章玉萍 陳 明 張麗麗 代君君 吳傳華 劉 健 范 濤

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所,安徽合肥 230061)

家蠶彩色蠶中紅色素和絲心蛋白相互作用的研究

章玉萍 陳 明 張麗麗 代君君 吳傳華 劉 健 范 濤*

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所,安徽合肥 230061)

為探討繭色的形成機(jī)理，對紅色蠶及其繭、絲腺進(jìn)行解剖觀察，然后測定絲心蛋白的氨基酸組成和含量，最后應(yīng)用光譜法測定紅色素和家蠶絲心蛋白之間的相互作用。結(jié)果顯示：紅色素在絲腺中全部著色，前部、中部、后部絲腺及吐絲管都完全著色，白蠶和紅蠶絲心蛋白組分及含量的變化基本相同，絲心蛋白上的酪氨酸殘基參與了猝滅過程，結(jié)合作用為氫鍵結(jié)合。

彩色蠶 絲心蛋白 氨基酸 相互作用

家蠶繭色豐富多彩，是其他絹絲昆蟲所不及。盡管目前的飼養(yǎng)品種幾乎全為白繭，但家蠶有許多較原始的有色繭品種，這都是自然突變而形成的。目前，國內(nèi)研究機(jī)構(gòu)保存的家蠶繭色突變型主要有黃紅繭系和綠繭系兩大類[1-2]，繭絲的顏色種類及深淺不僅受到色素生成及運(yùn)輸?shù)幕虻目刂?，更與這些色素的成分和含量有關(guān)[3-5]。利用色素添食技術(shù)生產(chǎn)家蠶彩色繭是在家蠶常規(guī)飼養(yǎng)的基礎(chǔ)上，在桑葉中添加色素，使蠶食后改變其絹絲腺的著色性能，根據(jù)添食色素的不同呈現(xiàn)各種色彩，該技術(shù)居國內(nèi)首創(chuàng)、達(dá)到國際先進(jìn)水平[6-8]。利用色素添食技術(shù)生產(chǎn)的彩色繭可解決天然彩色繭顏色種類少的問題，但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該技術(shù)生產(chǎn)的彩色繭存在著“著色度不均、蠶體損失”等問題，正是由于色素在蠶體中是如何轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，色素和絲膠、絲心蛋白的相互作用等繭色形成的機(jī)理不明確限制了其生產(chǎn)。

近年來關(guān)于彩色繭的形成機(jī)理國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)研究，并報(bào)道了有關(guān)色素結(jié)合蛋白在蠶體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要作用[9]。Feltwell、Kayser 等[10]報(bào)道了載脂蛋白在轉(zhuǎn)運(yùn)β-胡蘿卜素、葉黃素從血淋巴到中部絲腺過程中丟失β-胡蘿卜素的情況，推測可能是膳食中的類胡蘿卜素在被鱗翅目昆蟲吸收、儲(chǔ)運(yùn)過程中經(jīng)過修飾所致。Tabunoki 等[11]在家蠶黃繭品種的絲腺組織中分離純化出的一種類胡蘿卜素結(jié)合蛋白(CBP) ，并對其進(jìn)行了cDNA 的序列分析。目前關(guān)于利用色素添食法生產(chǎn)彩色繭的機(jī)理研究很少報(bào)道。本文通過研究家蠶中色素與絲心蛋白之間的相互作用，探索研究彩色繭的形成機(jī)理，希望能為今后家蠶彩色繭的大規(guī)模研制提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑

日立氨基酸分析儀L-8900，離子交換柱：4.6 mm ×60 mm填料為3μm磺酸型陽離子樹脂分離柱，交換樹脂型號(hào)：No.2622(日本公司生產(chǎn)的氨基酸分析專用樹脂)。真空干燥箱，F(xiàn)A1204N型電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)，氨基酸分析儀配套的流動(dòng)相(緩沖液和茚三酮溶液)。?；撬釋φ掌?，sigma公司提供，純度 99%；其他氨基酸由氨基酸分析儀的儀器商提供。RF-540 熒光分光光度計(jì)(日本島津)；UV-265 紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)；pHS-3C 型精密酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)；CS501 型超級(jí)恒溫水浴(南通科學(xué)儀器廠)。MilliQ超純水儀。一步法動(dòng)物組織活性蛋白提取試劑盒、改良型Bradford蛋白濃度測定試劑盒、酸性紅、Tris-HCl(上海生工生物股份有限公司)。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 彩色蠶飼養(yǎng)

