■劉建峰

（湖北輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢730070）

豆粕是大豆經(jīng)提取豆油后得到的副產(chǎn)品，蛋白含 量高達(dá)40%～50%，且營養(yǎng)豐富，是畜禽類動物理想的蛋白飼料來源。但豆粕中含有眾多種類的抗?fàn)I養(yǎng)因子[1]，如大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、棉籽糖、水蘇糖、脲酶等，極大地限制了豆粕營養(yǎng)價(jià)值的利用。豆粕中這些抗?fàn)I養(yǎng)因子的去除，主要的方法就是通過微生物進(jìn)行發(fā)酵，將其水解或轉(zhuǎn)化，以減小抗?fàn)I養(yǎng)的作用。在發(fā)酵豆粕時(shí)，所用的微生物種類必須符合農(nóng)業(yè)部規(guī)定的《飼料添加劑品種目錄》中的微生物或在食品中允許使用的微生物，包括酵母菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、黑曲霉、米曲霉等。發(fā)酵豆粕質(zhì)量的評價(jià)方法NY/T 2218—2012中雖然給出了其質(zhì)量技術(shù)指標(biāo)，但并沒有充分體現(xiàn)發(fā)酵豆粕的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)——蛋白質(zhì)的水解程度。因?yàn)槎蛊芍械鞍最惖目範(fàn)I養(yǎng)因子的去除，主要是通過微生物產(chǎn)生的蛋白酶的水解作用，將其轉(zhuǎn)化為小分子的蛋白質(zhì)或多肽，從而消除或降低抗?fàn)I養(yǎng)因子的作用。而蛋白質(zhì)的水解度[2]（Degree of Hydrolysis，DH）可以較好的反映這個(gè)轉(zhuǎn)化過程或結(jié)果。

在豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子去除效果的研究中，有一些研究采用了蛋白質(zhì)水解度的指標(biāo)，如徐倩等[3]、劉喚明等[4]，雖然其研究結(jié)果顯示可將豆粕蛋白的水解度提高到20%以上，但其采用方法是微生物發(fā)酵和外加酶的協(xié)同模式，成本較高。本研究擬以水解度為考察指標(biāo)，采用枯草芽孢桿菌和黑曲霉分段發(fā)酵的方式，充分利用不同微生物的發(fā)酵特性[5-6]，消除或減小豆粕中蛋白質(zhì)類的抗?fàn)I養(yǎng)因子，并為工業(yè)化應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料

豆粕由東海糧油工業(yè)（張家港）有限公司提供，普通型豆粕粗蛋白含量≥44%；麥麩皮為市購；糖蜜由南寧糖業(yè)股份有限公司提供；其它試劑均為化學(xué)分析純。

1.1.2 主要儀器

生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、高壓蒸汽不銹鋼滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、SVS-1300型凈化工作臺（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

1.1.3 菌種

枯草芽孢桿菌F-11-06、黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.4 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20 g、蔗糖2 g、自來水100 ml，pH值自然（約 6.0），滅菌 121℃、20 min。

麥麩培養(yǎng)基：麥麩80%、豆粕18%、葡萄糖2%，滅菌121℃、20 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕85%、麥麩10%、糖蜜2%、稻草顆粒2%、自來水110%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12混合接種劑的制備

分別取對數(shù)期的在麩皮培養(yǎng)基上生長的黑曲霉F-11-08和PDA培養(yǎng)基上生長的酵母菌F-11-12，以2∶1（質(zhì)量/體積）的比例混合，其中黑曲霉F-11-08的孢子濃度為108個(gè)/g，酵母菌F-11-12的細(xì)胞濃度為106個(gè)/ml。

1.2.2 菌株產(chǎn)蛋白酶酶活的測定（初步確定發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)）

取對數(shù)期生長的菌種，接種到裝有適量固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的罐頭瓶（直徑 10 cm、高 10 cm）中，厚度約2 cm，枯草芽孢桿菌分別在 30、33、36℃和39℃培養(yǎng) 72 h或真菌（黑曲霉和酵母）分別在22、25、28℃和31 ℃培養(yǎng) 72 h，然后在24、36、48、60 h和72 h取樣，并測定蛋白酶酶活。

1.2.3 單菌株發(fā)酵豆粕的蛋白質(zhì)水解度

根據(jù)1.2.1的結(jié)果，可獲得相應(yīng)的蛋白酶酶活最佳的溫度點(diǎn)，然后分別對發(fā)酵24、36、48、60 h和72 h的樣品，進(jìn)行蛋白質(zhì)水解度的測定。

