王娜妮, 壽 旦,2, 王緒平, 朱 巖(. 浙江省中醫(yī)藥研究院中藥研究中心, 浙江 杭州 30007; 2. 浙江大學(xué)化學(xué)系, 浙江 杭州 30007)

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(下)·研究論文

移液槍頭式固相微萃取-高效液相色譜法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中的4種生物堿

王娜妮1, 壽 旦1,2, 王緒平1, 朱 巖2*
(1. 浙江省中醫(yī)藥研究院中藥研究中心, 浙江 杭州 310007; 2. 浙江大學(xué)化學(xué)系, 浙江 杭州 310007)

建立了移液槍頭式固相微萃取(SPME)-高效液相色譜檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中4種生物堿(黃柏堿、藥根堿、巴馬丁和小檗堿)的分析方法。以甲基丙烯酸為反應(yīng)單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈為引發(fā)劑,在移液槍頭內(nèi)進(jìn)行原位聚合反應(yīng),制備含有弱陽離子交換整體固定相的SPME槍頭。樣品經(jīng)SPME凈化后,用高效液相色譜-紫外檢測法進(jìn)行分析,流動(dòng)相為乙腈-磷酸二氫鉀溶液(0.05 mol/L, pH 4),紫外檢測波長為270 nm,外標(biāo)法定量。4種生物堿的檢出限(S/N=3)為0.16～0.39 μg/L;以空白細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn),加標(biāo)回收率為92.73%～97.91%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.14%～3.31%。該方法簡單、靈敏、準(zhǔn)確,能夠用于細(xì)胞培養(yǎng)液中微量生物堿的分析研究。

高效液相色譜;固相微萃取;整體柱;生物堿;黃柏

黃柏為常用中藥,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,原名“檗木”,具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效[1]。黃柏的主要藥效成分為生物堿[2],包括黃柏堿、藥根堿、巴馬丁和小檗堿,臨床上常用于降血壓、抗心律失常、抗血小板聚集、降血糖、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性、抗氧化等[3,4]。

細(xì)胞藥理實(shí)驗(yàn)是研究中藥藥效物質(zhì)的重要手段,因此研究細(xì)胞培養(yǎng)液中有效成分的變化,能夠?yàn)槊鞔_中藥的藥效、物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供理論依據(jù)[5]。而細(xì)胞培養(yǎng)液的分析存在樣品基質(zhì)復(fù)雜和有效成分含量低等問題[6],需采取適當(dāng)?shù)姆蛛x、凈化、富集等樣品前處理技術(shù)，以增加檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度,同時(shí)降低對整個(gè)檢測系統(tǒng)的污染。

固相萃取技術(shù)是目前應(yīng)用較為廣泛的一種樣品前處理技術(shù)[7],已應(yīng)用于環(huán)境、化工、食品等多個(gè)領(lǐng)域[8]。采用固相萃取柱進(jìn)行萃取時(shí),因其柱體積大、樣品用量多,難以用于血液、細(xì)胞培養(yǎng)液、組織液等微量生物樣品的分析,從而限制了該技術(shù)的應(yīng)用[9]。因此,固相萃取的微型化已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[10]。移液槍頭在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用廣泛,可通過內(nèi)置固相萃取吸附劑,同時(shí)實(shí)現(xiàn)采樣、定量、凈化和富集,彌補(bǔ)傳統(tǒng)生物樣品前處理方法操作復(fù)雜、有機(jī)溶劑用量大、目標(biāo)物易損失等技術(shù)缺陷[11,12]。本文通過原位聚合法將聚(甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整體固定相內(nèi)置于移液槍頭內(nèi),制成具有弱陽離子交換基團(tuán)的固相微萃取(SPME)裝置,用于微量細(xì)胞培養(yǎng)液的前處理和生物堿的富集,為進(jìn)一步開展藥效篩選和藥理實(shí)驗(yàn)、科學(xué)合理地利用藥用植物資源提供技術(shù)手段和科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Ultimate 3000高效液相色譜(HPLC)儀、Orion 3-Star pH計(jì)、311型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、Reacti-ThermTS-18823氮吹儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司); DK-S24電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司); KQ-400DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司); DJ-10A傾倒式粉碎機(jī)(上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司); YJ-40L超純水機(jī)(杭州亞潔環(huán)保設(shè)備有限公司)。