菁松×皓月幼蟲期采用三回育(7：30/14：30/20：30)溫濕度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼育，五齡第二天開始利用色素添食法生產(chǎn)彩色蠶繭[12]。

1.2.2 家蠶絲腺著色觀察

在添食色素后的第一天，每24 h解剖1次蠶體觀察絲腺的變化，之后每天記錄1次蠶體體色和絹絲腺的變化，收集彩色繭，并調(diào)查彩繭著色情況。

1.2.3 絲心蛋白的提取及濃度測定

取五齡6～7 d的桑蠶幼蟲，將成熟幼蟲的絲腺取出，切下后部絲腺，用預(yù)冷的pH 7.0 的PBS洗數(shù)次，再放入冷的蒸餾水中，收集透明的絲心蛋白，放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?用“一步法動(dòng)物組織活性蛋白提取試劑盒”提取絲心蛋白，提取步驟依照說明書操作。利用“改良型BCA法蛋白濃度測定試劑盒”測定絲心蛋白濃度，根據(jù)下表制定蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

1.2.4 絲心蛋白氨基酸測定

稱取 45.1 mg 試樣，以 6 mol/L HCl 20 mL 溶解，氮?dú)獗Ｗo(hù) 110℃酸水解 22 h，冷卻后轉(zhuǎn)移至 25 mL容量瓶，定容。取 1 mL 55℃氮?dú)獯蹈?，加?1 mL蒸餾水再烘干，反復(fù)3次。用去離子水(0.02 mol/L HCl)2 mL充分溶解，混勻。用 0.45 μm 濾膜過濾，進(jìn)樣 20 μL上機(jī)測試。

1.2.5 色素與絲心蛋白相互作用研究

在10 m L比色管中依次加入1.0 m L pH 7.40 Tris-HCl緩沖溶液，1.0 m L 1.0×10-5mol/L 絲心蛋白溶液，分別加入濃度為1.0×10-4mol/L 紅色素0 mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻、恒溫(298 K)放置約20 min，在狹縫寬度為10 nm，熒光激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長344 nm分別繪制相應(yīng)的熒光光譜和測定熒光強(qiáng)度。同時(shí)以不含色素的絲心蛋白溶液熒光強(qiáng)度為對照，探討紅色素對絲心蛋白的熒光猝滅作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶蠶繭絲腺著色觀察

結(jié)果如圖1所示：紅種色素成功在絲腺著色并結(jié)成紅色繭，在添食色素的過程中，蠶體都被桑葉上的色素染成紅色蠶，但蠶兒一切行為都正常。所有的有色繭都色澤均勻、顏色鮮艷。色素在絲腺中全部著色，前部、中部、后部絲腺及吐絲管都完全著色。證明色素分子已進(jìn)入絲素。

2.2 家蠶絲心蛋白氨基酸組成和成分含量

氨基酸分析儀測定結(jié)果表明：白色蠶和紅色蠶心蛋白的氨基酸組成幾乎相同，有天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、笨丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸和色氨酸等17種氨基酸。主要的組成氨基酸都是甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和酪氨酸等4種氨基酸。白蠶絲心蛋白中甘氨酸∶丙氨酸∶絲氨酸∶酪氨酸為：35.83∶24.87∶8.96∶4.1，此4種氨基酸占總氨基酸含量的73.8%；紅蠶絲心蛋白中甘氨酸∶丙氨酸∶絲氨酸∶酪氨酸為：32.95∶23.56∶8.16∶4.19，此4種氨基酸占總氨基酸含量的69.31%。

表2 2個(gè)蠶品種絲心蛋白氨基酸組成分析結(jié)果

2.3 家蠶絲心蛋白濃度測定

制定蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為0.99843，達(dá)到了實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定提取的家蠶絲心蛋白濃度約為50 mg/mL。