1.2.4 多菌株分段發(fā)酵豆粕的蛋白質(zhì)的水解度

根據(jù)1.2.2的結(jié)果，采用適宜的發(fā)酵溫度，同時(shí)以發(fā)酵豆粕的蛋白質(zhì)的水解度較高的發(fā)酵時(shí)間為參考，用響應(yīng)面的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法（采用Design Expert 10），進(jìn)行多菌株分段豆粕發(fā)酵進(jìn)行優(yōu)化，期望獲得高蛋白質(zhì)水解度的發(fā)酵豆粕。

1.3 檢測方法

孢子數(shù)量的測定采用 GB 4789.15—2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)的方法；蛋白酶酶活的測定采用GB/T 23527—2009蛋白酶制劑的方法；水解度的測定采用甲醛滴定法[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株產(chǎn)蛋白酶酶活的測定

不同的發(fā)酵溫度對微生物蛋白酶酶活性有不同影響，圖1顯示了枯草芽孢桿菌F-11-06在30、33、36℃和39℃發(fā)酵下的蛋白酶酶活，其中，在發(fā)酵溫度為33℃、發(fā)酵時(shí)間為60 h時(shí)，蛋白酶的酶活較高，達(dá)到305.6 U/g。60 h時(shí)，在發(fā)酵溫度低于或高于33℃時(shí)，所產(chǎn)的蛋白酶酶活都出現(xiàn)了不同程度的降低，說明33℃是枯草芽孢桿菌F-11-06在本試驗(yàn)條件下的較適宜的產(chǎn)蛋白酶的溫度。另外，圖1也顯示在發(fā)酵前期，隨著初始發(fā)酵溫度的提高，蛋白酶酶活也在增高，但在發(fā)酵后期逐漸下降，并低于適宜的發(fā)酵溫度。圖2也展示了類似的結(jié)論，即在發(fā)酵溫度為25℃、發(fā)酵時(shí)間為60 h時(shí)，蛋白酶酶活較高，達(dá)到4 404.2 U/g。說明溫度是微生物蛋白酶發(fā)酵的一個(gè)重要的參數(shù)，在不同的發(fā)酵溫度下，產(chǎn)生的蛋白酶的酶活不同。同時(shí)值得關(guān)注的是，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，蛋白酶的活性也增加，但增加到一定階段，蛋白酶的活性出現(xiàn)了下降的趨勢，下降的原因可能是隨著微生物的大量繁殖，出現(xiàn)的營養(yǎng)的不均衡或代謝物的抑制等[7-8]。

圖1 枯草芽孢桿菌F-11-06在不同發(fā)酵溫度下的蛋白酶酶活

圖2 黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12混合發(fā)酵在不同發(fā)酵溫度下的蛋白酶酶活

2.2 單菌株發(fā)酵豆粕的蛋白質(zhì)水解度

在2.1結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別檢測了枯草芽孢桿菌F-11-06在發(fā)酵溫度為33℃或黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12在發(fā)酵溫度為25℃的發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)的水解度，結(jié)果見圖3。圖3顯示，黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12的發(fā)酵豆粕的蛋白質(zhì)水解度可達(dá)6.8%，明顯高于枯草芽孢桿菌F-11-06的發(fā)酵豆粕的蛋白質(zhì)水解度（3.3%）。同時(shí)圖3中蛋白質(zhì)水解度最高的時(shí)間點(diǎn)也是蛋白酶酶活最高的時(shí)間點(diǎn)（見圖1和圖2），即60 h。說明，發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)水解度的高低與蛋白酶的酶活有一定的關(guān)系。但隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)的水解度出現(xiàn)了下降的趨勢，可能是在微生物發(fā)酵的過程中，會產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物間可能會產(chǎn)生相互的作用，如美拉德反應(yīng)，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物兩端的活性基團(tuán)可能參與了這些反應(yīng)，從而造成了蛋白質(zhì)水解度測定結(jié)果的下降。

圖3 枯草芽孢桿菌F-11-06或黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12在適宜豆粕發(fā)酵溫度下的蛋白質(zhì)水解度

2.3 多菌株分段發(fā)酵豆粕的蛋白質(zhì)的水解度

根據(jù)2.2的試驗(yàn)結(jié)果，采用Design Expert 10軟件，進(jìn)行了兩段豆粕發(fā)酵工藝的優(yōu)化試驗(yàn)研究，即先用枯草芽孢桿菌F-11-06發(fā)酵一定的時(shí)間，然后再接種黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12并發(fā)酵一定的時(shí)間。發(fā)酵溫度為枯草芽孢桿菌F-11-06發(fā)酵階段為33℃，黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12發(fā)酵階段為25℃。試驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)見表1，具體的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 試驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)