黃柏堿(批次11062401)、藥根堿(批次15050712)、巴馬丁(批次16022614)和小檗堿對照品(批次15010411)均購自北京恒元啟天化工技術(shù)研究院,純度>98%。乙二醇二甲基丙烯酸酯(純度>97%)、甲基丙烯酸(純度>95%)均購自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社;異丙醇、1,4-丁二醇、偶氮二異丁腈、無水乙醇、磷酸二氫鉀、甲醇(分析純)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈(色譜純)購自上海阿拉丁試劑有限公司;DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。本實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水(18.2 MΩ5cm)。

1.2 整體柱的制備

采用原位聚合法制備聚(甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整體柱[13]。分別稱取0.9 mL甲基丙烯酸(單體)、0.3 mL乙二醇二甲基丙烯酸酯(交聯(lián)劑)、1.8 mL三元致孔劑(包括1.05 mL異丙醇、0.6 mL 1,4-丁二醇和0.15 mL去離子水)、5.0 mg偶氮二異丁腈(引發(fā)劑)于10 mL燒杯中,于冰浴中超聲10 min,混勻,形成反應(yīng)混合液。將500 μL反應(yīng)混合液用移液槍迅速吸入經(jīng)甲醇清洗過的2 mL移液槍頭中,用硅膠墊密封,于60 ℃烘箱中聚合反應(yīng)24 h后,用無水乙醇和去離子水反復(fù)沖洗。

1.3 樣品前處理

1.3.1黃柏提取物的制備

采用熱水提取法制備黃柏提取物。將黃柏藥材干燥后粉碎,稱取50.0 g黃柏粉末于3 000 mL圓底燒瓶中,加入1 000 mL水,回流提取2 h,共3次,合并提取液,減壓蒸餾至干,得到黃褐色固體狀的黃柏提取物,于4 ℃冷藏保存。稱取100 mg黃柏提取物,用細(xì)胞培養(yǎng)液溶解后,過0.22 μm濾膜,其生藥含量為0.50 g/L。

圖1 固相微萃取流程示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the extraction procedure

1.3.2固相微萃取

固相微萃取的整個(gè)過程均通過移液槍吸取溶液或樣品(流程見圖1)。 具體步驟，①活化整體柱:分別吸取1.0 mL甲醇和0.5 mL水沖洗整體柱;②取樣:吸入1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液或細(xì)胞培養(yǎng)液,經(jīng)8 min后排出;③凈化:吸取1.0 mL水后立即排出;④洗脫:吸取1.0 mL氨水-甲醇混合溶液(18∶82, v/v),經(jīng)10 min后排出;⑤濃縮:收集洗脫液,氮?dú)獯蹈珊?用100 μL乙腈-磷酸二氫鉀溶液(0.05 mol/L, pH 4)(90∶10, v/v)溶解,待HPLC分析。

1.3.3細(xì)胞培養(yǎng)與給藥

采用成骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)過程[14]:將新生乳鼠置于75%(v/v)乙醇溶液中浸泡10 min,切下顱蓋骨于無鈣、鎂離子的平衡鹽溶液(D-Hanks液)內(nèi),清除骨膜、血管等結(jié)締組織,用D-Hanks液洗凈顱蓋骨,剪成1 mm×1 mm大小的骨片,置于0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶溶液,消化30 min,加入含10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胎牛血清(FBS)的完全培養(yǎng)基終止消化,將消化后的顱蓋骨片移入0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Ⅱ型膠原酶溶液中振蕩30 min后,以1 000 r/min離心10 min,吸去上清液,沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊用培養(yǎng)液吹打成細(xì)胞懸液,接種于培養(yǎng)瓶,于37 ℃ 含有5%(v/v)CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2～3 d換液1次,直至80%的細(xì)胞融合,然后對細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在接種6 d的成骨細(xì)胞中加入1.5 mL 0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶,消化5 min,加入等體積FBS培養(yǎng)基與胰酶,以1 000 r/min離心5 min,收集沉淀,用培養(yǎng)液吹打成為合適濃度細(xì)胞液后,接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h后，加入黃柏提取物溶液,采集5 h、24 h的細(xì)胞培養(yǎng)液樣品,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,待SPME凈化和色譜分析。

