袁立芹，胡元晶

定量檢測(cè)SLIT2基因甲基化對(duì)高級(jí)別宮頸癌前病變的診斷價(jià)值

袁立芹1，胡元晶2△

目的 探討神經(jīng)導(dǎo)向因子2（SLIT2）基因甲基化定量檢測(cè)對(duì)于高級(jí)別宮頸癌前病變的臨床診斷價(jià)值。方法收集178例高危型人乳頭瘤病毒（HPV）感染患者的宮頸脫落細(xì)胞，以組織病理學(xué)診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)，分為正常宮頸組（n=45）、低級(jí)別病變組（n=50）和高級(jí)別病變組（n=83）。采用焦磷酸測(cè)序法定量檢測(cè)各樣本中SLIT2基因的甲基化水平。采用受試者工作特征（ROC）曲線確定SLIT2基因的甲基化水平對(duì)高級(jí)別宮頸癌前病變的診斷閾值。結(jié)果正常宮頸組SLIT2基因的甲基化水平為（4.53±1.37）%，低級(jí)別病變組為（5.81±2.26）%，高級(jí)別病變組為（11.80± 8.47）%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=27.61，P＜0.001）；高級(jí)別病變組高于正常宮頸組和低級(jí)別病變組（均P＜0.001），正常宮頸組和低級(jí)別病變組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.297）。SLIT2基因甲基化定量檢測(cè)診斷高級(jí)別宮頸癌前病變的靈敏度為80.7%，特異度為83.2%，最佳界值為6.41%。結(jié)論采用焦磷酸測(cè)序法定量檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞中SLIT2基因甲基化水平能夠有效診斷高級(jí)別宮頸癌前病變。

宮頸腫瘤；癌前狀態(tài)；DNA甲基化；α乳頭狀瘤病毒屬；宮頸癌前病變；神經(jīng)導(dǎo)向因子2

宮頸癌是導(dǎo)致婦女死亡的第4位惡性腫瘤［1］，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。有研究表明超過(guò)85%的宮頸癌發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家［2］。持續(xù)性高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）感染是導(dǎo)致宮頸癌前病變和浸潤(rùn)性宮頸癌的主要原因［3］。近二十年來(lái)，細(xì)胞學(xué)檢查和HPV檢測(cè)的篩查方法有效降低了宮頸癌的病死率［4］。但并不是所有感染HR-HPV的婦女都會(huì)發(fā)展為宮頸癌，還有其他因素參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

腫瘤抑制基因的高甲基化會(huì)影響基因的正常表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖失控，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［5］。已有研究表明，神經(jīng)導(dǎo)向因子2（SLIT2）基因在宮頸癌前病變和宮頸癌中發(fā)生啟動(dòng)子高甲基化［6］。本研究旨在探討在高危型HPV陽(yáng)性的人群中定量檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞中SLIT2基因甲基化對(duì)于宮頸高級(jí)別癌前病變的臨床診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2015年9月—2016年3月在天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院陰道鏡門診就診的178例HR-HPV感染者的宮頸脫落細(xì)胞，入組同時(shí)進(jìn)行宮頸組織活檢，并以組織病理學(xué)診斷作為“金標(biāo)準(zhǔn)”。根據(jù)病理診斷結(jié)果，將178例患者分為正常宮頸組45例、低級(jí)別病變組50例、高級(jí)別病變組83例。除外妊娠、其他部位的腫瘤、宮頸病變史、放化療、激素治療的患者。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)，所有的研究對(duì)象均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器微量樣品基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；基因組DNA亞硫酸氫鹽處理試劑盒（Zymo Research）；Dream Taq TM Green Master Mix（Fermentas），紫外可見分光光度計(jì)NanoDrop 2000（Thermo）；梯度96孔熱循環(huán)儀（美國(guó)，ABI）；焦磷酸測(cè)序儀及相關(guān)試劑盒（德國(guó)，QIAGEN）；所有引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 DNA提取及化學(xué)修飾參照北京天根生化科技有限公司的微量樣品基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行DNA的提取。參照美國(guó)Zymo Research公司EZ DNA Methylation-Gold kitTM試劑盒的說(shuō)明書步驟，對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，修飾后的DNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 基因擴(kuò)增PCR所需上游引物為5′-GGGAGGAGGGATTGTTTAGATAT-3′，下游引物為5′-CACCACTCTAAACTCTACTCACT-3′。對(duì)下游引物的5′端進(jìn)行生物素標(biāo)記。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。完成后反應(yīng)產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4 焦磷酸測(cè)序首先需要制備單鏈DNA模板，然后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)。SLIT2基因所需測(cè)序引物為5′-GAGGATAGGTTTAGGTT-3′。通過(guò)Pyro Q-CpG 1.0.9軟件可獲得SLIT2基因啟動(dòng)子區(qū)6個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平的數(shù)據(jù)。以每個(gè)基因所有檢測(cè)位點(diǎn)的甲基化率的平均值來(lái)表示每份標(biāo)本的該基因甲基化水平，見圖1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同一指標(biāo)的多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用受試者工作特征（ROC）曲線確定SLIT2基因的甲基化對(duì)于高級(jí)別宮頸癌前病變的診斷閾值。