表2 具體的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.1 試驗(yàn)結(jié)果方差分析

對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次項(xiàng)模型的方差分析，結(jié)果見表3。二次項(xiàng)模型P值＜0.000 1，說明模型是顯著的；一次項(xiàng)（A和B）的P值＜0.000 1，說明A因素和B因素對結(jié)果的影響極顯著；二次項(xiàng)（AB、A2和B2）的P值＜0.000 1，說明A因素和B因素的交互影響顯著。在二次方模型的失擬項(xiàng)中P值為0.638，即大于0.05，說明模型的失擬項(xiàng)不顯著，即不需要對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行更高次方模型的模擬，即二次方模型是合適的。圖4顯示了模型的預(yù)測值與實(shí)際觀測值的關(guān)系，從圖4可以看出，實(shí)際觀測值與預(yù)測值非常接近，這也間接說明二次模型是合適的。

表3 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

圖4 模型預(yù)測值與實(shí)際觀測值的關(guān)系

2.3.2 二次方模型方程的建立

由表3試驗(yàn)結(jié)果方差分析可知，本試驗(yàn)結(jié)果分析采用的二次方模型是合適的，可以建立如下的二次方方程：

為了驗(yàn)證所建立模型的擬合程度，進(jìn)行了模型的可信度分析（見表4）。從表4模型的可信度分析中可以看出，Adj R2為0.996 5，說明以試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)建立的模型，計(jì)算出的數(shù)據(jù)可以覆蓋99.65%的區(qū)域，即模型的擬合程度很好，且在試驗(yàn)參數(shù)的取值范圍內(nèi)，模型的Pred R2為0.993 2，說明實(shí)際觀測值與模型的預(yù)測值的相關(guān)性很好，即建立的二次方程是合適的。

表4 模型的可信度分析

為了更形象地認(rèn)識A和B因素（不同時(shí)間分段）對二次方程響應(yīng)值（水解度）的影響，可以建立響應(yīng)面圖（見圖5）。從圖5中可以看出，響應(yīng)值有最大值，且最大值在試驗(yàn)值設(shè)計(jì)覆蓋的范圍之內(nèi)。

圖5 模型的響應(yīng)面圖

2.3.3 預(yù)測和驗(yàn)證

為了得到響應(yīng)值（DH，%）的最大值，根據(jù)所建立的模型進(jìn)行了響應(yīng)值最大值的預(yù)測，根據(jù)工藝的可操作性和操作的難易程度，我們選取了3組（見表5），并進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。

表5 二次模型方程最大值的預(yù)測值

考慮到試驗(yàn)的實(shí)際情況和操作的可能性，對上述的3組數(shù)據(jù)進(jìn)行了修正（見表6）。在驗(yàn)證試驗(yàn)中，每一個(gè)處理做3個(gè)平行，試驗(yàn)結(jié)果見表6。在表6中可以看出，雖然序號3有最大的響應(yīng)值（22.5%），但其所需的發(fā)酵周期較長，共需要118 h（A：68；B：50），而序號2的響應(yīng)值雖然為22.3%，但發(fā)酵周期只需97 h（A：69；B：28）。因此我們選擇序號2作為我們的最終的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果。

表6 響應(yīng)值最大值預(yù)測的驗(yàn)證

3 結(jié)論

在豆粕微生物發(fā)酵過程中，不同的微生物對豆粕蛋白質(zhì)有不同的水解能力。在本試驗(yàn)研究中，枯草芽孢桿菌F-11-06對豆粕蛋白質(zhì)的水解能力較弱，在33℃、60 h的發(fā)酵條件下，其DH只有3.3%，而黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12，在25℃、60 h的發(fā)酵條件下，DH達(dá)到6.8%。為了最大程度的消除豆粕中蛋白質(zhì)類的抗?fàn)I養(yǎng)因子，進(jìn)一步提高豆粕蛋白質(zhì)的水解度，我們進(jìn)行了多菌種分段發(fā)酵試驗(yàn)研究，結(jié)果顯示豆粕前期用枯草芽孢桿菌F-11-06發(fā)酵69 h（33℃），后期用而黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12發(fā)酵28 h（25℃），可將豆粕蛋白質(zhì)的水解度提高到22.3%，這是單純枯草芽孢桿菌F-11-06（60 h、33℃）發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)水解度的6.8倍，是單純黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12（60 h、25 ℃）的3.3倍。多菌種分段發(fā)酵可以大幅度提高水解度的原因可能是微生物之間的相互協(xié)作的結(jié)果[9-10]。