1.4 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫為30 ℃;流動(dòng)相為(A)乙腈-(B)磷酸二氫鉀溶液(0.05 mol/L, pH 4);流速為1.0 mL/min。梯度洗脫條件:0～10 min, 90%B～80%B; 10～50 min, 80%B。進(jìn)樣量為20 μL;紫外檢測波長為270 nm。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用乙腈-磷酸二氫鉀(0.05 mol/L, pH 4)(90∶10, v/v)混合溶液配制質(zhì)量濃度為50、100、200、300、500、700、1 000 μg/L的黃柏堿系列標(biāo)準(zhǔn)溶液;配制質(zhì)量濃度為5、10、50、100、200、300、500 μg/L的藥根堿和巴馬丁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液;配制質(zhì)量濃度為100、200、500、1 000、1 500、2 000、3 000 μg/L的小檗堿系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 整體柱的形態(tài)表征

整體柱為連續(xù)多孔結(jié)構(gòu),其比表面積對分離能力有很大影響。為保證整體柱具有良好分離效果的同時(shí)還能具備較低的系統(tǒng)壓力,需選擇合適的致孔劑來控制整體柱的孔隙結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)選擇了三元致孔劑系統(tǒng)(異丙醇、1,4-丁二醇和水)。致孔劑在甲基丙烯酸和乙二醇二甲基丙烯酸酯混合物中具有良好的溶解性,能夠產(chǎn)生合理的孔隙結(jié)構(gòu),使柱體的柱壓較低,有利于后續(xù)的固相微萃取[15]。用掃描電子顯微鏡對材料的表觀結(jié)構(gòu)形態(tài)進(jìn)行表征(見圖2),可以看出,該整體柱具有規(guī)則的三維網(wǎng)絡(luò)骨架結(jié)構(gòu),空隙分布均勻,其中微米級(jí)大孔保證了整體柱具有良好的通透性,顆粒表面的納米級(jí)小孔有助于目標(biāo)成分的有效分離。

圖2 移液槍頭內(nèi)置整體固定相的掃描電鏡圖Fig. 2 Scanning electron microscope photographs of monolithic stationary phase in the pipette tips

2.2 整體柱制備過程的優(yōu)化

整體柱在制備過程中采用了甲基丙烯酸作為功能單體,因此材料表面具有豐富的羧酸基團(tuán),使該固相萃取材料具有親水作用、氫鍵作用和離子交換作用,其與極性化合物間的結(jié)合能力較強(qiáng)、生物堿在萃取材料和分配介質(zhì)間的分配系數(shù)較大,可達(dá)到良好的萃取效果。

表1 整體柱的制備條件對萃取效率的影響Table 1 Effect of preparation conditions of the monolithic columns on the extraction efficiencies

* Porogens.

本文以黃柏堿、藥根堿、巴馬丁和小檗堿為目標(biāo)物質(zhì),考察了系列整體柱的富集效果,并優(yōu)化了整體柱的制備條件。結(jié)果表明,單體、致孔劑、交聯(lián)劑間的配比對4種生物堿的萃取效率均有影響。當(dāng)單體、致孔劑、交聯(lián)劑的體積比為0.90∶1.80∶0.30，三元致孔劑1,4-丁二醇、異丙醇、水的體積比為0.60∶1.05∶0.15時(shí),4種生物堿的萃取效率最好(見表1)。

