馬蘭馬駿　李茂星　段海婧　王涇舟　蔡香菊

【摘 要】 目的：以聚酰胺色譜柱分離天藍(lán)苜蓿中黃酮組分，研究其清除DPPH自由基的能力。方法：采用多功能動態(tài)熱回流提取濃縮機(jī)組提取天藍(lán)苜蓿乙醇提取物，通過聚酰胺色譜柱吸附黃酮成分，不同濃度乙醇洗脫后，干燥得不同濃度乙醇洗脫物；采用DPPH自由基清除法，比較天藍(lán)苜蓿不同洗脫液中黃酮組分的抗氧化能力。結(jié)果：天藍(lán)苜蓿黃酮以三氯化鋁顯色后于紫外423nm有最大吸收；聚酰胺色譜柱上樣洗脫，上樣速度：12mL/min，洗脫速度：18mL/min；不同溶劑洗脫物清除DPPH自由基能力為：30%乙醇洗脫物>60%乙醇洗脫物>90%乙醇洗脫物>水洗脫物。結(jié)論：聚酰胺色譜柱能夠富集分離天藍(lán)苜蓿黃酮組分，且30%乙醇洗脫物清除DPPH自由基能力最強。

【關(guān)鍵詞】 天藍(lán)苜蓿；聚酰胺色譜柱；黃酮；DPPH自由基

【中圖分類號】R914 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）23-0029-04

天藍(lán)苜蓿（Medicago lupulina L）為豆科苜蓿屬（Medicago）植物的莖葉或地上部分，廣泛分布于東北、華北、西北、華中和西南各地；夏、秋采收，洗凈曬干備用。其味甘、微澀、性平；具有清熱利濕，涼血止血，舒經(jīng)活絡(luò)功效；主治黃疸型肝炎[1]。常見的苜蓿有紫花苜蓿、天藍(lán)苜蓿、南方苜蓿。研究表明，紫花苜蓿主要含有黃酮類、多糖類、香豆素類等化合物；具有抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、降血脂等作用[2-4]，但對同科植物天藍(lán)苜蓿的藥理作用研究未見報道。實驗以聚酰胺色譜柱分離天藍(lán)苜蓿中黃酮組分，研究其清除DPPH自由基能力。

1 儀器與材料

11 儀器 6GU -50k多功能動態(tài)熱回流提取濃縮機(jī)組（上海矩源機(jī)械設(shè)備有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；HH-S26S恒溫水浴鍋（金壇大地自動儀器廠）；HP-8453紫外分光光度計（美國惠普公司）；LyoQuest-55plus冷凍干燥（西班牙Telster）；BPZ6033LC真空干燥箱（上海-恒科技有限公司）；YC1800噴霧干燥（上海雅程儀器設(shè)備有限公司）；BP2010S電子天平（德國Sartorius公司）；SpectraMax i3 全自動熒光酶標(biāo)儀（美國Molecular公司）。

12 材料 天藍(lán)苜蓿于2015年7月采自甘肅省平?jīng)鍪嗅轻紖^(qū)，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室楊扶德教授鑒定為豆科苜蓿屬天藍(lán)苜蓿（Medicago lupulina L）地上部分。聚酰胺（20～40目，批號：20111228，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；95%乙醇（批號：20150424，甘肅潤康藥業(yè)有限公司制造）；無水甲醇（批號：20141127，利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司）；三氯化鋁（批號：HG3-927-76，天津市化學(xué)試劑廠）；蘆丁對照品（批號：100080-20070，中國藥品生物制品檢定所）；DPPH試劑2，2-二苯基苦味?；诫禄杂苫?，（Sigma-Ald rich公司，批號：D9132-1G）；維生素C（Sigma-Ald rich公司，批號：A92902-25G）；二甲基亞砜（批號：100208，科昊生物工程有限責(zé)任公司）。

2 方法

21 天藍(lán)苜蓿乙醇提取物的制備 稱取1500 g天藍(lán)苜蓿裝入多功能動態(tài)熱回流提取濃縮機(jī)組的提取罐中，加5倍70%乙醇浸泡05h，以10、10、8倍70%乙醇70℃回流提取三次，每次1h，合并三次回流提取液，減壓回收乙醇得濃浸膏，60℃真空干燥得天藍(lán)苜蓿乙醇提取物，得率為326%，即每克干浸膏相當(dāng)于307g生藥材。

22 聚酰胺色譜柱分離天藍(lán)苜蓿黃酮組分

221 聚酰胺吸附劑的預(yù)處理 20～40目篩選聚酰胺吸附劑顆粒1000g，用95%乙醇浸潤及浸泡過夜（≥12h），然后用大量蒸餾水洗去乙醇，裝入玻璃層析柱，用蒸餾水沖洗密集后進(jìn)行上樣。

