靳春鵬，楊套偉，徐美娟，張顯，饒志明*

1(國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專(zhuān)利局專(zhuān)利審查協(xié)作北京中心, 北京, 100081) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 3(江南大學(xué)(如皋)食品生物技術(shù)研究所，江蘇 如皋，226500)

谷氨酸脫羧酶基因工程改造研究進(jìn)展

靳春鵬1，楊套偉2,3，徐美娟2，張顯2，饒志明2,3*

1(國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專(zhuān)利局專(zhuān)利審查協(xié)作北京中心, 北京, 100081) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 3(江南大學(xué)(如皋)食品生物技術(shù)研究所，江蘇 如皋，226500)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一種具有重要生理功能的天然氨基酸，廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、食品、化工等行業(yè)。利用谷氨酸脫羧酶催化法合成GABA因其反應(yīng)條件溫、對(duì)環(huán)境友好和原料易得已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。該研究論述了催化合成GABA關(guān)鍵酶谷氨酸脫羧酶的分子改造、基因工程菌構(gòu)建等研究進(jìn)展。

谷氨酸脫羧酶；γ-氨基丁酸；分子改造；重組菌構(gòu)建

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一種具有重要生理功能的天然氨基酸，具有降低血壓、鎮(zhèn)靜安神、增進(jìn)腦活力、增強(qiáng)記憶等功能，在醫(yī)藥、食品保健、化工等行業(yè)具有廣泛應(yīng)用前景[1-2]。其合成方法主要包括：化學(xué)合成法[3]、植物富集法[4]和生物合成法[5-6]?；瘜W(xué)合成法因其反應(yīng)條件較為劇烈，且常用到有毒催化劑等，限制了其應(yīng)用范圍。植物富集法因植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，受資源和環(huán)境限制等因素，因此，該方法并不能應(yīng)用于GABA大量合成。微生物法因反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境友好等具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，因此，利用微生物生產(chǎn)GABA具有廣闊的應(yīng)用前景。

谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase, GAD，EC4.1.1.15)的主要功能是催化L-谷氨酸的α-羧基脫羧合成GABA，廣泛分布于微生物和動(dòng)植物等各種有機(jī)體活細(xì)胞中[7]。微生物具有分布廣、生長(zhǎng)速度快、以及不受資源、環(huán)境等限制，是生物酶的重要來(lái)源。為了提高GABA合成效率，研究者對(duì)GAD進(jìn)行了大量研究，包括篩選獲得了不同來(lái)源的GAD，并對(duì)GAD進(jìn)行分子改造和修飾研究。

本文首先概述了不同來(lái)源的GAD，并比較了其部分酶學(xué)性質(zhì)；繼而綜述了目前對(duì)GAD的分子改造，即提高GAD催化活力、熱穩(wěn)定性，和拓展GAD在偏中性環(huán)境中的催化活力和催化效率方面的研究狀況；隨后，概述以谷氨酸為底物合成GABA基因工程菌構(gòu)建及應(yīng)用的研究進(jìn)展。最后，討論了在棒桿菌中構(gòu)建以廉價(jià)底物葡萄糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)GABA的重組菌株，以便為工業(yè)化生產(chǎn)GABA提供了新的方向。

1 谷氨酸脫羧酶

1.1 不同來(lái)源的谷氨酸脫羧酶

本文概述了不同來(lái)源的GAD，并對(duì)其部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了比較。由表1可知，GAD來(lái)源比較廣泛，人們不但對(duì)微生物中的GAD進(jìn)行研究，在谷物、甚至水果中的GAD也有大量研究。不同來(lái)源的GAD在酶學(xué)性質(zhì)上存在一定的差異。大部分的GAD最適作用pH偏酸性環(huán)境，一般在4.0～6.0之間，而當(dāng)環(huán)境pH>6時(shí)，GAD活力急劇下降，甚至完全喪失催化活性。極少數(shù)來(lái)源的GAD最適作用pH偏堿性環(huán)境，如P.horikoshii來(lái)源的GAD最適作用pH為8.0。大部分的GAD最適作用溫度在37～50 ℃，很少來(lái)源GAD最適作用溫度在50 ℃以上，目前報(bào)道的最耐熱的GAD來(lái)源于P.horikoshii，其最適作用溫度可以達(dá)到97 ℃。另外，由表1可以看出，不同來(lái)源的GAD對(duì)底物谷氨酸/谷氨酸鹽的親和力存在較大差別，甚至同一屬來(lái)源的GAD對(duì)底物谷氨酸/谷氨酸鹽的親和力也存在比較大的差別?？傮w而言，微生物來(lái)源的GAD比植物來(lái)源的GAD對(duì)底物谷氨酸/谷氨酸鹽具有更好的親和力。