在最優(yōu)條件下制備的整體柱具有良好的吸附性能,對黃柏堿、藥根堿、巴馬丁和小檗堿的吸附容量分別為0.13、0.15、0.12和0.16 mg/g,能夠滿足細(xì)胞培養(yǎng)液中樣品的檢測需求。由于不同廠家生產(chǎn)的槍頭在材質(zhì)上有一定差別,本文分別考察了5種不同廠家生產(chǎn)的槍頭所制備的整體柱對目標(biāo)生物堿吸附性能的影響。結(jié)果表明,其吸附性能未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。這可能是因?yàn)槲讲牧吓c移液槍頭內(nèi)壁沒有發(fā)生化學(xué)反應(yīng),槍頭材質(zhì)對整體柱的制備沒有影響。

2.3 萃取條件的優(yōu)化

2.3.1萃取時(shí)間的選擇

萃取時(shí)間是影響SPME的一個(gè)重要因素。本實(shí)驗(yàn)考察了不同的萃取時(shí)間(2、4、6、8、10、12 min)對4種生物堿回收率的影響(見圖3)。結(jié)果表明,當(dāng)萃取時(shí)間為8 min時(shí),4種生物堿基本趨于飽和,萃取量較大。綜合考慮靈敏度和分析速度,最終將萃取時(shí)間設(shè)為8 min。

圖3 萃取時(shí)間對4種生物堿回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effect of the extraction time on the extraction recoveries of the four alkaloids (n=3)

2.3.2洗脫溶液中氨水含量的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別考察了氨水甲醇溶液作為洗脫溶劑時(shí)，不同含量(2%、6%、10%、14%、18%、22%, v/v)的氨水對4種生物堿回收率的影響(見圖4)。結(jié)果表明,當(dāng)采用2%(v/v)氨水甲醇洗脫時(shí),4種生物堿的回收率較低;當(dāng)采用18%(v/v)氨水甲醇洗脫時(shí),4種生物堿可完全洗脫。因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇18%(v/v)氨水甲醇作為洗脫溶液。

圖4 洗脫溶液中氨水的體積分?jǐn)?shù)對4種生物堿回收率的影響(n=3)Fig. 4 Effect of the volume percentage of ammoniaon the extraction recoveries of the four alkaloids (n=3)

2.3.3洗脫時(shí)間的選擇

聚合物整體柱有規(guī)則的空隙結(jié)構(gòu)和較大的比表面積,可以加速目標(biāo)成分的洗脫。移液槍吸取樣品進(jìn)入SPME槍頭,經(jīng)過一定洗脫時(shí)間后,再排出槍頭。本實(shí)驗(yàn)考察了洗脫時(shí)間(2、4、6、8、10、12 min)對4種生物堿回收率的影響(見圖5)。結(jié)果表明，隨著洗脫時(shí)間的增加,4種生物堿的回收率逐漸增大,當(dāng)洗脫時(shí)間為10 min時(shí),4種生物堿的回收率已較高。綜合考慮分析速度和萃取效率,本文最終確定洗脫時(shí)間為10 min。

圖5 洗脫時(shí)間對4種生物堿回收率的影響(n=3)Fig. 5 Effect of elution time on the extraction recoveries of the four alkaloids (n=3)

2.4 線性關(guān)系和檢出限

本文采用外標(biāo)法對4種生物堿進(jìn)行定量分析。按1.5節(jié)所述配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,以各組分的峰面積(y)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(x, μg/L)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,4種生物堿在其線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 3～0.999 6(見表2)。取10份空白樣品,添加一定質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,計(jì)算各化合物的檢出限(LOD,S/N=3),結(jié)果為0.16～0.39 μg/L。

表2 4種生物堿的線性范圍、校準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)(r)和檢出限Table 2 Linear ranges, calibration curves, correlationcoefficients (r) and limits of detection of the four alkaloids

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.5 回收率和精密度

向空白細(xì)胞培養(yǎng)液中添加含4種生物堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行空白加標(biāo)回收率試驗(yàn),在各自的添加水平下進(jìn)行6次平行試驗(yàn),4種生物堿的加標(biāo)回收率為92.73%～97.91%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.14%～3.31%(見表3)。結(jié)果表明,該方法的回收率及精密度均滿足定量檢測的要求。

