■王光玉 馮亞利 張 欣 徐劍濤 陳 雷

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物工程系，山東威海264209)

微生態(tài)制劑（Probiotics）是一種可促進(jìn)動物健康 生長的微生物餌料添加劑，能夠改善養(yǎng)殖生物腸道內(nèi)的微生態(tài)環(huán)境，提高消化道酶活性和餌料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)生長[1-3]。目前微生態(tài)制劑已廣泛應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè)、食品等行業(yè)，特別是在動物養(yǎng)殖領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用效果。在飼糧中添加微生態(tài)制劑能提高養(yǎng)殖生物的品質(zhì)，提高反芻動物的抗病力、產(chǎn)奶量和乳脂率[4]，提高了養(yǎng)殖動物的經(jīng)濟(jì)效益。微生態(tài)制劑還具有調(diào)控養(yǎng)殖水體水質(zhì)的功效，已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)。作為一種綠色餌料添加劑，微生態(tài)制劑能改善對蝦外部水環(huán)境，促進(jìn)對蝦生長[5]，對海參養(yǎng)殖水體有凈化作用[6]，能夠提高石斑魚生長狀況，加強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能，也體現(xiàn)了微生態(tài)制劑具有免疫增強(qiáng)劑的效果[7-8]。本文在刺參餌料中添加EM菌，通過檢測刺參生長率和腸道、腸壁消化酶酶活變化，研究EM這種微生態(tài)制劑對刺參養(yǎng)殖中的影響，旨在為微生態(tài)制劑在刺參的養(yǎng)殖提供理論依據(jù)，豐富刺參養(yǎng)殖的研究內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇人工培育的刺參(Apostichopus japonicas Selenka)作為養(yǎng)殖對象，初始質(zhì)量為(4.0±1.0)g，初始體長為(5.0±1.0)cm。經(jīng)過7 d的適應(yīng)性養(yǎng)殖，選取體質(zhì)健壯、規(guī)格相近的250頭刺參，隨機(jī)分成5組，每組50頭，總質(zhì)量(200.0±5.0)g。養(yǎng)殖試驗在實驗室內(nèi)5個長1 m、寬0.8 m，深0.3 m、水容量為240 L的透明玻璃鋼槽內(nèi)進(jìn)行，編號1～5號，養(yǎng)殖環(huán)境條件為溫度為16～18℃，pH值7.5～8.2。刺參配合餌料購自威海某生物科技有限公司，EM菌購自威海某生物科技有限公司，是用全海水培養(yǎng)成功的一種適應(yīng)海洋環(huán)境的EM菌劑。

1.2 養(yǎng)殖管理

每個養(yǎng)殖試驗持續(xù)20 d，每5 d為一個周期，每個周期全換水一次，試驗期間每天投餌一次，投餌量為刺參重量的3%，與2倍餌料重量的海泥混勻后飼喂刺參，每個周期投餌量和海泥的重量隨著海參體重的增加而增加。試驗期間每天測定水體中的氨氮、亞硝態(tài)氮濃度，每個養(yǎng)殖周期結(jié)束時測量刺參的重量，腸道、腸壁酶活，并計算刺參每個周期的生長速率。

1.3 微生態(tài)制劑與配合餌料的混合比例對刺參養(yǎng)殖的影響

將一定量的微生態(tài)制劑（EM菌）與配合餌料、海泥混合后立即投喂海參，1號養(yǎng)殖缸不加微生態(tài)制劑只投喂配合餌料作為對照組，2～5號養(yǎng)殖缸為試驗組，微生態(tài)制劑與配合餌料的混合比例依次為2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，然后按照1.2中所述方式養(yǎng)殖并測定各項指標(biāo)。

1.4 微生態(tài)制劑與配合餌料的混合時間對刺參養(yǎng)殖的影響

將一定量的微生態(tài)制劑（EM菌）與配合餌料、海泥充分混合后，室溫放置一定的時間，1號養(yǎng)殖缸為對照組，2～5號養(yǎng)殖缸為試驗組，1～5號養(yǎng)殖缸EM菌劑與餌料以2∶1的比例混合，放置時間依次為0、6、8、10、12 h，即：1號缸為0 h、2號缸為6 h、3號缸為8 h、4號缸為10 h、5號缸為12 h，然后按照1.2中所述方式進(jìn)行養(yǎng)殖并測定各項指標(biāo)。