一般來(lái)說(shuō)，激活劑能夠顯著提高酶的活力以及催化效率。因此，大量研究者對(duì)GAD的激活劑進(jìn)行了篩選研究。如表1所示，磷酸吡哆醛(PLP)是谷氨酸脫羧酶一個(gè)輔助因子，但是并不是所有來(lái)源的GAD都需要PLP參與，這無(wú)疑可以降低生產(chǎn)成本。另外，研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+是GAD最通用的激活劑，其能激活大部分來(lái)源的GAD活力。Mg2+, Mn2+甚至 Li+和Ba2+也可以作為GAD的激活劑。而在生產(chǎn)研究過(guò)程中，則要求盡可能少地加入額外的物質(zhì)，以便降低生產(chǎn)成本，因此，對(duì)PLP、金屬離子等激活劑依賴(lài)較低的GAD將是工業(yè)生產(chǎn)中首選的對(duì)象。

表1 不同來(lái)源的谷氨酸脫羧酶及其部分酶學(xué)性質(zhì)

1.2 谷氨酸脫羧酶分子改造研究

一般情況下，在酶催化工業(yè)中，要求酶具有較高的催化效率，同時(shí)最適作用pH為中性環(huán)境，以便減少酸堿加入量，降低生產(chǎn)成本。因此，研究者對(duì)GAD的分子改造一般集中在2個(gè)方面，1是提高GAD催化活力或熱穩(wěn)定性，2是拓展GAD在偏中性環(huán)境中的催化活力和催化效率。

1.2.1 基于提高GAD催化活力或熱穩(wěn)定性的研究

目前，關(guān)于提高GAD酶活力的研究報(bào)道較少。LIN等[34]通過(guò)易錯(cuò)PCR對(duì)短乳桿菌來(lái)源的GAD進(jìn)行隨機(jī)突變，篩選獲得1個(gè)酶活力比原始GAD提高1.2倍的突變體Q51H；在此基礎(chǔ)上對(duì)51位進(jìn)行飽和突變，并為獲得比突變體Q51H活力更高的突變體。而在進(jìn)行N端缺失的試驗(yàn)中，他們發(fā)現(xiàn)第88位的天冬氨酸和N端區(qū)域?qū)AD的活力和正確折疊起到?jīng)Q定性作用。為了GAD 的催化活力或熱穩(wěn)定性，柯丕余等通過(guò)分析短乳桿菌GAD1407三維模擬結(jié)構(gòu)的拉氏圖，確定K413為GAD1407不穩(wěn)定氨基酸殘基位點(diǎn)，并對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變獲得2個(gè)突變體K413A 在50℃的半衰期是原始酶的2.1倍，而突變酶K413I 熱穩(wěn)定性沒(méi)有明顯的提高，但其酶活力是野生酶的1.6倍。

1.2.2 基于拓寬GAD酶催化pH作用范圍的研究

據(jù)大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道(表1)，GAD作用pH一般在4.0～6.0之間，而當(dāng)環(huán)境pH>6時(shí)，GAD活力急劇下降，甚至完全喪失催化活性。較低的pH，在酶催化過(guò)程中需要加入無(wú)機(jī)鹽作為緩沖劑，這無(wú)疑增加生產(chǎn)成本和下游提取費(fèi)用；而催化底物谷氨酸和谷氨酸鈉在酸性環(huán)境中的溶解度都較低，不利于GAD的催化反應(yīng)進(jìn)行和GABA的高效合成。因此，大部分學(xué)者就如何拓寬GAD的pH作用范圍開(kāi)展了大量研究。