表3 細(xì)胞培養(yǎng)液中4種生物堿的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of the four alkaloids in spiked cell culture fluids (n=6)

2.6 樣品分析

將成骨細(xì)胞用黃柏提取物處理5 h和24 h后進(jìn)行測定,其中,4種生物堿的含量見表4,處理5 h的細(xì)胞培養(yǎng)液的色譜圖見圖6?？梢钥闯?隨著時(shí)間的增加,4種生物堿的含量逐漸降低。

表4 細(xì)胞培養(yǎng)液中的4種生物堿的含量(n=3)Table 4 Contents of the four alkaloids in cell culture fluids (n=3)

圖6 細(xì)胞培養(yǎng)液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig. 6 Chromatograms of (a) a cell culture fluid and (b) a standard solution a. the cell culture fluid for 5 h; b. the standard solution, containing 400 μg/L phellodendrine, 50 μg/L jatrorrhizine, 20 μg/L palmatine, 1200 μg/L berberine.1. phellodendrine; 2. jatrorrhizine; 3. palmatine; 4. berberine.

3 結(jié)論

本文制備了含有弱陽離子交換整體柱的SPME槍頭,建立了高效液相色譜-紫外檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中黃柏堿、藥根堿、巴馬丁和小檗堿的分析方法。該方法凈化效果好、操作簡單、實(shí)用性強(qiáng),對中藥藥效物質(zhì)的研究具有重要的參考意義。

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Determination of four alkaloids in cell culture fluidsby pipette tip solid phase microextraction-highperformance liquid chromatography

WANG Nani1, SHOU Dan1,2, WANG Xuping1, ZHU Yan2*
(1.DepartmentofMedicine,ZhejiangAcademyofTraditionalChineseMedicine,Hangzhou310007,China; 2.DepartmentofChemistry,ZhejiangUniversity,Hangzhou310007,China)

A method for the determination of four alkaloids (phellodendrine, jatrorrhizine, palmatine, berberine) in cell culture fluids was developed by pipette tip solid phase microextraction (SPME) and high performance liquid chromatography (HPLC). A weak cation exchange monolithic stationary phase was prepared by in-situ polymerization in a pipette tip. Methacrylate acid, ethylene dimethacrylate and azodiisobutyronitrile were the functional monomer, the cross-linker and the initiator, respectively. The samples were cleaned-up using the microextraction tips. Phellodendrine, jatrorrhizine, palmatine and berberine were extracted from cell culture fluids. The analytes were separated on a reversed-phase Diamonsil C18 column (150 mm×4.6 mm, 5 μm) and eluted gradiently with acetonitrile and 0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution. The detection wavelength was 270 nm. The extraction performance was investigated by varying the elution solution types, the extraction and elution time and the molar ratios among monomers, cross-linkers and porogens. The analytes were quantified using external standard method. The established method was successfully applied for the pretreatment and determination of four alkaloids fromCortexPhellodendriin cell culture fluids. Under the optimal conditions, the limits of detection (S/N=3) for the analytes were 0.16-0.39 μg/L. The recoveries were in the range of 92.73%-97.91% and the relative standard deviations (RSDs) were ranged from 0.14% to 3.31% (n=6). The method is simple, sensitive and accurate. It can be used in the determination of alkaloids in cell culture fluids.

high performance liquid chromatography (HPLC); solid phase microextraction (SPME); monolithic columns; alkaloid;CortexPhellodendri

10.3724/SP.J.1123.2016.08001

2016-08-05

國家自然科學(xué)基金(81603252);浙江省自然科學(xué)基金(LQ17H280002);浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016ZQ003);浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016RCB003).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 81603252); Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (No. LQ17H280002); Zhejiang Province Science and Technology of Traditional Chinese Medicine Project (No. 2016ZQ003); Zhejiang Province Science and Technology of Medical and Health Project (No. 2016RCB003).

O658

:A

:1000-8713(2017)01-0014-06

*通訊聯(lián)系人.Tel:(0571)88273637,E-mail:zhuyan@zju.edu.cn.