Fig.1 Detection of SLIT2 gene methylation using pyrosequencing in a sample of HG-CIN圖1 采用焦磷酸測(cè)序定量檢測(cè)1例高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變中SLIT2基因的甲基化

2 結(jié)果

2.1 各組患者臨床資料的比較正常宮頸組的平均年齡為（38.40±9.06）歲，低級(jí)別病變組為（38.90± 7.93）歲，高級(jí)別病變組為（41.14±9.79）歲，3組間年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.675，P=0.190）。3組的HR-HPV的DNA定量平均值(ng/L)分別為220.01（29.71,698.31）、309.92（4.83,833.64）、385.92（45.19, 1 026.69），3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=3.933，P= 0.140）。

2.2 各組患者宮頸病變脫落細(xì)胞中SLIT2基因甲基化水平的定量檢測(cè)正常宮頸組、低級(jí)別病變組、高級(jí)別病變組的SLIT2基因甲基化水平分別為（4.53±1.37）%，（5.81±2.26）%、（11.80±8.47）%，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=27.61，P＜0.001），多重比較示高級(jí)別病變組高于正常宮頸組和低級(jí)別病變組（均P＜0.001），正常宮頸組和低級(jí)別病變組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.297）。

2.3 定量檢測(cè)SLIT2基因甲基化水平診斷高級(jí)別宮頸癌前病變的診斷試驗(yàn)結(jié)果分析ROC曲線示SLIT2基因甲基化水平診斷高級(jí)別宮頸癌前病變的最佳界值為6.41%，此時(shí)靈敏度為80.7%，特異度為83.2%，ROC曲線下面積為0.895，見圖2。

Fig.2 The ROC curve for the diagnosis of HG-CIN by the quantification of SLIT2 gene methylation圖2 SLIT2基因甲基化定量檢測(cè)在診斷高級(jí)別宮頸癌前病變中的ROC曲線

3 討論

SLIT2基因定位于4p15.2，編碼人類與果蠅slit2同源的細(xì)胞外基質(zhì)分泌性糖蛋白，是SLIT基因家族（SLIT1～3）的一員，其主要功能是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中調(diào)節(jié)軸突導(dǎo)向、分支和神經(jīng)細(xì)胞的遷移［7］。已有研究證明，SLIT2基因具有腫瘤抑制活性，且在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了SLIT2基因甲基化［8-13］，SLIT2基因甲基化與其表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Narayan等［6］研究了浸潤(rùn)性宮頸癌及癌前病變中SLIT1、SLIT2、SLIT3、受體Robo1和受體Robo3的表達(dá)水平及啟動(dòng)子甲基化的情況，結(jié)果表明在浸潤(rùn)性宮頸癌中Slit/ Robo的表達(dá)下調(diào)、啟動(dòng)子區(qū)域存在高度甲基化，并且啟動(dòng)子高甲基化是腫瘤發(fā)生的一個(gè)早期事件。因此，SLIT2有望作為宮頸癌早期診斷的分子標(biāo)志物。

宮頸癌的發(fā)病過(guò)程中有多個(gè)基因參與調(diào)控，是一個(gè)從宮頸不典型增生-原位癌-浸潤(rùn)癌逐漸進(jìn)展的過(guò)程。及時(shí)篩查發(fā)現(xiàn)高級(jí)別宮頸癌前病變是宮頸癌早期診斷和治療的基本策略。

焦磷酸測(cè)序技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的DNA序列分析技術(shù)，其是基于4種酶催化的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，焦磷酸基團(tuán)最終轉(zhuǎn)化為可見光的信號(hào)的峰值。檢測(cè)甲基化位點(diǎn)的峰高比，即可反映DNA的甲基化水平。該技術(shù)具有高靈活性和易于操作的特性，可以進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序，實(shí)現(xiàn)高通量和自動(dòng)化，無(wú)需進(jìn)行熒光標(biāo)記或者染色的核苷酸和引物，也不需要進(jìn)行電泳，結(jié)果準(zhǔn)確可靠并且具有較好的可重復(fù)性［14］。本研究采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)178例HR-HPV感染者的宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行定量檢測(cè)SLIT2基因甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)高級(jí)別病變組中SLIT2基因甲基化水平明顯高于低級(jí)別病變組和正常宮頸組，并且通過(guò)繪制ROC曲線確定了定量檢測(cè)SLIT2基因甲基化水平對(duì)于高級(jí)別宮頸癌前病變的最佳診斷閾值為6.41%，此時(shí)診斷的靈敏度和特異度分別為80.7%、83.2%。這提示定量檢測(cè)技術(shù)在診斷高級(jí)別宮頸癌前病變方面具有較好的靈敏度和特異度，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