PENNACCHIETTI等[35]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對(duì)465位的His進(jìn)行突變時(shí)，GadBH465A和GadBΔHT活性位點(diǎn)的“鎖”不能形成，而突變體pH作用范圍明顯向堿性拓展，因此，他們推測(cè)His465并非GAD的活性位點(diǎn)，對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行突變，并沒(méi)有使其失活而是改變了酶的構(gòu)型，該位點(diǎn)對(duì)整個(gè)構(gòu)型的協(xié)調(diào)性是必須的。

KANG等[36]構(gòu)建了大腸桿菌來(lái)源的GAD△466突變體，改突變體催化活力和pH作用范圍均得到大幅提升。

THU等[37]發(fā)現(xiàn)，E.coli來(lái)源的GAD在pH6.0時(shí)基本完全喪失活力，而刪除該GAD的C末端15個(gè)氨基酸殘基 (Δ452～466) 時(shí)，突變體GAD(Δ452～466)的pH作用范圍向堿性偏移的1個(gè)pH，該突變體在pH7.0時(shí)基本完全喪失活力。突變體 Glu89Gln/Δ452～466的pH作用范圍繼續(xù)向堿性偏移的0.5個(gè)pH，其在pH7.5時(shí)基本完全喪失活力。Glu89Gln/His465Ala在pH8.5時(shí)基本完全喪失活力，但是其pH4催化活力比原始酶降低了25%。

林玲等[38]發(fā)現(xiàn)來(lái)自短乳桿菌CGMCC NO．1306的谷氨酸脫羧酶(GADl407)催化pH范圍較窄(4.2～5.2)，當(dāng)pH大于5.0以后，隨著pH的增大酶活性急劇下降。與擬南芥GADl的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)影響GAD1407催化pH特性的關(guān)鍵位點(diǎn)：S307。通過(guò)對(duì)這個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變并篩選，最終確定S307N拓寬了該酶催化的最適pH范圍。

De BIASE等[39]對(duì)改變GAD的pH作用范圍進(jìn)行了總結(jié)，他們發(fā)現(xiàn)，GAD有3個(gè)區(qū)域與pH作用范圍有關(guān)，1是N端前15位氨基酸，2是C端347～466位氨基酸，3是300～313位點(diǎn)，這些位點(diǎn)位在PLP主要結(jié)合區(qū)域組成了一個(gè)-發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

2 以谷氨酸為底物合成GABA基因工程菌構(gòu)建及應(yīng)用研究

在酶催化工業(yè)中，人們通常希望酶的生產(chǎn)者具有高效合成具有優(yōu)良工業(yè)屬性的酶催化劑，而對(duì)于GAD的合成也是如此。而自然界中的天然GAD生產(chǎn)者，要么所產(chǎn)天然GAD特性不適合工業(yè)化生產(chǎn)要求，要么GAD產(chǎn)量和生產(chǎn)效率比較低等問(wèn)題。對(duì)于酶的特性改造，我們已經(jīng)在前一部分進(jìn)行了綜述，而在這一部分我們將概述以谷氨酸為底物合成GABA基因工程菌構(gòu)建及應(yīng)用的研究進(jìn)展，具體研究情況如表2所示。

表2 利用基因工程菌合成GABA

2.1 大腸桿菌

大腸桿菌因其生長(zhǎng)速度快，遺傳背景清晰以及分子操作技術(shù)成熟等優(yōu)點(diǎn)，在基因工程領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。研究者構(gòu)建了GAD過(guò)表達(dá)的大腸桿菌基因工程菌，并開(kāi)展了GABA合成研究。

張?zhí)烀鹊萚40]將來(lái)源于Lactococcuslactissubsp．lactisIL1403的GAD基因通過(guò)pET-22b(+)質(zhì)粒為載體克隆至E.coliBL21(DE3)中，構(gòu)建了基因重組。重組菌GAD的活力比原始菌株有明顯提高；原始菌轉(zhuǎn)化5 h，底物轉(zhuǎn)化率為55.8%，而重組菌0.5 h時(shí)的底物轉(zhuǎn)化率就達(dá)到了98.3%。

王期等[41]將E.coliBL21(DE3)來(lái)源的GAD通過(guò)pET-28a(+)質(zhì)粒為載體自身中過(guò)量表達(dá)，重組菌E.coliK. 12中GAD活力比原始菌提高了60倍。工程菌1.15 U粗酶液以31 g/L的L-谷氨酸鈉為底物，反應(yīng)4 h，L-谷氨酸鈉的轉(zhuǎn)化率為93%。

