李武營，王建，潘 佳，王亞秋，李艷華，程傳耀，周 芳

1.河南大學 學報編輯部，河南 開封 475001；2.河南大學淮河醫(yī)院，腫瘤科 河南 開封 475000

熱療對耐藥骨肉瘤細胞株的作用

1.河南大學 學報編輯部，河南 開封 475001；2.河南大學淮河醫(yī)院，腫瘤科 河南 開封 475000

〔目的〕 探索熱療與熱化療對骨肉瘤原代細胞系耐藥細胞系的影響?！卜椒ā?MTT法檢測不同溫度下熱療對原代細胞系和耐藥細胞系生存率的影響；并測定43 ℃溫度作用下濃度為1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL的甲氨蝶呤(MTX)和濃度為1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL的阿霉素(ADM)對原代細胞系與耐藥細胞系生存率的影響；免疫組化檢測43 ℃熱療作用下，原代細胞系與耐藥細胞系HSP70的表達?！步Y果〕 原代細胞系與耐藥細胞系熱療后細胞生存率下降；隨著化療藥物濃度增加，細胞系生存率下降；熱療作用下HSP70在原代細胞系和耐藥細胞系均表達增加。〔結論〕 熱療可能是克服骨肉瘤細胞系耐藥的一種途徑。HSP 70在熱處理后，原代細胞系和耐藥細胞系均增加，兩種細胞系HSP70表達未見差異。

骨肉瘤；熱療；耐藥

骨肉瘤是發(fā)生在青少年常見的骨惡性腫瘤。外科手術治療、內科化療等綜合治療措施的應用使腫瘤的預后有很大提高，但是耐藥問題仍然是制約細胞系療效的關鍵因素。由于骨肉瘤自身代謝及自身組織結構特點的原因，熱療成為適合骨肉瘤的治療方法。我們實驗通過熱療及化療的綜合作用，觀察對原代細胞系及耐藥細胞系生存率的影響，并探索熱療對細胞系HSP 70的表達改變。

1 材料與方法

1.1 細胞株與藥物

Saos-2原代細胞系，購自中國科學院上海細胞生物所;Saos-2/MTX4.4細胞系，我們實驗室在原代細胞系通過逐漸升高藥物濃度沖擊法培養(yǎng)成功，液氮環(huán)境下保存，實驗前復蘇細胞系，并檢測具備耐藥細胞系特點；MTX，上海華聯(lián)制藥；ADM，浙江海正藥業(yè)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，上海博鑫生物制品公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Therm公司；OLYMPUS IX-70倒置相差顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社；電熱恒溫水槽 DK-600，上海精宏實驗設備有限公司；酶標儀，美國BIO-RAD公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

骨肉瘤Saos-2細胞系及Saos-2/MTX4.4細胞系,常規(guī)37 ℃體積分數(shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用1640培養(yǎng)溶液與體積分數(shù)為10%胎牛血清，細胞株生長到對數(shù)細胞生長期實驗備用。

1.3 細胞株不同溫度熱療處理腫瘤細胞的存活率 的測定

分別取原代及耐藥細胞系5×105/mL的細胞接種96孔板，每孔200 μL，各實驗設平行4孔，細胞系在水浴中加熱(恒溫數(shù)字水浴鍋，溫度波動<±0.1 ℃)。設定在不同溫度下(37 ℃，42 ℃，43 ℃)1 h，熱處理過的細胞系放入37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后，每孔中加入5-二苯基四氮唑澳鹽(MTT)，MTT的終濃度為5 mg/L，并繼續(xù)在37 ℃孵育4 h，然后將上清液棄去并溶解150 μL二甲基亞砜。用酶標儀測定540 nm吸收波長A值。腫瘤細胞的存活率(%)=熱處理實驗A值/37 ℃實驗A值。同時設置PBS空白對照。