1.5 檢測項目和方法

每個養(yǎng)殖周期結(jié)束后立即用DT-3002電子天平稱重海參，計算生長率。每個養(yǎng)殖周期結(jié)束后立即宰殺刺參，取出腸道，測定腸道內(nèi)容物和腸壁的消化酶活性，分別測定刺參腸壁、腸道內(nèi)的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和褐藻酸酶四種酶活性[9-10]。每個養(yǎng)殖周期每天取水樣，按照《海洋監(jiān)測規(guī)范》第四章的標(biāo)準(zhǔn)分析方法檢測養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝態(tài)氮含量。所有檢測的項目4個周期取“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，分別計算刺參生長速率，腸壁、腸道消化酶活性及水體中氨氮、亞硝態(tài)氮的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生態(tài)制劑與配合餌料的混合比例對刺參養(yǎng)殖的影響

EM菌劑與餌料不同配比飼喂刺參后綜合生長速率見圖1。從圖1中可以看出，2號養(yǎng)殖缸刺參生長速率最高，每5 d平均生長速率為4.23%，高于對照組1號缸的2.92%。

圖1 不同混合比例的生長速率

刺參四種消化酶的活性見圖2、圖3、圖4和圖5。從圖中可以看出，刺參腸道內(nèi)容物的蛋白酶、纖維素酶和褐藻酸酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于腸壁酶活，腸壁的淀粉酶活性遠(yuǎn)高于腸道內(nèi)容物。腸道內(nèi)容物的蛋白酶、纖維素酶和褐藻酸酶以及腸壁淀粉酶在刺參消化食物的過程中起主要作用。從圖2可以看出，添加EM菌劑可以影響腸道內(nèi)容物的蛋白酶酶活，但對刺參腸壁的蛋白酶酶活幾乎無影響。微生態(tài)制劑與餌料為2∶1配合比例時，提高腸道內(nèi)容物的蛋白酶酶活的作用最大，腸道內(nèi)容物蛋白酶活達(dá)到45.11 U/g。從圖3、圖4和圖5可以看出，添加EM菌劑對刺參的腸道內(nèi)容物和腸壁上的淀粉酶、纖維素酶和褐藻酸酶都有影響。微生態(tài)制劑與餌料2∶1的配合比例時，消化酶在腸道內(nèi)容物和腸壁酶活最高，分別為淀粉酶活性1.19 U/g和4.05 U/g，纖維素酶活性2.13 U/g和1.23 U/g，褐藻酸酶活性3.34 U/g和1.55 U/g。

圖2 不同混合比例的腸道蛋白酶活性

圖3 不同混合比例的腸道淀粉酶活性

圖5 不同混合比例的腸道褐藻酸酶活性

養(yǎng)殖水體中亞硝態(tài)氮、氨氮含量變化如圖6～圖7。5個養(yǎng)殖缸中養(yǎng)殖水體亞硝態(tài)氮含量在前3 d均呈遞增的趨勢，2號缸中亞硝態(tài)氮含量3 d內(nèi)增加到0.045 mg/l，之后逐天減少，1、3、4、5號養(yǎng)殖缸內(nèi)亞硝態(tài)氮含量在1～4 d內(nèi)增加，之后逐天減少；5個養(yǎng)殖缸內(nèi)銨態(tài)氮含量逐漸增加。4個養(yǎng)殖周期結(jié)束時，2號養(yǎng)殖缸其亞硝態(tài)氮和氨氮含量最低，分別為0.032 mg/l和0.478 mg/l。

圖6 不同混合比例下養(yǎng)殖水體亞硝態(tài)氮含量

2.2 微生態(tài)制劑與配合餌料的混合時間對刺參養(yǎng)殖的影響

EM菌劑與餌料混合不同時間飼喂刺參后綜合生長速率見圖8?？梢钥闯觯?號養(yǎng)殖缸刺參生長速率最高，為5.41%，高于對照組1號缸的4.01%，另外3組也高于對照組。