田靈芝等[15]將來(lái)源于植物乳桿菌GB 01-21的GAD基因通過(guò)pET-22b(+)質(zhì)粒為載體克隆至E.coliBL21(DE3)中，GAD成功在大腸桿菌E.coliBL21 (DE3) 中高效誘導(dǎo)表達(dá)，為植物乳桿菌GB 01-21中GAD 酶活的4.24倍。將該重組菌應(yīng)用于轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)GABA，最終5 L 發(fā)酵罐上進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，批次添加底物L(fēng)-谷氨酸共600 g，轉(zhuǎn)化24 h，GABA 累計(jì)濃度可達(dá)204.5 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為97.92%，為其工業(yè)化應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。

LE VO等[42]將谷氨酸脫羧酶GadA和GadB分別與谷氨酸/GABA反向轉(zhuǎn)運(yùn)體GadC進(jìn)行不同形式的融合表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GadA和GadC融合體催化活性最高，以10 g/L谷氨酸鈉為底物，可以獲得5.65 g/L的GABA，轉(zhuǎn)化率達(dá)到93%。

KANG等[36]構(gòu)建了大腸桿菌來(lái)源的GAD進(jìn)行突變獲得突變體GADΔ466，該突變體催化活力和pH作用范圍均得到大幅提升，在無(wú)緩沖液體系中，利用改突變體進(jìn)行催化合成GABA，3 h獲得1 mol的GABA，合成效率達(dá)到34.3 g/(L·h)。該方法反應(yīng)體系中無(wú)需添加無(wú)機(jī)鹽作為緩沖試劑，有利于降低下游操作工序和成本。

2.2 枯草芽孢桿菌

芽孢桿菌遺傳背景清楚，蛋白質(zhì)分泌機(jī)制健全，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，不產(chǎn)內(nèi)毒素，適用于原核生物基因的克隆、表達(dá)以及重組蛋白多肽的有效分泌。莫征杰等[49]將LactobacillusplantarumZJ3443來(lái)源的GAD編碼基因lapgad通過(guò)質(zhì)粒pMA5導(dǎo)入到BacillussubtilisWB600系統(tǒng)中，實(shí)現(xiàn)了GAD基因在的B.subtilis異源重組表達(dá)，其胞內(nèi)酶活達(dá)到0.35 U/mg。并考察了重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化谷氨酸生產(chǎn)γ-氨基丁酸的最佳轉(zhuǎn)化條件：溫度為37 ℃，pH為4.5，添加1 mmol/L Ca2+作為激活劑。

丁偉等[50]從大腸桿菌來(lái)源的GAD基因gadB導(dǎo)入枯草芽孢桿菌168，構(gòu)建了1株高表達(dá)GAD 的枯草桿菌，然后通過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化，使得發(fā)酵酶活提高了188.8%，確定了最佳發(fā)酵參數(shù)，為利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)GABA 奠定了基礎(chǔ)。

2.3 乳酸菌

乳酸菌是GAD主要生產(chǎn)菌株，但其天然GAD活力較低。為了提高乳酸菌催化合成GABA能力，KOOK等[44]將L.plantarumATCC 14917 GAD基因通過(guò)穿梭載體pTRKH2導(dǎo)入到L.sakeiB2-16中。重組菌L.sakeiB2-16的GABA產(chǎn)量265.3 mmol/L，比原始菌提高了1.42倍。雖然乳酸菌催化生產(chǎn)安全性高，但發(fā)酵培養(yǎng)困難、成本高、GABA產(chǎn)量低。

2.4 釀酒酵母

酵母菌具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，外源基因表達(dá)系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定，且生產(chǎn)安全性較高。烏云達(dá)來(lái)等[51]將釀酒酵母28的GAD1基因通過(guò)質(zhì)粒pUG6在自身體系中進(jìn)行過(guò)表達(dá)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組菌GAD酶活力比菌株28提高73.8%。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出結(jié)論，GAD基因高表達(dá)菌株DL28具有更高的G418抗性和GAD酶活性，但并未用于催化合成GABA研究。