雖然國(guó)內(nèi)外很多研究都表明持續(xù)性HR-HPV感染是發(fā)生宮頸癌前病變和宮頸癌的主要原因［4］，但是目前HPV-DNA病毒載量與宮頸病變的嚴(yán)重程度是否存在一定的相關(guān)性仍存在爭(zhēng)議。第二代雜交捕獲技術(shù)（HC-2）作為一種HPV-DNA載量半定量測(cè)定方法，具有客觀性、可重復(fù)性、高敏感性和簡(jiǎn)單操作等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床。一些研究表明，宮頸病變的嚴(yán)重程度與HR-HPV病毒負(fù)荷量相關(guān)，隨著病毒負(fù)荷量的增加，宮頸病變的程度越嚴(yán)重，認(rèn)為高病毒負(fù)荷量增加了HPV病毒整合事件的發(fā)生［15-16］。同時(shí)也有研究認(rèn)為兩者之間并無(wú)明顯相關(guān)性［17］。本研究發(fā)現(xiàn)3組不同宮頸病變級(jí)別患者之間HPV-DNA病毒載量值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且標(biāo)準(zhǔn)差的范圍較大。這提示在宮頸癌前病變和宮頸癌的篩查過(guò)程中，HPV-DNA病毒載量水平并不能作為診斷宮頸病變嚴(yán)重程度的指標(biāo)。

綜上，在HR-HPV感染患者的宮頸脫落細(xì)胞中，采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)定量檢測(cè)SLIT2基因的甲基化水平對(duì)于高級(jí)別宮頸癌前病變的臨床診斷靈敏度和特異度較高，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

［1］Ferlay J，Soerjomataram I，Dikshit R，et al.Cancer incidence and mortalityworldwide:sources，methodsandmajorpatternsin GLOBOCAN 2012［J］.Int J Cancer，2015，136（5）:E359-E386. doi:10.1002/ijc.29210.

［2］Bray F，Ren JS，Masuyer E，et al.Global estimates of cancer prevalence for 27 sites in the adult population in 2008［J］.Int J Cancer，2013，132（5）:1133-1145.doi:10.1002/ijc.27711.

［3］Grellier N，Quéro L.Cervical cancer:particularities in HIV patients［J］.BCancer，2014，101（11）:1040-1047.doi:10.16184/ bdc.2014.2034.

［4］Kan YY，Liou YL，Wang HJ，et al.PAX1 methylation as a potential biomarker for cervical cancer screening［J］.Int J Gynecol Cancer, 2014，24（5）：928-934.doi:10.1097/IGC.0000000000000155.

［5］Suzuki H，Maruyama R，Yamamoto E，et al.Epigenetic alteration and MicroRNA dysregulation in cancer［J］.Front Genet，2013，4: 258.doi:10.3389/fgene.2013.00258.

［6］Narayan G，Goparaju C，Arias-Pulido H，et al.Promoter hypermethylation-mediated inactivation of multiple Slit-Robo pathway genes in cervical cancer progression［J］.Molecular Cancer，2006，5:16.doi:10.1186/476-4598-5-16.

［7］Gotz M，Stricker SH.Go with the flow:signaling from the ventricle directs neuroblast migration［J］.Nat Neurosci，2006，9（4）:470-472.doi:10.1038/nn0406-470.

［8］Jin J，You HY，Yu B，et al.Epigenetic inactivation of SLIT2 in humanhepatocellularcarcinomas［J］.BiochemBiophyRes Commun，2009，379（1）:86-91.doi:10.1016/j.Bbrc.2008.12.022.

［9］Dallol A，Morton D，Mather ER，et al.SLIT2 axon guidance moleculeisfrequentlyinactivatedincolorectalcancerand suppresses growth of colorectal carcinoma cells［J］.Cancer Res，2003，63（5）:1054-1058.

［10］Kim GE，Lee KH，Choi YD，et al.Detection of Slit2 promoter hypermethylation in tissue and serum samples from breast cancer patients［J］.Virchows Arch，2011，459（4）:383-390.doi:10.1007/ s00428-011-1143-5.