刺參四種消化酶的活性見圖9～圖12。從圖中可以看出，微生態(tài)制劑與餌料的混合時間可以影響腸道內(nèi)容物的蛋白酶酶活，其中混合8 h后飼喂，腸道內(nèi)容物蛋白酶的活性達(dá)到46.09 U/g，腸道內(nèi)容物的蛋白酶活性的提高最大，混合時間對刺參腸壁蛋白酶酶活幾乎無影響。圖10～圖12可以看出，混合時間對刺參的腸道內(nèi)容物的淀粉酶以及腸壁的纖維素酶和褐藻酸酶都有影響，混合時間為8 h腸道內(nèi)容物和腸壁酶活性都是最高，分別為淀粉酶活性1.34 U/g和4.23 U/g，纖維素酶活性2.23 U/g和1.23 U/g，褐藻酸酶活性3.33 U/g和1.66 U/g。3～5號缸的四種消化酶活性依次下降，說明當(dāng)混合時間超過8 h后隨著混合時間的增加酶活性逐漸減低。

圖7 不同混合比例下養(yǎng)殖水體氨氮含量

圖8 不同混合時間的生長速率

EM菌劑與餌料混合不同時間投喂刺參，養(yǎng)殖水體水質(zhì)變化如圖13～圖14。5個養(yǎng)殖缸的亞硝酸含量逐漸增加；氨氮含量在第3 d有所下降，之后又逐天增加；4個養(yǎng)殖周期結(jié)束時，3號養(yǎng)殖缸其亞硝態(tài)氮含量和氨氮含量最低，分別為0.070、0.670 mg/l。

圖9 不同混合時間的腸道蛋白酶活性

圖10 不同混合時間的腸道淀粉酶活性

圖11 不同混合時間的腸道纖維素酶活性

3 討論

3.1 微生態(tài)制劑對生長率的影響

刺參的生長與營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收有關(guān)，與餌料混合后，微生態(tài)制劑的益生菌會隨著餌料在水中的擴(kuò)散而分布在水體，有助于刺參吸收進(jìn)入腸道，餌料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子被益生菌部分分解和轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生易被刺參采食、消化、吸收且無毒害作用的小分子物質(zhì)，而且微生態(tài)制劑中的益生菌菌體、各種分解酶、各級代謝產(chǎn)物，如免疫增強(qiáng)因子和促生長因子等都能起到促生長和維持動物腸道菌群平衡的作用，增強(qiáng)了餌料的適口性和誘食性[11-12]。本研究所用的的微生態(tài)制劑是以乳酸菌、酵母菌為主，含有光合細(xì)菌和芽孢菌的多種菌株一次培養(yǎng)成功的菌劑，是一種海水培養(yǎng)的適應(yīng)海洋環(huán)境的EM菌劑，添加了EM菌劑的餌料酸度降低，并有酸甜味，適口性增強(qiáng)，更有利于刺參的進(jìn)食。目前微生態(tài)制劑促進(jìn)生長已在很多動物的養(yǎng)殖過程中加以驗證，劉晶晶等[13]將微生態(tài)制劑混合飼料后投喂黃牛，具有提高飼料消化率以及改善飼料適口性的功效，其乳酸菌與飼料混合后散發(fā)酸香味與本試驗微生態(tài)制劑混合飼料后的效果類似，也說明微生態(tài)制劑在反芻動物和刺參的養(yǎng)殖應(yīng)用方面具有共性。

圖12 不同混合時間的腸道褐藻酸酶活性

圖13 不同混合時間水體亞硝態(tài)氮含量

圖14 不同混合時間水體氨氮含量

3.2 微生態(tài)制劑對消化酶的影響

微生態(tài)制劑可作為一種微生態(tài)餌料添加劑，自身的菌群與刺參腸道內(nèi)的菌群混合，構(gòu)成了共生、共棲、競爭和寄生等多種種群關(guān)系，調(diào)整海參腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡，提高消化酶活性。本研究發(fā)現(xiàn)，EM菌劑能夠促進(jìn)腸道內(nèi)容物中蛋白酶、纖維素酶和褐藻酸酶以及腸壁淀粉酶的活性，進(jìn)而提高刺參消化能力，促進(jìn)生長。微生態(tài)制劑同時也促進(jìn)刺參腸道內(nèi)容物的淀粉酶以及腸壁中纖維素酶和褐藻酸酶的活性，但對腸壁的蛋白酶酶活并無明顯的促進(jìn)作用。通過腸壁及腸道內(nèi)容物雙檢測的方法，驗證了刺參消化酶系中淀粉酶為內(nèi)源性酶，纖維素酶及褐藻酸酶為外源性酶的觀點，支持了蛋白酶為半外源性酶的觀點[9,11]。證實蛋白酶酶活受腸道質(zhì)量及餌料總蛋白含量及蛋白水解難度調(diào)控，淀粉酶酶活受腸道質(zhì)量及餌料淀粉含量調(diào)控，纖維素酶和褐藻酸酶酶活受腸道質(zhì)量影響較小，主要受刺參腸道內(nèi)微生物和兩種物質(zhì)含量的調(diào)控。