2.5 谷氨酸棒桿菌

谷氨酸棒桿菌是氨基酸工業(yè)常用生產(chǎn)菌株，尤其在谷氨酸生產(chǎn)中被廣泛利用。SHI等[45]將L.brevisLb85來(lái)源的GAD基因gadB2、L-谷氨酸/GABA逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體基因gadC和上游調(diào)控基因gadR在谷氨酸棒桿菌中成功共表達(dá)，以谷氨酸為底物，重組谷氨酸棒桿菌pDXW-8/gadRCB2發(fā)酵72 h，GABA濃度僅為2.15 g/L。為了提高重組谷氨酸棒桿菌合成GABA效率，SHI等[46]隨后將L. brevis Lb85來(lái)源的GAD基因gadB1和gadB2在谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行共表達(dá)，相比于單表達(dá)一個(gè)GAD基因，共表達(dá)2個(gè)GAD基因的重組菌GABA產(chǎn)量提高了1倍，最終，搖瓶發(fā)酵120 h，GABA產(chǎn)量達(dá)到27.13 ± 0.54 g/L，發(fā)酵罐培養(yǎng)60 h，GABA產(chǎn)量達(dá)到26.32 g/L, GABA產(chǎn)率為0.60～0.74 mol/mol。

3 廉價(jià)底物合成GABA研究

谷氨酸是GABA合成常用的底物，而谷氨酸發(fā)酵一般是以棒桿菌為生產(chǎn)菌株發(fā)酵代謝葡萄糖實(shí)現(xiàn)，因此，為降低生產(chǎn)成本，研究者嘗試在棒桿菌中構(gòu)建以葡萄糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)GABA的重組菌株。

TAKAHASHI等[47]將E.coliW3110來(lái)源的GAD導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌中，獲得一種能以葡萄糖為底物直接發(fā)酵法合成GABA的重組菌，該菌株能在72 h內(nèi)以葡萄糖為底物生產(chǎn)12.37±0.88 g/L的GABA，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到0.172 g/(L·h)。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶G調(diào)控三羧酸循環(huán)進(jìn)入谷氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶2-酮戊二酸脫氫酶活力，因此，OKAI等[48]在上述基礎(chǔ)上，為了提高谷氨酸合成途徑中2-酮戊二酸脫氫酶活力活力，他們敲除了絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶G的編碼基因pknG，獲得1株重組谷氨酸棒桿菌GADΔpknG；在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1 mmol磷酸吡哆醛(PLP)，該菌株可以在120 h內(nèi)以100 g/L葡萄糖為底物發(fā)酵合成31.1 ± 0.41 g/L的GABA，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到0.259 g/(L·h)，GABA產(chǎn)率達(dá)到0.893 mol/mol葡萄糖。

孫紅梅等[52]將來(lái)自于植物乳桿菌γ-氨基丁酸合成途徑的關(guān)鍵酶谷氨酸脫羧酶基因(lpgad)在產(chǎn)谷氨酸菌株鈍齒棒桿菌中進(jìn)行整合表達(dá)，通過(guò)重疊PCR 的方法獲得鈍齒棒桿菌精氨酸合成途徑關(guān)鍵酶N-乙酰谷氨酸激酶( NAGK) 基因內(nèi)部缺失型基因ΔargB，獲得1株能以葡萄糖為底物發(fā)酵合成γ-氨基丁酸的重組鈍齒棒桿菌；發(fā)酵96 h，重組菌可合成約8.28 g/L 的GABA，且發(fā)酵液無(wú)精氨酸積累。

ZHANG等[5]通過(guò)系統(tǒng)代謝工程技術(shù)改造谷氨酸棒桿菌，首先通過(guò)插入突變技術(shù)，將帶tac啟動(dòng)子的GAD編碼基因tacgad導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌argB和proB基因內(nèi)部，在引入GAD的同時(shí)阻斷L-精氨酸和L-脯氨酸合成途徑。隨后將帶tac啟動(dòng)子的PLP合成關(guān)鍵酶基因tacplk插入dapA內(nèi)部，在引入PLP合成關(guān)鍵酶的同時(shí)阻斷L-賴(lài)氨酸合成途徑，最終獲得1株無(wú)需添加PLP既能高效合成GABA的重組谷氨酸棒桿菌。通過(guò)發(fā)酵流加實(shí)驗(yàn)，該菌株能夠在70 h內(nèi)以葡萄糖為底物發(fā)酵合成70.6 g/L的GABA，這是目前報(bào)道的利用葡萄糖一步法合成GABA的最高產(chǎn)量。