1.4 細胞株加入化療藥物的不同溫度處理細胞存 活率的測定

分別取原代及耐藥細胞系5×105/ mL的細胞接種96孔板，每孔200 μL，各實驗設平行4孔，細胞系分別加入MTX，終濃度為1、5、10 μg/mL和阿霉素終濃度為1、5、10 μg/mL在水浴中加熱(恒溫數(shù)字水浴鍋，溫度波動<±0.1 ℃)，設定在43 ℃溫度下1 h。熱處理過的細胞系放入37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后，每孔中加入MTT,MTT的終濃度為5 mg/L，并繼續(xù)在37 ℃孵育4 h，然后將上清液棄去并溶解150 μL二甲基亞砜。用酶標儀測定540 nm吸收波長A值。腫瘤細胞的存活率(%)=熱化療組A值/37 ℃組A值。繪制細胞存活率與藥物濃度依賴曲線。

1.5 免疫組化方法測定熱處理后耐藥細胞系與原 代細胞系在HSP70表達情況

常規(guī)方法制作原代細胞株與耐藥細胞株細胞爬片，在6孔板內放入消毒后的蓋玻片，培養(yǎng)至細胞系對數(shù)期進行試驗，分兩種處理方法，一種37 ℃培養(yǎng)不進行熱處理，另一種進行43 ℃熱處理1 h，處理后放入37 ℃培養(yǎng)箱24 h培養(yǎng)，細胞系做免疫組化實驗。每次實驗平均作3張爬片，用不加一抗細胞爬片作陰性對照，用分別陽性組織切片作陽性對照。HSP70一抗(sino,Bidogical Inc )，免疫組化用鏈菌素-親生物素過氧化物酶法(S-P)，操作按試劑盒要求進行，試劑盒夠自于福州邁新公司。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 MTT法檢測不同細胞系生存率結果

熱療處理(42 ℃，43 ℃，44 ℃)24 h后細胞系生存率均降低，與37 ℃處理細胞系比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05或P<0.01)，見表1。

表1 原代細胞與耐藥細胞系熱處理后的生存率

注：*間未見統(tǒng)計學差異(P>0.05)，*與**有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

2.2 MTT法檢測熱療與熱化療作用細胞系的結果

MTT法檢測不同細胞系43 ℃熱療處理分別加入終濃度為1、5、10 μg/mL的甲氨蝶呤(MTX)和終濃度為1、5、10 μg/mL的阿霉素(ADM)24 h后，MTT法檢測細胞系生存率，繪制生存率與藥物濃度曲線(見圖1、圖2)。發(fā)現(xiàn)：細胞系43 ℃熱處理組與原代細胞與耐藥細胞熱化療組(MTX,ADM)均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，原代細胞系與耐藥細胞系在熱療實驗(MTX,ADM)未見明顯差異(P>0.05)。

2.3 免疫組化對熱療處理細胞系的HSP 70表達 檢測結果

免疫組化方法測定耐藥與原代細胞系HSP70表達情況(見圖3,圖4,圖5,圖6)。HSP 70在Saos細胞系43 ℃熱處理后明顯表達增加，與37 ℃培養(yǎng)情況下有明顯差異(P<0.05)；HSP 70在Saos-2/MTX4.4細胞系43 ℃熱處理后表達明顯增加，與37 ℃培養(yǎng)情況下有明顯差異(P<0.05)；HSP 70在Saos細胞系與Saos-2/MTX4.4細胞系在37 ℃培養(yǎng)表達均無明顯差異(P<0.05)；HS P70在Saos-2/MTX4.4細胞系在43 ℃熱處理后表達明顯增加，熱處理兩細胞系間未見明顯差異(P<0.05)。

圖1 43 ℃熱化療MTX濃度為1 ug/mL、5 ug/mL、10 ug/mL的細胞生長曲線

圖2 43 ℃熱療ADM濃度為1 ug/mL、5 ug/mL、10 ug/mL的細胞生長曲線

圖3 Saos細胞系在37 ℃培養(yǎng)HSP 70表達

圖4 Saos細胞系在43 ℃培養(yǎng)HSP 70表達

圖5 Saos-2/MTX4.4細胞系在37 ℃培養(yǎng)HSP 70表達

圖6 Saos-2/MTX4.4細胞系在43 ℃培養(yǎng)HSP 70表達

3 討論

熱療方法在多種腫瘤治療中經(jīng)過了驗證，獲得了客觀的療效?？偨Y熱療的作用機制:腫瘤內部血流速度變慢、血流量減低。在進行加熱后，腫瘤組織的溫度明顯升高，同時正常組織變化不明顯，可在不損傷正常組織細胞的前提下抑制腫瘤細胞[1];高熱量使腫瘤組織熱量聚集、pH降低，直接損傷腫瘤細胞;高溫同時干擾腫瘤細胞中DNA,RNA及蛋白質的合成;高溫可改變細胞結構，不可逆地破壞腫瘤細胞的細胞器;溫度影響腫瘤細胞的生物膜，改變膜通透性[2];高溫提高機體免疫系統(tǒng)活性[3]；熱化療作用機制為高溫加速腫瘤組織附近血液循環(huán)，滲透性升高使得化療藥物更容易進入細胞[4]。