海參消化道不具物理消化能力和消化腺，對于營養(yǎng)物質(zhì)只能進(jìn)行化學(xué)消化，較其他海洋生物簡單。腸道是海參營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，其消化道具有消化酶分泌、提供消化場所和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的功能[14]。微生態(tài)制劑添加到餌料中，增加了海參腸道內(nèi)益生菌的數(shù)目，從而提高了海參腸道內(nèi)各種消化酶的活性，增強(qiáng)了海參腸道吸收營養(yǎng)物的效率，本研究中EM菌劑混合餌料后隨著食物鏈進(jìn)入刺參體內(nèi)激活刺參腸道內(nèi)各消化酶活性，在幫助刺參消化起到非常重要的作用，對刺參的養(yǎng)殖產(chǎn)生良好的影響。宮魁等[15]從刺參腸道菌群變化的角度解釋了微生態(tài)制劑提高酶活，抑制弧菌和大腸桿菌數(shù)，調(diào)節(jié)腸道內(nèi)代謝產(chǎn)物的作用。微生態(tài)制劑除了影響常見的4種消化酶，還會影響其他消化酶活性，提高免疫能力。Yang等[16]使用酵母菌提高海參腸道內(nèi)胰蛋白酶和脂肪酶的活性，也能提高刺參的生長率。Wang[17]等利用海洋紅酵母D30投喂刺參證實了微生態(tài)制劑不僅能提高海參生長率。并且可以提高腸道內(nèi)溶菌酶、酵素以及各種磷酸酶活性。本研究中微生態(tài)制劑與餌料混合8 h酶活性達(dá)到最佳，機(jī)理還不清楚，也很少有文獻(xiàn)報道，尚需進(jìn)一步的試驗加以研究。

3.3 微生態(tài)制劑對水質(zhì)的影響

刺參匍匐生活在水體的底部，對養(yǎng)殖水體生態(tài)環(huán)境變化比較敏感，微生態(tài)制劑能夠改善水質(zhì)，保障刺參在相對穩(wěn)定的水環(huán)境中健康生長[18]。研究表明，微生態(tài)制劑可通過氧化、氨化、硝化、反硝化、硫化、解磷和固氮等作用，將動物排泄物和殘餌等分解為二氧化碳(CO2)、硝酸鹽(NO3-)、磷酸鹽(PO34-)和硫酸鹽(S2-)等，有效降解水體中過多的有機(jī)物，起到優(yōu)化環(huán)境、改良水質(zhì)的作用[19-20]。試驗過程中，投喂微生態(tài)制劑的試驗組，亞硝態(tài)氮和氨氮含量均低于空白組，有效改善了養(yǎng)殖水體環(huán)境。姜松等[21]在養(yǎng)殖池內(nèi)潑灑微生態(tài)制劑后糙海參的增長率明顯提高，水質(zhì)明顯得到改善，與本研究得到相似的結(jié)果。而姜燕等[22]在益生菌發(fā)酵餌料投喂刺參的試驗中，得出益生菌處理后的餌料對氨氮無顯著影響。推測得到不同結(jié)果的原因，可能與使用的微生態(tài)制劑、對餌料的處理方法不同相關(guān)。

4 結(jié)論

①刺參養(yǎng)殖過程中，添加微生態(tài)制劑可以提高海參的生長速率，改善養(yǎng)殖水質(zhì)。

②EM菌與餌料以2∶1比例混合，浸泡8 h，刺參的生長速率和養(yǎng)殖水質(zhì)達(dá)到最佳，同時提高了腸道酶活性。