4 結(jié)論與展望

目前，生物法合成GABA主要包括酶轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法。酶催化法合成GABA通常以谷氨酸為底物，通過(guò)GAD一步催化合成GABA，相對(duì)于發(fā)酵法，步驟單一，反應(yīng)體系成分簡(jiǎn)單。不足之處是酶需要分離獲得、且反應(yīng)過(guò)程不能持久，采用固定化細(xì)胞可以提高批次使用效率[53]，但是其催化效率偏低，有待進(jìn)一步篩選固定化材料和方法。另外，GAD作用pH偏酸性，需要加入無(wú)機(jī)鹽維持最適催化環(huán)境，增加了生產(chǎn)附加成分。本文重點(diǎn)概述了拓展GAD在偏中性環(huán)境中的催化活力和催化效率方面的研究狀況，GAD有3個(gè)區(qū)域與pH作用范圍有關(guān)，1是N端前15位氨基酸，2是C端347～466位氨基酸，3是300～313位點(diǎn)，這些位點(diǎn)位在PLP主要結(jié)合區(qū)域組成了一個(gè)-發(fā)夾結(jié)構(gòu)，對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行分子改造，有利于拓寬GAD在偏中性環(huán)境中的催化效率。

微生物發(fā)酵法合成GABA通常采用谷氨酸為底物，本文概述以谷氨酸為底物合成GABA基因工程菌構(gòu)建及應(yīng)用的研究進(jìn)展，覆蓋了大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌和谷氨酸棒桿菌。接著討論了在棒桿菌中構(gòu)建以葡萄糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)GABA的重組菌株，避免了谷氨酸為原料的附加成本，更加廉價(jià)，為工業(yè)化生產(chǎn)GABA的研究目標(biāo)提供了新方向。但是，GABA前體谷氨酸生產(chǎn)條件一般控制在偏中性環(huán)境，而GAD催化的pH范圍在4～6之間，這就會(huì)因前后兩個(gè)途徑所需環(huán)境不同而導(dǎo)致GABA合成效率較低。為解決這一矛盾，YANG等[7]C.glutamicum和L.plantarum雙階段發(fā)酵葡萄糖合成GABA，并取得了良好的結(jié)果，但是GABA產(chǎn)量還無(wú)法和酶催化法相媲美。另外，發(fā)酵法由于其發(fā)酵液中成分復(fù)雜，對(duì)下游分離提取造成不小的負(fù)擔(dān)。因此，結(jié)合GAD分子改造策略，開(kāi)發(fā)能在偏中性環(huán)境中高效利用葡萄糖生產(chǎn)GABA的生產(chǎn)菌株，和開(kāi)發(fā)GABA簡(jiǎn)單、有效的分離提取策略和裝置，將有望成為今后重點(diǎn)研究的方向。

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Genetically engineered modification of glutamate decarboxylase

JIN Chun-peng1, YANG Tao-wei2,3, XU Mei-juan2, ZHANG Xian2, RAO Zhi-ming2,3

1 (Patent Examination Cooperation Center of the Patent Office, SIPO, Beijing 100190, China) 2 (The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 3 (Jiangnan University (Rugao) Food Biotechnology Research Institute, Rugao 226500, China)

γ-Aminobutyric acid (GABA) is a kind of important non-protein amino acid. GABA can be used as a bioactive component in pharmaceutical, food, and chemical fields. The advantages of enzymatic synthesis of GABA are mild reaction conditions, simple operational procedure and easily available raw material. So, enzymatic synthesis of GABA by glutamate decarboxylase (GAD) has attracted growing attention in recent years. This review summarizes various strategies for molecular modification of GAD and construction of genetic engineered strain.

glutamate decarboxylase; γ-aminobutyric acid; molecular modification; construction of recombinant strain

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612039

碩士,助理研究員(楊套偉為共同第一作者，饒志明教授為通訊作者，E-mail: raozhm@jiangnan.edu.cn)。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃) (2015AA021004)；江蘇省杰出青年科學(xué)基金(BK20150002)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20161292)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程

2016-06-15，改回日期：2016-07-28