骨肉瘤的熱療也經(jīng)過了探索，從開始時間的化療藥物熱灌注治療，獲得了局部療效較好，全身毒性較少的臨床療效[5]。但是也出現(xiàn)局部操作復雜，藥物容易外滲等不良因素，使該方法沒有進一步廣泛應用。還有醫(yī)生在腫瘤外科手術時使用局部熱療，提高局部控制率并且使用腫瘤骨作支撐架，提高了患者手術后的生活質量[6]。臨床上外科技術和化療的應用已經(jīng)使患者有較好的預后，但是，改變復發(fā)患者或耐藥患者的預后稱為臨床治療的難點。我們實驗探索不同溫度下原代細胞系和耐藥細胞系在單純熱療情況下的差別，實驗得出42 ℃、43 ℃、44 ℃熱療后腫瘤細胞生存率有下降，證明熱療能提高治療骨肉瘤細胞系的效果。但是，原代細胞系和耐藥細胞系熱療效果并沒有差別?？赡茉蚴悄退幖毎的退幵蚝蜔岑熥饔脵C制不同。我們實驗還探索了在43 ℃熱作用下常用化療藥物MTX、ADM藥物在不同濃度下生存的影響，實驗結果，熱化療能提高熱療的效果，效果和藥物濃度有梯度依賴性。但是，兩種藥物沒有效果的差異。耐藥細胞系和原代細胞系的熱化療效果沒有差異。熱休克蛋白是生物受到環(huán)境中物理、化學、生物、精神等刺激時發(fā)生應激反應而合成的蛋白質,加熱可以提高熱休克蛋白的表達[7]。我們的實驗通過免疫組化方法檢測熱療對細胞系HSP 70表達的影響發(fā)現(xiàn)兩種細胞系受熱后HSP 70表達均增加，可能是HSP 70表達與應激反應有關，與上述實驗中表達結果一致[7]。但是，熱療后耐藥細胞系和原代細胞系HSP 70表達沒有差別。這樣可能揭示了耐藥的原因和熱療的作用途徑不同。

我們的實驗結論：體外實驗熱療對骨肉瘤細胞系可以降低細胞生存率；熱療對耐藥細胞系和原代細胞系都具有效果，熱化療能降低細胞生存率，對原代細胞系和耐藥細胞系生存率下降沒有差別；熱療使HSP 70表達升高，在原代細胞系和耐藥細胞系變化未見明顯差別。

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[責任編輯 段金卯]

Effect of hyperthermia on primary osteosarcoma cell lines and drug-resistant cell lines.

1.Journal Editorial Department of Henan University, Kaifeng 475000, China； 2. Oncology Department of Huaihe Hospital, Henan University, Kaifeng 475000, China

〔Objective〕The antiosteosarcoma effects of hyperthermia were explored on primary osteosarcoma cell lines and drugresistant cell lines.〔Methods〕Using different temperatures and different concentrations of methotrexate (1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL) and doxorubicin (1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL),the survival rate of primary cell lines and drug-resistant cell lines HSP70 were determined by MTT assay.〔Results〕The cell survival rate of primary cell line and drug resistant cell line was decreased after thermal therapy. The expression of HSP70 was increased in primary osteosarcoma cell line and drug resistant cell line under hyperthermia.〔Conclusion〕Hyperthermia is an effective strategy to treat the resistance of osteosarcoma cell lines.

osteosarcoma; hyperthermia; drug resistance

1672-7606(2016)04-0236-04

2016-10-17

河南省科技攻關項目(162102310394)

李武營(1962-)，河南開封人，副教授，從事藥理學研究及教學工作。

王建軍(1968-)，河南開封人，副教授，從事臨床腫瘤學研究及教學工作。

R738.1

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