222 聚酰胺色譜柱的動態(tài)吸附及解吸 取適量天藍(lán)苜蓿乙醇提取物，加蒸餾水溶解成01g/mL天藍(lán)苜蓿提取物上樣母液。上樣速度：12mL/min，每收集200mL為1份，取流出液用紫外分光光度計進(jìn)行掃描，測263nm波長處紫外吸光度值（A）。流出液與上樣母液圖譜相似時即為飽和，停止上樣。相繼用蒸餾水、30%、60%和90%乙醇進(jìn)行洗脫（洗脫速度：18mL/min，同上，用紫外分光光度計進(jìn)行掃描，在263、364nm波長處紫外吸光度值（A），洗脫曲線近似平直時為終點。以紫外吸光度值（A）和洗脫液體積，制作吸附曲線與洗脫曲線。

223 不同乙醇濃度天藍(lán)苜蓿黃酮組分制備 將222所述方法得到的水洗脫液進(jìn)行噴霧干燥（風(fēng)速：25m/s，進(jìn)樣速度15mL/min），減壓回收30%、60%、90%洗脫液，濃縮至一定體積，冷凍干燥。得水洗脫物、30%、60%、90%乙醇洗脫物，得率分別是55%、787%、762%、1362%（55g、787g、762g、1365g）。

23 天藍(lán)苜蓿乙醇提取物黃酮組分含量測定

231 供試品溶液的制備 精密稱取“223”方法中制備的洗脫物各01g，用70%乙醇配置為1mg/mL供試品溶液。

232 對照品溶液的制備 精密稱取減壓干燥至恒重的蘆丁對照品01g置于100mL容量瓶中，加70%乙醇溶液至刻度，超聲溶解，定容。即為1mg/mL蘆丁對照品溶液。

233 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將1mg/mL蘆丁標(biāo)對照品溶液，準(zhǔn)確吸取05、10、15、20、25mL分別置于10mL容量瓶中，分別加入2mL 01mol/L三氯化鋁甲醇溶液，加蒸餾水搖勻，定容。以相應(yīng)溶液為空白，于423nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)對蘆丁濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：Y=0341X±00327（R2=09994）即在003707～016561mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

234 精密度實驗 精密吸取蘆丁對照品溶液1mL，置于10mL容量瓶中，按233中方法測定其吸光度，重復(fù)測6次，RSD=024%，表明此方法精密度良好。

235 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液（70%乙醇提取物溶液），按“233”中的方法，分別0、10、20、30、40、50、60min測定吸光度，RSD=043%，表明供試品溶液在60min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

236 重復(fù)性實驗 精密稱取6份天藍(lán)苜蓿70%乙醇提取物01g，按231項制備供試品溶液然后各精密吸取1mL，分別置于10mL容量瓶中，分別加入2mL 01mol/L三氯化鋁甲醇溶液，加蒸餾水搖勻，定容。按“233”項下方法于423nm處測定其吸光度，計算得RSD=033%，表明此方法重復(fù)性良好。

237 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的70%乙醇提取物005g共6份，置于10mL容量瓶中，加入一定量的蘆丁對照品，加70%乙醇溶液至刻度，超聲溶解，定容。按“233”項測定其吸光度，6次測定平均回收率為9705%，RSD為112%。結(jié)果見表1。

238 測定 精密吸取天藍(lán)苜蓿70%乙醇提取物、30%、60%、90%乙醇洗脫物，水洗脫物供試品溶液各25mL至10mL容量瓶中，分別加入2mL 01mol/L三氯化鋁甲醇溶液，加蒸餾水定容。在423nm波長處測定吸光值。樣品中的黃酮含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)值，天藍(lán)苜蓿中的黃酮含量以蘆丁對照品相對含量表示。

24 清除DPPH自由基自由基活性的測定方法

241 DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 稱取2mgDPPH自由基放置于50mL棕色容量瓶中，加無水乙醇溶解，定容。即004mg/mL DPPH自由基[5-6]。

242 DPPH自由基測定波長的選擇 取2700μL 004mg/mL DPPH自由基與300μL的DMSO（二甲基亞砜）混合，在紫外分光光度計200～700nm范圍掃描，最終DPPH自由基在520nm處有最大吸收。

243 供試樣品清除自由基活性的測定 精準(zhǔn)稱取不同提取物（70%乙醇提取物、水洗脫物、30%、60%、90%乙醇洗脫物）及陽性對照品維生素C（Vc）2mg，用200μL DMSO溶劑溶解后，再加1800μL無水乙醇稀釋，定容，制成了1mg/mL供試樣品溶液。將所有供試樣品溶液和陽性對照品依次稀釋100、050、025、0125、00625、003125、001565mg/mL的溶液。在96孔板每行放置同一樣品不同濃度各100μL，再加100μL DPPH配置溶液?？瞻捉M中加100μL乙醇溶液和100μL DPPH配置溶液（避光操作），在37℃避光保溫箱中放置反應(yīng)05h后于酶標(biāo)儀520nm處測出紫外吸光值A(chǔ)，以Vc為陽性對照，按公式計算出供式樣品對DPPH自由基的清除率：DPPH清除率（%）=A1-（A2-A3）A1×100%（A1為空白組的吸光度，A2為樣品組的光度，A3為樣品組在未加入DPPH試劑前的吸光度。）用各供試品不同濃度的清除率繪制曲線，通過SPPS190軟件處理得樣品DPPH自由基的清除活性的IC50。

