)結(jié)果可知，24 h時(shí)，接入C-2菌液的培養(yǎng)基中氨氮含量下降最為明顯，下降28.5%。72 h時(shí)，C-2、C-3、T-1和N-3菌株的氨氮降解率分別為45.3%、33.8%、29.2%和20.8%，其中，C-2菌株的氨氮降解率最高。因此，C-2、C-3、T-1和N-3能夠較好利用氨氮進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，從而有可能減少雞糞便中氨氮濃度，進(jìn)而減少氨氮以氣態(tài)揮發(fā)至空氣中的趨勢(shì)，有望凈化雞舍內(nèi)環(huán)境。

圖1 不同時(shí)間氨氮含量

3.3 氨氮降解菌減少氨釋放量的特性研究

在雞新鮮糞便中接入菌液4 d后，C-2、C-3、T-1、N-3菌株均能有效抑制雞糞中氨氣的產(chǎn)生，尤其加入C-2菌液的雞糞便釋放的氨氣量下降最為明顯，C-2菌液的加入使得雞糞氨氣的釋放量平均減少0.11 g/kg雞糞便，與對(duì)照組相比，抑制氨氣排放率達(dá)到86.7%。因此，將C-2菌株作為備選菌株進(jìn)行菌株的種屬鑒定。

3.4 鑒定

3.4.1 形態(tài)觀察

C-2菌株經(jīng)24 h平板培養(yǎng)后，觀察其在NA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為圓形，邊緣整齊，表面不光滑有褶皺，不產(chǎn)生色素。革蘭氏陽(yáng)性，菌體桿狀，芽孢呈橢圓形中生。3.4.2 16S rDNA測(cè)序結(jié)果(見(jiàn)表1及圖2)

表1 C-2菌株與參比菌株16S rDNA序列相似性比較

圖2 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

由以上結(jié)果可知，與菌株C-2的16S rDNA序列同源相似性最高的9株標(biāo)準(zhǔn)菌株均屬于芽孢桿菌屬，其中有8株與菌株C-2的16S rDNA序列相應(yīng)的同源相似度高于99%，Bacillus flavithermus與菌株C-2序列的同源相似度較低，但也有90.83%，因此可初步判斷菌株C-2屬于芽孢桿菌屬。

3.4.3 生理生化鑒定

根據(jù)其特定的生化反應(yīng)要求用相應(yīng)的試劑鑒別，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 生理生化試驗(yàn)

將細(xì)菌C-2菌株的菌落形態(tài)、菌體特征、16S rD?NA序列分析結(jié)果和生理生化試驗(yàn)特征，與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》相關(guān)內(nèi)容對(duì)照，最終將其鑒定為枯草芽孢桿菌。

4 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)共分離篩選到的4株抑氨率較高的菌株，分別為C-2、C-3、T-1、N-3。其中，C-2的氨氮降解率最高，72 h達(dá)到45.3%。將該4種菌株分別接入雞糞便后檢測(cè)其減少氨釋放量的程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，均能夠有效降低氨氣的排放率，綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，將C-2菌株作為備選菌株進(jìn)行生理生化、16S rDNA的鑒定。經(jīng)鑒定，C-2菌株為枯草芽孢桿菌?，F(xiàn)代家禽的集約化大規(guī)模養(yǎng)殖致使雞舍內(nèi)氨氣濃度偏高，嚴(yán)重影響了動(dòng)物的健康，同時(shí)會(huì)對(duì)養(yǎng)殖人員的健康和大氣環(huán)境產(chǎn)生不利影響。篩選高效抑氨菌來(lái)減少氨氣等有害氣體的產(chǎn)生成為當(dāng)前的熱點(diǎn)。李軍平[14]從雞糞中分離得到一株能夠有效降低雞糞氨氣釋放量的枯草芽孢桿菌D3菌株。試驗(yàn)表明，麻雞日糧中添加量為0.90×109cfu/kg體重時(shí)，氨氣的排放量最低。陳國(guó)營(yíng)等[15]在好氧條件下篩選到的B3菌株在菌液添加量為7.5 ml，雞糞含水量為88.52%，6 d的抑氨效果可達(dá)66.67%。劉乃芝等[16]通過(guò)限制性培養(yǎng)基的初篩和抑氨富集培養(yǎng)基的復(fù)篩，并采用三角瓶封閉檢測(cè)法進(jìn)行實(shí)際除臭效果試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，24 h時(shí)芽孢菌Y-64的除臭效果最好，達(dá)33.33%。本研究所研發(fā)的具有益生作用的枯草芽孢桿菌C-2菌株，抗逆性強(qiáng)，耐膽酸鹽，能夠高效降解雞糞便中的氨氮，減少氨氮轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氨的趨勢(shì)，從而降低雞舍內(nèi)氨氣含量，有效凈化雞舍內(nèi)空氣。未來(lái)可以采用直接噴灑液體菌液、固體菌粉的方式或加入到飼料中作為飼料添加劑使用。這不僅對(duì)于雞舍內(nèi)環(huán)境的改善有著積極作用，同時(shí)有可能通過(guò)菌株將氨氮轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，增加雞糞便的可利用率，效果好、安全系數(shù)高，且綠色環(huán)保。本研究將進(jìn)一步對(duì)該菌劑的應(yīng)用方式及其減排機(jī)理做進(jìn)一步研究，為將來(lái)的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。