2.4 色素與絲心蛋白相互作用

色素—絲心蛋白溶液的熒光猝滅光譜見圖3。

從圖3可以看出，絲心蛋白的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨著色素濃度的增加而降低，證明色素分子對絲心蛋白具有良好的熒光猝滅作用。通過猝滅常數(shù)計(jì)算，表明色素分子對絲心蛋白的猝滅反應(yīng)是靜態(tài)猝滅過程，結(jié)合作用為氫鍵結(jié)合。猝滅曲線顯示絲心蛋白上的酪氨酸殘基參與了猝滅過程，因此推斷是富含酪氨酸殘基的絲心蛋白重鏈晶性結(jié)構(gòu)域參與了與色素分子的結(jié)合過程。

3 小結(jié)與討論

本研究首先通過解剖家蠶觀察發(fā)現(xiàn)色素在絲腺中全部著色，前部、中部、后部絲腺及吐絲管都完全著色，證明色素分子已進(jìn)入絲素，證明色素已和絲心蛋白結(jié)合在一起；然后通過日立氨基酸分析儀測定了白蠶和紅色蠶絲心蛋白的氨基酸組成及含量，結(jié)果二者氨基酸組成幾乎相同，主要的組成氨基酸都是甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和酪氨酸等4種氨基酸，且白蠶絲心蛋白四種主要氨基酸的比例和以前的研究結(jié)果相似。

研究表明，蠶絲的形成可以分為三步：合成分泌蠶絲蛋白，蠶絲蛋白在絲腺腔中的濃縮，蠶絲噴吐及牽拉[13-14]。絲心蛋白在蠶絲形成中經(jīng)歷三種狀態(tài)：凝膠到溶膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變，溶膠到液晶狀態(tài)轉(zhuǎn)變，液晶態(tài)到纖維絲態(tài)轉(zhuǎn)變[15]。絲心蛋白主要有三種蛋白組成：絲心蛋白重鏈(Fib-H chain)[16]、絲心蛋白輕鏈伍(Fib-L chain)及糖p25[17]。研究Fib-L chain和P25都具有糖基化位點(diǎn)，通過非共價(jià)鍵相互作用，F(xiàn)ib-H chain和Fib-L chain組成復(fù)合體與P25結(jié)合一起[18]。已有的文獻(xiàn)證明，F(xiàn)ib-H上有絲心蛋白和小分子結(jié)合的位點(diǎn)。重鏈氨基酸分為兩類：由重復(fù)氨基酸序列(Gly-X，X是Ala占65%，Ser占23%，Tyr占9%)組成的晶性結(jié)構(gòu)域和非定形區(qū)。晶性結(jié)構(gòu)域含有60-70個(gè)氨基酸組成的亞結(jié)構(gòu)域，二級(jí)結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)一個(gè)空腔結(jié)構(gòu)。根據(jù)熒光猝滅結(jié)果我們推測這可能是絲心蛋白和色素分子的結(jié)合位點(diǎn)。隨著生物高新技術(shù)的快速發(fā)展，彩繭不僅可應(yīng)用于服裝紡織業(yè)，還可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域。本次試驗(yàn)為今后彩色繭的成色機(jī)理研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

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Interaction between Red Pigment and Fibroin in Natural Colored-cocoon Strains of Bombvx mori

ZHANG Yuping，CHEN Ming，ZHANG Lili，DAI Junjun，WU Chuanhua，LIU Jian，F(xiàn)AN Tao*

(Sericultural Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences,230061,Hefei ,Anhui, China)

To explore the formation mechanism of cocoon color, the red silkworms were taken to do anatomical observation on their cocoons and silk glands, and then determine the content and amino acid composition in fibroin, finally investigate the interaction between red pigment and fibroin. The results show red pigment was fully colored in silk gland, including the front, middle and hind parts as well as the spinneret. The white silkworm and red one have basically the same composition and content of fibroin, and the tyrosine in fibroin plays a great role in quenching process, while the interaction was hydrogen bonding.

colored-cocoon; fibroin; amino acid; interaction

* 資助項(xiàng)目：安徽省農(nóng)科院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(15C0606)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-22-SYZ09)；安徽省蠶桑產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(ahnycytx-16)

章玉萍(1981-)，女，博士，副研究員，從事經(jīng)濟(jì)昆蟲資源綜合利用方面研究。

范濤(1962-)，男，碩士，研究員。E-mail: fantao116@sohu.com