3 結(jié)果

31 聚酰胺色譜柱的動態(tài)吸附及解吸結(jié)果 天藍(lán)苜蓿上樣曲線，洗脫曲線如圖1、2所示。由圖1可知，從第3流份開始，流出液與母液峰形狀相似，到第6流份流出液與母液圖譜重合，此時母液上樣體積約為1000mL，上樣達(dá)到飽和。圖2為蒸餾水洗脫完畢后，由30%、60%、90%依次進(jìn)行洗脫時的曲線。30%洗脫后從第2份開始洗脫曲線在364nm有吸收，第15份吸收值最大，組分大部分被洗出，第25份時，吸收值與未洗脫前吸收值相似，即組分30%乙醇部位基本洗脫完全。繼續(xù)用60%乙醇洗脫，第32、第45份時，吸收值最大及60%乙醇部位基本洗脫完全。繼續(xù)用90%乙醇洗脫，第48、第65份時吸收值最大及90%乙醇部位基本洗脫完全。水洗脫液、30%、60%、90%乙醇洗脫液總量分別是5830mL、5000mL、3300mL、5000mL。

32 測定波長的選擇 樣品中黃酮含量的經(jīng)典測定方法有亞硝酸鈉-硝酸鋁，酸水解后二氯氧鋯，三氯化鋁等顯色法。在測定天藍(lán)苜蓿中的黃酮組分時，最終以三氯化鋁顯色后進(jìn)行紫外掃描，與標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁在400～430nm處波形相似。在423nm處有最大吸收，故選423nm為最大吸收測定波長。如圖3所示，天藍(lán)苜蓿不同濃度乙醇中黃酮組分紫外掃描圖。

33 天藍(lán)苜蓿不同濃度乙醇中黃酮含量的測定結(jié)果 由表2可知，100g天藍(lán)苜蓿70%乙醇提取物經(jīng)過聚酰胺色譜柱富集分離后，每克30%、60%、90%乙醇洗脫物是70%乙醇提取物中黃酮的314、154、391倍，回收總黃酮907%。

34 供試樣品清除自由基活性的測定結(jié)果 由圖4、表3可知，幾種供試樣品對DPPH自由基的清除活性的IC50大到小的順序為Vc<30%乙醇洗脫物<60%乙醇洗脫物<90%乙醇洗脫物<70%乙醇提取物<水洗脫物。即從聚酰胺色譜柱富集分離的不同天藍(lán)苜蓿黃酮組分均具有清除DPPH自由基的能力且效果較好，也可以得出清除DPPH自由基能力為30%乙醇洗脫物>60%乙醇洗脫物>90%乙醇洗脫物>70%乙醇提取物>水洗脫物。

4 討論

實驗由于制備量較大，則應(yīng)用多功能動態(tài)熱回流提取濃縮機(jī)組提取設(shè)備，經(jīng)過聚酰胺色譜柱富集分離后，根據(jù)洗脫量和減少有效成分的損失選用冷凍干燥機(jī)、真空干燥箱、干燥噴霧器等不同的干燥設(shè)備干燥。聚酰胺色譜柱分離天藍(lán)苜蓿黃酮組分不僅方法簡單，成本低，效率高，穩(wěn)定性好且容易再生。聚酰胺色譜柱分離天藍(lán)苜蓿黃酮組分時，上樣，洗脫時全程有紫外-可見分光光度進(jìn)行全程監(jiān)測，保證了上樣準(zhǔn)確，洗脫完全。天藍(lán)苜蓿經(jīng)過聚酰胺分離后，每克30%、60%、90%乙醇洗脫物是70%乙醇提取物黃酮的314、154、319倍。

考察天藍(lán)苜蓿黃酮組分顯色檢測方法時，用亞硝酸鈉-硝酸鋁，酸水解后二氯氧鋯等顯色后進(jìn)行紫外-可見分光光度計于300～900nm處掃描都未能找到與標(biāo)準(zhǔn)品相似的的峰型。最終用三氯化鋁顯色后，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在300～900nm掃描后有相似的峰，且在423nm處有最大吸收，即本實驗選擇三氯化鋁比色法作為天藍(lán)苜蓿中黃酮組分含量測定的方法。

清除DPPH自由基實驗表明天藍(lán)苜蓿黃酮組分具有一定抗氧化作用，且經(jīng)過聚酰胺色譜柱分離后，清除DPPH自由基的能力增強，且清除能力為30%乙醇洗脫物>60%乙醇洗脫物>90%乙醇洗脫物>70%乙醇提取物>水洗脫物，但都小于陽性對照品Vc。從清除DPPH自由基的活性IC50可得出30%乙醇洗脫物是60%乙醇洗脫物的23倍，90%乙醇洗脫物的28倍，由此可得出天藍(lán)苜蓿中的各黃酮組分都具有清除自由基的作用，清除能力與黃酮含量有一定關(guān)系但從實驗數(shù)據(jù)得出與黃酮種類的關(guān)系更密切。由本實驗得30%乙醇洗脫物清除DPPH自由基能力最強。

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（編輯：梁志慶）