［11］Suzuki M，Shiraishi K，Eguchi A，et al.Aberrant methylation of LINE-1，SLIT2，MAL and IGFBP7 in non-small cell lung cancer［J］.OncolRep，2013，29（4）:1308-1314.doi:10.3892/ or.2013.2266.

［12］Dong R，Yu J，Pu H，et al.Frequent SLIT2 promoter methylation in the serum of patients with ovarian cancer［J］.J Int Med Res，2012，40（2）:681-686.doi:10.1177/14732300120400023.

［13］Dallol A，Krex D，Hesson L，et al.Frequent epigenetic inactivation of the SLIT2 gene in gliomas［J］.Oncogene，2003，22（29）:4611-4616.doi:10.1038/sj.onc.1206687.

［14］Ye MH，Chen J，Lai MD.Pyrosequencing technology and its application in clinical diagnosis and treatment［J］.Chin J Pathol，2013，42（2）:138-142.［葉美華，陳儉，來(lái)茂德.焦磷酸測(cè)序技術(shù)及其在臨床診療中的應(yīng)用［J］.中華病理學(xué)雜志，2013，42（2）: 138-142］.doi:10.3760/cma.j.issn.0529-5807.2013.02.018.

［15］Zhao FH，Hu SY，Wang SM，et al.Association between high-risk human papillomavirus DNA load and different histological grades of cervical neoplasia［J］.Chin J Prev Med，2009，43（7）:565-570.［趙方輝，胡尚英，王少明，等.高危型人乳頭瘤病毒載量與子宮頸病變的關(guān)系［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2009，43（7）:565-570］.doi：10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2009.07.008.

［16］Hernández-Hernández DM，Ornelas-Bernal L，Guido-Jiménez M，et al.Association between high-risk human papillomavirus DNA load and precursor lesions of cervical cancer in Mexican women［J］. Gynecol Oncol，2003，90（2）:310-317.

［17］Yang LL，Zhu YB.Investigation of cervical lesions with the high risk HPV viral load［J］.Journal of Practical Obstetrics and Gynecology，2015，31（4）:282-284.［楊亮亮，朱義保.高危型人乳頭瘤病毒負(fù)荷量與宮頸病變相關(guān)關(guān)系研究［J］.實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2015，31（4）:282-284］.

（2016-08-17收稿 2016-09-17修回）

（本文編輯 閆娟）

Diagnostic value of quantitative detection of SLIT2 methylation for cervical high grade precancerous lesion

YUAN Liqin1,HU Yuanjing2△
1 Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2 Department of Gynecology and Obstetrics,Tianjin Central Hospital△

ObjectiveTo explore the clinical diagnostic value of quantitative detection of the slit homologue 2(SLIT2）methylation for cervical high grade precancerous lesions.MethodsAccording to histopathologic diagnostic results,178 patients infected with high-risk HPV were divided into normal cervix group(n=45),low-grade lesion group(n=50)and highgrade lesion group(n=83).The cervical exfoliated cells were collected in three groups.The methylation levels of SLIT2 were measured by pyrosequencing in three groups.The diagnostic threshold of SLIT2 in high grade precancerous lesions was estimated by receiver operating characteristic(ROC)curve.ResultsThe percentages of SLIT2 methylation were(4.53± 1.37)%,(5.81±2.26)%and(11.80±8.47)%in normal cervix group,low-grade lesion group and high-grade lesion group, respectively.And the differences between three groups were statistically significant(F=27.61,P＜0.001).The percentage of SLIT2 methylation was significantly higher in high-grade lesion group than that of normal cervix group and low-grade lesion group(P＜0.001).There was no significant difference in the percentage of SLIT2 methylation between normal cervix group and low-grade lesion group(P=0.297).The area under the ROC curve was 0.895 and optimal cut-off value was 6.41%.The sensitivity and specificity were 80.7%and 83.2%,respectively for the detection by SLIT2 methylation.ConclusionThe quantitative detection of SLIT2 gene methylation level in cervical exfoliated cells by pyrosequencing can effectively diagnose cervical high grade precancerous lesions.

uterine cervical neoplasms;precancerous conditions;DNA methylation;alphapapillomavirus;cevical precancerous lesions;slit homologue 2

R711.74

A

10.11958/20160854

天津市衛(wèi)生局科研課題資助項(xiàng)目（13KG134）

1天津醫(yī)科大學(xué)（郵編300070）；2天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院

袁立芹（1987），女，碩士在讀，主要從事婦科腫瘤方向研究

△通訊作者E-mail:tdjhyj@hotmail.com